HRMs uplc-q-orbitrap combinados com encaixe molecular para investigar a base material de sabor amargo e relacionamento de efeito de sabor no deserto da cistanchia ⅱ
Dec 18, 2024
2 métodos e resultados
2.1 Identificação de substâncias deserticola de Cistanche
2.1.1 UPLC-Q-Orbitrap HRMS Condições de detecção Condições cromatográficas:
Coluna Phenomenex Cinetex C18 (2,1 mm × 1 0 0 mm, 2,6 μm); Fase móvel A (fase aquosa, contendo ácido acético a 0,1%), B (isopropanol-actetonitrila 1: 1), eluição do gradiente (0-1 min, 1% b; 1-8 min, 1% -99}% b; {{}}} min, 99% b; 99% -1% b; 9. 1-12 min, 1% b); Taxa de fluxo 0,2 ml · min -1; temperatura da coluna 30 graus; Volume de injeção 2 μl.
Condições de espectrometria de massa: O espectrômetro de massa Orbitrap Exploris 120 foi usado para coletar dados de espectrometria de massa primária e secundária sob o controle do software (software Thermo Scientific Xcalibur, versão: 4.4). A tensão de pulverização foi de 3,8 kV (positiva) ou -3. 4 kV (negativa), a temperatura da fonte de íons foi de 320 graus, a taxa de fluxo de gás da bainha foi de 50 ARB, a taxa de fluxo de gás auxiliar foi de 15 ARB e a temperatura do tubo de transferência de íons foi de 320 graus. O modo de varredura era de varredura secundária dependente de dados completa (MS/DD-MS2), a resolução primária foi 60 000, a resolução secundária foi 15 000, o alcance da varredura de íons foi 20, 40, 40, 40, 40, 40 {17}}}} e o gradiente de energia de colisão foi 20, 40, 40, 40, 40, 40, 40, 40 {17}}}} e o gradiente de energia de colisão foi 20, 40, 40, 40, 40, 40, 40, 40 {17}}}} e o gradiente de energia de colisão foi 20, 40, 40, 40, 40, 40, 40, 40 {17}}}} e o gradiente de energia de Collision foi 20, 40, 40, 40, 40, 40, 40, 40, e o gradiente de energia de colisão foi 20, 40, 40, 40.
Materiais de Cistanche de alta qualidade com maiorequinacosídeo, verbascosídeo, tubulosídeo A, glicosídeo isoverbáceo
2.1.2 Preparação da solução de referência
Pesar com precisão quantidades apropriadas deequinacosídeo, verbascosídeo, tubulosídeo A, glicosídeo isoverbáceoSubstâncias de referência de Gennoside e geniposídeo adicionam 50% de metanol para fazer uma solução de referência mista com uma concentração de massa de 500 ng · ml -1, agite bem e obtenha.
2.1.3 Preparação da solução de teste
Pese 1. 0 g de pó de amostra (M1) coletado na primavera e 1. 0 g de pó de amostra (M5) coletado no outono, adicione a solução de extração (metanol-água 4: 1), impeça completamente, o ultrasonicate em 250 W e 35 kHz para 1 h em temperatura ambiente central e depois » r · min -1 por 10 min, e filtre para obter o extrato de álcool de Cistanche Deserticola.
2.1.4 Identificação de substâncias
Ao comparar os dados de informações de espectrometria de massa primária e secundária de cada amostra de Cistanche Deserticola e combinando com literatura relevante e materiais de referência, identificou -se que diferentes amostras de deserticola de cistanche contêm 69 componentes químicos em comum, consulte a Tabela 2 e o diagrama total de fluxo de íons de cistanche deserticola é mostrado na figura 2.
