Cistanche melhora a infecção renal devido ao lúpus eritematoso sistêmico

CD4 reativo ao antígeno nuclear^maisas células se expandem no lúpus eritematoso sistêmico ativo, produzem citocinas efetoras e infectam os rins

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Dimas Abdirama, Sebastian Tesch e etc

Sistêmicolúpuseritematosoé uma doença autoimune sistêmica e crônica caracterizada por uma perda de tolerância a antígenos nucleares com CD4 autorreativo^maisCélulas T implicadas na patogênese da doença. No entanto, muito pouco se sabe sobre sua especificidade de receptor desde a detecção de CD4 específico de autoantígeno humano^maiscélulas T tem sido extremamente desafiador. Aqui apresentamos uma análise de CD4^mais Células T reativas a antígenos nucleares usando dois métodos complementares: bibliotecas de células T e enriquecimento de células T reativas a antígeno. As frequências de CD4 específico do antígeno nuclear^mais As células T correlacionaram-se com a gravidade da doença. Essas células T autorreativas produzem citocinas efetoras, como interferon-g, interleucina-17 e interleucina-10. Comparadas ao sangue, essas células foram enriquecidas na urina de pacientes com nefrite lúpica ativa, sugerindo uma infiltração dorins. Assim, essas características não reconhecidas anteriormente suportam um papel para A CD4 específico do antígeno nuclear^maiscélulas T emsistêmicolúpuseritematoso.

Copyright ª 2020, Sociedade Internacional de Nefrologia. Publicado por Elsevier Inc. Este é um artigo de acesso aberto sob a licença CC BY-NC-ND

PALAVRAS-CHAVE: lúpuseritematoso, renal,

Sistêmicolúpuseritematosoé uma doença autoimune sistêmica e crônica caracterizada pela perda de tolerância a antígenos nucleares devido ao descarte defeituoso de resíduos biológicos, como material apoptótico contendo ribonucleoproteínas e nucleossomos.1 Autoanticorpo dirigido contra antígenos nucleares é característico desistêmicolúpuseritematosoe geralmente ocorre antes da doença evidente. Além disso, CD4 autorreativo^maisAs células T estão envolvidas na patogênese dasistêmicolúpuseritematosopromovendo a produção de autoanticorpos pelas células B e propagando diretamente os danos nos órgãos-alvo infectados. Embora a detecção de células T reativas ao antígeno nuclear tenha sido relatada anteriormente, a evidência de sua existência permanece circunferencial até agora e atualmente não está claro como elas interagem na patogênese. Compreender como essas células participam da autoimunidade será fundamental para o desenho de um tratamento eficaz.

A detecção de células T autoantígeno-específicas é dificultada por suas frequências extraordinariamente baixas no sangue circulante. Estudos anteriores de CD4 humano naive^maisOs repertórios de células T usaram tecnologia baseada em tetrâmeros para fornecer informações precisas sobre as respostas de células T a epítopos de antígenos específicos; no entanto, este método requer conhecimento prévio dos tipos de antígenos leucocitários humanos do doador. Técnicas alternativas para detectar e enumerar simultaneamente populações de células T raras com reatividade a diferentes antígenos sem conhecimento prévio dos tipos de antígenos de leucócitos humanos foram desenvolvidas usando bibliotecas de células T policlonais amplificadas e pelo enriquecimento de células T que expressam CD154- após estimulação com um antígeno denominado ARTE (enriquecimento de células T reativas ao antígeno).

Sistêmicolúpuseritematosoé prejudicial pararins, mas o cistanche pode melhorarrimfunções.

CD4^mais As células T exercem sua função principalmente por meio da secreção de citocinas na ativação antigênica16 e pela propagação da inflamação tecidual, como emlúpusnefriteque representa uma das complicações mais graves dasistêmicolúpuseritematoso. Análise do repertório de células T presentes emrimbiópsias de pacientes comlúpusnefriterevelou oligoclonalidade derim-infiltrando CD4^mais Células T, indicando acúmulo de células T antígeno-específicas emrins. Nosso estudo anterior revelou células T urinárias em pacientes comlúpus nefritecomo um biomarcador preciso que se assemelha ao fenótipo das células intrarrenais. Embora essas células sejam enriquecidas para o receptor 3 de quimiocinas CXC e o receptor 5 de quimiocinas CC que expressam células T indicativas de uma população de células T helper 1 (Th1) e contêm CD154^maisCélulas T sugestivas de encontro recente de antígeno, sua especificidade de antígeno em relação a antígenos nucleares permanece incerta.

Neste estudo, apresentamos uma análise de CD4^mais Células T reativas a antígenos nucleares em um total de 17 indivíduos saudáveis, 12 indivíduos comsistêmicolúpuseritematoso, e 20 sujeitos comsistêmicolúpuseritematosousando bibliotecas de células T e técnicas ARTE para analisar as frequências de CD4 autorreativo^mais células T no sangue periférico e na urina de pacientes comlúpusnefritebem como a produção de citocinas.

RESULTADOS

CD4 reativo ao antígeno nuclear^maisAs células T são lúpus eritematoso sistêmico inativo expandido conforme determinado usando a biblioteca de células T e ARTE

com ativosistêmicolúpuseritematoso. Essas células também foram detectáveis ​​em 5 de 6 pacientes comsistêmicolúpuseritematoso, enquanto apenas 3 de 6 controles saudáveis ​​apresentaramautorreativoT células. Curiosamente, pacientes comsistêmicolúpuseritematosotambém mostraram uma variedade mais ampla de respostas de células T autorreativas, com cada paciente tendo células T reativas contra pelo menos 3 antígenos nucleares. Em comparação, o portfólio alvo foi menos variável em pacientes comsistêmicolúpuseritematosoe controles saudáveis. Em conjunto, as células T reativas ao antígeno nuclear circulante não são exclusivas parasistêmicolúpuseritematoso, ainda inativosistêmicolúpuseritematoso, seu número é maior e suas estruturas de destino são mais variáveis.

Como as células T autorreativas desempenham um papel na propagação de respostas autoimunes, comparamos o número de células T autorreativas com a gravidade da doença, avaliada pelasistêmicolúpuseritematosoíndice de atividade da doença (sistêmicolúpuseritematosopontuação do DAI). Apenas as frequências de CD4^maisAs células T reativas a RNP70, Ro e La correlacionaram-se positivamente comsistêmicolúpuseritematosoDAI (RNP70: P ¼ 0.04, r ¼ 0,4865; Ro: P ¼ 0.005) , r=0,6299; La: P=0,01, r=0,5651) (Figura 1d). Em contraste, a frequência de células T reativas à transtirretina foi encontrada em um nível bastante semelhante em todos os 3 grupos (Figura 1e), descartando assim um possível viés experimental devido à hiperreatividade geral de células T não específicas do antígeno inativasistêmicolúpuseritematoso.

As bibliotecas de células T oferecem uma série de vantagens, incluindo alta sensibilidade para detectar células muito raras em um número baixo de células de entrada. No entanto, esta técnica depende da expansão das células, o que pode alterar a composição celular e fornece apenas uma possibilidade limitada de caracterizar fenotipicamente as células reativas. Portanto, validamos nossas observações com o método ARTE. O protocolo ARTE requer maiores quantidades de células de entrada, o que é especialmente desafiador em pacientes comsistêmicolúpuseritematosoque frequentemente se apresentam com linfopenia e anemia. Devido a essa limitação e também para aumentar a leitura esperada de células reativas, reunimos todos os 5 antígenos nucleares canônicos e usamos esse conjunto para estimular células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) antes do enriquecimento de células que expressam CD154-(n ¼ 15 pacientes comsistêmicolúpuseritematoso; n=6 controles saudáveis). Usando uma combinação dos marcadores de superfície CD154 e CD69, as células T reativas asistêmicolúpuseritematoso-antígenos nucleares associados podem ser identificados dentro de uma população de fundo (Figura 1f). Embora a expressão de fundo de CD154 e CD69 tenha sido abundantemente observada em todos os indivíduos, pacientes comsistêmicolúpuseritematosoapresentaram frequências significativamente aumentadas de células T CD154 mais CD69 mais quando estimuladas com antígenos nucleares em comparação com a estimulação de fundo (P ¼ 0.008), enquanto indivíduos saudáveis ​​e pacientes com inatividadesistêmicolúpuseritematosoapresentaram frequências semelhantes entre células estimuladas por antígeno e não estimuladas (indivíduos saudáveis: P ¼ 0,44; pacientes comsistêmicolúpuseritematoso: P ¼ {{0}},56) (Figura 1g). Além disso, subtraindo as frequências de fundo, as frequências de células T reativas ao antígeno nuclear foram maiores em pacientes com doença ativa do que em indivíduos saudáveis ​​e pacientes com doença inativa (P ¼ 0.02 e P ¼ 0.11, respectivamente) (Figura 1h). A frequência de células T reativas ao antígeno nuclear subtraído de fundo correlacionou-se positivamente com a atividade da doença (P=0,004, r=0,5978), sugerindo seu papel potencial nasistêmicolúpuseritematoso.