Tabela 2 Constituintes dos extratos de deserticola de Cistanche identificados com base em hrms uplc-q-orbitrap
| Não. | Composto | Fórmula molecular | Valor medido (m/z) | Erro (× 10⁻⁶) | Modo de íons | Íons fragmentos | Tipo |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0.02 | Isomenthone | C₁₀H₁₈O | 223.06 | -8.7 | [M + H]⁺ | 223.06, 207.02, 137.02 | Monoterpenóides |
| 0.57 | Uracil | C₄H₄N₂O₂ | 157.04 | 1.8 | [M + H]⁺ | 157.03, 59.02, 49.01 | Outro |
| 0.67 | Glucosamina | C₆h₁₃no₅ | 195.05 | 1.1 | [M + H]⁺ | 75.01, 195.05, 59.01 | Carboidratos |
| 0.68 | Galactosamina | C₆h₁₃no₅ | 181.07 | 1.1 | [M + H]⁺ | 181.07, 71.01, 89.02 | Carboidratos |
| 0.81 | Ácido caprylico | C₈H₁₆O₂ | 144.11 | 1.0 | [M + H]⁺ | 104.11, 103.08, 87.03 | Outro |
| 0.83 | L - ácido aspártico | C₄h₇no₄ | 132.03 | 0.7 | [M + H]⁺ | 132.03, 115.00, 71.01 | Aminoácidos |
| 0.97 | Acetato de etila | C₄H₈O₂ | 198.19 | 1.4 | [M + H]⁺ | 197.02, 54.02, 153.02 | Outro |
| 0.98 | Ácido málico | C₄H₆O₅ | 155.00 | 0.0 | [M + H]⁺ | 111.00, 49.00, 68.99 | Ácidos orgânicos |
| 0.99 | D - Galactose | C₆H₁₂O₆ | 180.16 | 1.1 | [M + H]⁺ | 179.06, 89.02, 59.01 | Carboidratos |
| 1.00 | L - Ácido glutâmico | C₅h₉no₄ | 188.09 | -0.4 | [M + H]⁺ | 118.09, 119.09, 72.08 | Aminoácidos |
| 1.01 | L - isoleucina | C₆h₁₃no₂ | 132.10 | -0.9 | [M + H]⁺ | 132.10, 86.03, 115.07 | Aminoácidos |
| 1.05 | Glicina | C₂h₅no₂ | 182.08 | -0.9 | [M + H]⁺ | 182.08, 95.04, 29.03 | Aminoácidos |
| 1.48 | Uridina | C₉H₁₂N₂O₆ | 243.06 | 0.3 | [M + H]⁺ | 243.06, 103.01, 102.10 | Nucleosídeos |
| 1.93 | Metil d - iodeto | C₂H₅I | 131.03 | 0.0 | [M + H]⁺ | 131.03, 59.00, 41.01 | Outro |
| 2.29 | Naringin | C₂₇H₃₂O₁₄ | 345.12 | 3.2 | [M + H]⁺ | 345.12, 327.11, 147.05 | Flavonóides |
| 3.29 | Ácido protocatechuico | C₇H₆O₄ | 153.02 | 1.1 | [M + H]⁺ | 153.02, 109.02, 41.00 | Ácidos fenólicos |
| 3.46 | Triacontanol | C₃₀H₆₂O | 445.10 | 2.7 | [M + H]⁺ | 445.10, 271.08, 101.00 | Alcanóis |
| 3.47 | Kaempferol - 3 - o - glucosídeo | C₂₁H₂₀O₁₁ | 373.11 | 2.3 | [M + H]⁺ | 123.01, 149.06, 167.07 | Flavonóides |
| 3.48 | Quercetina | C₁₅H₁₀O₇ | 109.03 | 0.6 | [M + H]⁺ | 109.03, 79.05, 77.03 | Flavonóides |
| 3.66 | Ácido clorogênico | C₁₆H₁₈O₉ | 375.09 | -0.7 | [M + H]⁺ | 375.11, 359.07, 309.03 | Ácidos fenólicos |
| 3.70 | Ácido cinâmico | C₉H₈O₂ | 347.13 | 4.1 | [M + H]⁺ | 347.13, 181.09, 113.07 | Ácidos fenólicos |
| 3.74 | 8 - epigallocatechin - 3 - Gallate | C₂₂H₁₈O₁₁ | 315.37 | 13.6 | [M + H]⁺ | 315.37, 136.05, 103.04 | Flavonóides |
| 3.76 | Limonene | C₁₀H₁₆ | 163.04 | 0.2 | [M + H]⁺ | 163.04, 93.07, 62.03 | Monoterpenóides |
| 3.77 | Hesperidina | C₂₈H₃₄O₁₅ | 299.11 | -1.9 | [M + H]⁺ | 299.11, 181.08, 101.04 | Flavonóides |
| 3.91 | Vanilina | C₈H₈O₃ | 307.81 | 3.8 | [M + H]⁺ | 307.83, 173.03, 149.02 | Ácidos fenólicos |
| 4.11 | Isoquercitrin | C₂₁H₂₀O₁₂ | 419.13 | 4.1 | [M + H]⁺ | 419.13, 149.02, 101.00 | Flavonóides |
| 4.21 | Isopropil metilfenidato | C₁₄h₂₁no₂ | 221.08 | -0.8 | [M + H]⁺ | 221.08, 205.09, 104.00 | Outro |
| 4.22 | Ácido sértico | C₉H₁₀O₅ | 785.25 | 1.4 | [M + H]⁺ | 785.25, 663.21, 661.19 | Ácidos fenólicos |
| 4.30 | Eugenol | C₁₀H₁₂O₂ | 179.04 | 0.2 | [M + H]⁺ | 179.04, 153.03, 113.03 | Ácidos fenólicos |
| 4.40 | Cafeína | C₈H₁₀N₄O₂ | 769.26 | 1.4 | [M + H]⁺ | 769.26, 629.24, 622.14 | Alcalóides |
| 4.43 | Chrysin | C₁₅H₁₀O₄ | 442.05 | 1.1 | [M + H]⁺ | 442.05, 173.03, 113.03 | Flavonóides |
2.2 Triagem de encaixe molecular de substâncias amargas em Cistanche Deserticola
2.2.1 Construção do banco de dados do ligante
De acordo com os componentes químicos de Cistanche Deserticola identificados em 2.1.4, suas estruturas SDF foram baixadas do banco de dados PubChem para estabelecer uma biblioteca de compostos de pequenas moléculas de ligante. Todas as pequenas moléculas do ligante foram otimizadas estruturalmente usando o programa de mecânica molecular.