As bibliotecas de células T oferecem uma série de vantagens, incluindo alta sensibilidade para detectar células muito raras em um número baixo de células de entrada. No entanto, esta técnica depende da expansão das células, o que pode alterar a composição celular e fornece apenas uma possibilidade limitada de caracterizar fenotipicamente as células reativas. Portanto, validamos nossas observações com o método ARTE. O protocolo ARTE requer maiores quantidades de células de entrada, o que é especialmente desafiador em pacientes comlúpuseritematosoque frequentemente se apresentam com linfopenia e anemia. Devido a essa limitação e também para aumentar a leitura esperada de células reativas, reunimos todos os 5 antígenos nucleares canônicos e usamos esse conjunto para estimular células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) antes do enriquecimento de células que expressam CD154-(n ¼ 15 pacientes comsistêmicolúpuseritematoso; n=6 controles saudáveis). Usando uma combinação dos marcadores de superfície CD154 e CD69, as células T reativas asistêmicolúpuseritematoso-antígenos nucleares associados podem ser identificados dentro de uma população de fundo (Figura 1f). Embora a expressão de fundo de CD154 e CD69 tenha sido abundantemente observada em todos os indivíduos, pacientes comsistêmicolúpuseritematosotinham frequências significativamente aumentadas de CD154^maisCD69^maisCélulas T quando estimuladas com antígenos nucleares em comparação com a estimulação de fundo (P ¼ 0.008), enquanto indivíduos saudáveis ​​e pacientes com inatividadesistêmicolúpuseritematosoapresentaram frequências semelhantes entre células estimuladas por antígeno e não estimuladas (indivíduos saudáveis: P ¼ 0,44; pacientes comsistêmicolúpuseritematoso: P ¼ {{0}},56) (Figura 1g). Além disso, subtraindo as frequências de fundo, as frequências de células T reativas ao antígeno nuclear foram maiores em pacientes com doença ativa do que em indivíduos saudáveis ​​e pacientes com doença inativa (P ¼ 0.02 e P ¼ 0.11, respectivamente) (Figura 1h). A frequência de células T reativas ao antígeno nuclear subtraído de fundo correlacionou-se positivamente com a atividade da doença (P=0,004, r=0,5978), sugerindo seu papel potencial nasistêmicolúpuseritematosopatogênese (Figura 1i). Além disso, CD4^maisAs células T reativas a um antígeno de recall Candida albicans MP65 demonstraram frequências semelhantes entre os doadores (Figura 1j), excluindo a possibilidade de um viés geral para frequências mais altas de células T reativas ao antígeno em pacientes comsistêmicolúpuseritematoso.

Coletivamente, nossos dados gerados usando a biblioteca de células T e métodos ARTE mostram expansão de CD4 específico de autoantígeno^maiscélulas T em pacientes comsistêmicolúpuseritematoso. Ambas as técnicas são comparáveis, conforme indicado por valores de índice de estimulação mediana semelhantes entre respostas de células T estimuladas por antígeno e não estimuladas (biblioteca de células T de índice de estimulação mediana: 1,857; ARTE: 1,614; P ¼ 0,33), embora a técnica ARTE revelou frequências mais altas de CD4 reativo ao antígeno nuclear^mais células T do que a técnica de biblioteca de células T (Figura 1k).

Cistanchepode melhorar a infecção dorim.

Células T reativas ao antígeno nuclear em indivíduos saudáveis ​​são CD4 autorreativas genuínas^maiscélulas T

Tanto a biblioteca de células T quanto as técnicas ARTE demonstraram a detecção deautorreativoT célulasem indivíduos saudáveis, que representam uma possível origem para o desenvolvimento da autoimunidade humana. No entanto, seu número não foi significativamente diferente das frequências de fundo, deixando incerto se indivíduos saudáveis ​​realmente precisam circular CD4 reativo ao antígeno nuclear^maiscélulas T. Para desvendar a especificidade do antígeno de células T autorreativas em indivíduos saudáveis, geramos clones de células T únicas de CD154^maisCD69^maisCD4^maisPrecursores de células T isolados de indivíduos saudáveis ​​após estimulação de PBMCs com antígenos nucleares individuais e um antígeno de controle derivado de lisado de Aspergillus fumigatus. Um número considerável desistêmicolúpuseritematosoclones de células T específicos de autoantígenos associados responderam aos seus antígenos correspondentes após a reestimulação do antígeno, conforme destacado pela coexpressão de IFN-g com CD154 (número de clones específicos—Aspergillus fumigatus: 5 de 5; SmD1: 4 de 8; RNP70: 3 de 11; histona: 5 de 5; Ro: 4 de 9; La: 5 de 7) (Figura complementar S2A e B). Além disso, a resposta do antígeno (representativamente mostrada para SmD1) foi dose-dependente, enfatizando que as células T reativas ao antígeno nuclear em indivíduos saudáveis ​​são CD4 autorreativos de boa vida^maisCélulas T (Figura complementar S2C). Assim, confirmamos a existência de células T reativas ao antígeno nuclear em indivíduos saudáveis ​​dentro do sinal de fundo dos métodos de detecção aplicados.

Produção de citocinas de células T CD4 mais reativas ao antígeno nuclear

Em seguida, examinamos a produção de citocinas de CD4 reativo ao antígeno nuclear^maiscélulas T. Células que expressam CD154-foram coradas intracelularmente para citocinas efetoras, como IFN-g, interleucina (IL)-17, IL-4 e IL-10 após estimulação com um conjunto desistêmicolúpuseritematoso-antígenos nucleares associados (Figura 2a). Frequências de CD154 produtores de IFN-g–, IL-17– e IL-10–^maisCD4^maisAs células T foram significativamente aumentadas em pacientes comsistêmicolúpuseritematoso(todas as citocinas: P ¼ {{0}}}.004), enquanto a frequência de células T autorreativas produtoras de IL-4 permaneceu indistinguível da frequência de fundo (P ¼ 0,125) (Figura 2b). Além disso, os números absolutos de células T autorreativas produtoras de IFN-g– e IL-10 foram maiores em pacientes comsistêmicolúpuseritematosodo que em indivíduos saudáveis ​​e pacientes comsistêmicolúpuseritematoso(Figura 2b). Ao subtrair as frequências de fundo, os pacientes comsistêmicolúpus eritematosoapresentaram frequências significativamente mais altas de células T auto-reativas produtoras de IFN-g– e IL-10 do que indivíduos saudáveis ​​(IFN-g: P ¼ 0.003; IL{{5} }: P ¼ 0,004), bem como de células T autorreativas produtoras de IFN-g–, IL-17– e IL-10 do que pacientes com inatividadesistêmicolúpuseritematoso(IFN-g: P ¼ 0.002; IL-17: P ¼ 0.00) 2; IL-10: P ¼ 0.005) (Figura 2c). Além disso, a frequência de IFN-g– e IL-10– mas não de IL-17– e IL-4–células T reativas ao antígeno nuclear produtoras de antígenos nucleares correlacionaram-se com a atividade da doença. No entanto, apenas a frequência de células produtoras de IL-4 mostrou menor correlação com a atividade da doença (IFN-g: P < 0.0001,="" r="" ¼="" 0,7574;="" il{{20}="" }:="" p="" ¼="" 0,005,="" r="" ¼="" 0,5889;="" il-4:="" p="" ¼="" 0,14,="" r="" ¼="" 0,3717;="" il-="" 10:="" p="" ¼="" 0,0004,="" r="" ¼="" 0,6977)="" (figura="" 2d).="" julgado="" pela="" frequência="" de="" produtores="" de="" ifn-g,="" cd4="" reativo="" ao="">^maisAs células T eram principalmente da linhagem Th1. Em contraste, os produtores de IL-17, bem como de IL-10, foram detectados apenas em frequências mais baixas.26 Em comparação com os níveis de autoanticorpos, as frequências de CD4 produtores de citocinas^maisAs células T não se correlacionaram com a concentração de anti-DNA de fita dupla e com o título sérico de anticorpos antinucleares (Figuras complementares S3A e B). Nenhuma outra correlação entre CD4 reativo ao antígeno nuclear^maisCélulas T e autoanticorpos foram observados, exceto para CD4 reativo a La^maisCélulas T para autoanticorpos La (Figura complementar S3C).

Detecção de células T CD4 mais reativas ao antígeno nuclear na urina de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico ativo e nefrite lúpica

Suspeita-se que a população de células Th1 reativas ao antígeno nuclear invada orimtecido, onde eles podem encontrar seu antígeno cognato quase onipresente. Ao investigar o repertório do receptor de células T (TCR)-b de CD4^maisCélulas T isoladas do sangue periférico comparadas com as isoladas da urina de 5 pacientes comsistêmicolúpuseritematosoe ativolúpusnefrite, observamos um repertório de TCR assimétrico oligoclonal de células derivadas de urina (Figura 3a). A frequência cumulativa dos 20 clones de células T mais abundantes foi significativamente maior na urina, correspondendo a um índice de diversidade mais baixo (Figura complementar S4A). Para testar se essas células também demonstram reatividade a um conjunto desistêmicolúpuseritematoso-antígenos nucleares associados, geramos bibliotecas que consistem em CD4 urinário^maisCélulas T isoladas de 3 pacientes comsistêmicolúpuseritematosoe ativolúpusnefrite(Figura complementar S4B). CD4 urinário^mais T cells were metabolically and functionally active cells indicated by the ability to proliferate upon stimulation with SEB but with signs of exhaustion shown by a reduced proliferation capacity after polyclonal activation (Supplementary Figure S4C and D). Because of these circumstances, only microcultures with a SEB stimulation index of >4 foram incluídos para a enumeração de CD4 urinário^maisCélulas T específicas para o antígeno nuclear individual. Em paralelo ao CD4 urinário^maiscélulas T, a frequência de CD4 reativo ao antígeno nuclear^maisAs células T no sangue periférico foram determinadas, permitindo uma comparação direta das respectivas frequências dentro dos mesmos indivíduos (Figura 3b). Descobrimos que inativolúpusnefrite, as frequências de CD4 reativo ao antígeno nuclear urinário^maisAs células T foram maiores que as do sangue periférico. Para confirmar essa observação, marcamos células urinárias isoladas de 4lúpusnefritedoadores com éster de succinimidil de carboxifluoresceína e misturou as células marcadas com PBMCs compatíveis com doadores para permitir uma comparação direta de células reativas ao antígeno em 1 ensaio usando a técnica ARTE. A frequência de CD154^maisCD69^maisCélulas T em amostras estimuladas e não estimuladas de células do sangue periférico e urinário compatíveis com doadores foram usadas para avaliar se as células T reativas ao antígeno nuclear são enriquecidas na urina como um proxy para orimcalculando o índice de estimulação (Figura 3c). Embora a biblioteca de células T urinárias e os métodos ARTE difiram em seu índice de estimulação mediana para os antígenos nucleares (índice de estimulação - biblioteca de células T urinárias: 17; ARTE: 2,79; P ¼ 0,4) (Figura 3d) , análise da autorreatividade em CD4 periférico e urinário^mais As células T de ambos os métodos (no total n=7) demonstraram um índice de estimulação específico do antígeno nuclear aumentado na urina (P=0,0156) (Figura 3e). Essas observações sugerem que o CD4 reativo ao antígeno nuclear^maisAs células T invadem e se acumulam noinfetadorins. Assim, a inflamação tecidual local emsistêmicolúpuseritematosopode ser um fenômeno antígeno-específico e modulado diretamente pela infiltraçãoautorreativoT células.

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