2.2.2 Seleção de receptores amargos
O receptor de sabor amargo (TAS2R) é um membro da família GPCRS e medeia o processo de percepção do sabor amargo das células do paladar na língua. Existem 25 subtipos de receptores. Entre eles, TAS2R1, TAS2R7, TAS2R8 e TAS2R14 pode ser ativado por uma variedade de substâncias amargas e pertencer aos receptores de percepção amarga de amplo espectro [14-15]. Portanto, este estudo selecionou as proteínas Tas2R1, Tas2R7, Tas2R8 e Tas2R14 do sabor amargo para encaixar com os componentes químicos do deserticola de Cistanche, e a estrutura de cristal de proteína amarga foi obtida do banco de dados Alphafold.
2.2.3 Andulação molecular
O componente químico de Cistanche Deserticola identificado por HRMs UPLC-Q-Orbitrap foi usado como ligante, e os subtipos de receptores do sabor amargo TAS2R1, TAS2R7, TAS2R8 e TAS2R14 foram utilizados como receptores de proteína. O encaixe molecular foi realizado usando o software Autodock Vina. Quanto menor a pontuação de ancoragem, melhor a energia de ligação. A proteína receptora foi pré-processada usando ferramentas de dock automático (ADT), incluindo desidratação e hidrogenação. O ligante também foi processado usando ADT, incluindo hidrogenação, cálculo de carga, detecção e seleção de ligações rotativas. O local ativo do receptor foi determinado usando o ADT e a caixa de encaixe foi definida para garantir que o tamanho da caixa fosse suficiente para conter o local ativo. Após a conclusão do encaixe, o software de visualização Pymol foi usado para visualizar e analisar os resultados de ancoragem. Para reduzir os resultados falsos positivos do acoplamento molecular, este estudo usou a pontuação de acoplamento de quinino de ligante positivo amargo como critério de triagem e componentes químicos selecionados que se ligam bem a pelo menos dois receptores amargos como substâncias amargas do deserticola de cistanche. Como resultado, um total de 20 componentes químicos foram substâncias em potencial, incluindo 6 glicosídeos feniletanóides, 5 flavonóides, 3 ácidos fenólicos, 2 éter de ciclopentadieno terpenos, 2 alcaloides e 2 componentes, indica que os alcatrões feniletanóides e 2 componentes são os alcatrões feniletanóides. As pontuações de acoplamento são mostradas na Tabela 3.
Tabela 3 Pontuações de encaixe molecular de substâncias amargas apresentadoras de extratos de deserticola de cistanche com receptores de sabor amargo kcal · mol -1
| Não. | Substância amarga | Tas2r1 | Tas2r7 | Tas2r8 | TAS2R14 |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | Prunasin | -7.6 | -6.6 | -7.8 | -7.1 |
| 2 | Trifolirhizin | -8.8 | -7 | -8.7 | -8.5 |
| 3 | Ácido benzóico | -7.9 | -6.9 | -8.2 | -7.1 |
| 4 | Vitexin | -7.6 | -6.8 | -8.5 | -7.1 |
| 5 | Trifolina | -8.4 | -7.5 | -8.2 | -7.7 |
| 6 | Isoquercitrin | -9.2 | -7.5 | -8.1 | -7.8 |
| 7 | Isomenthone | -7.3 | -6.7 | -7.4 | -6.9 |
| 8 | Curcumina | -9.2 | -8.1 | -8.3 | -7.4 |
| 9 | Ácido desidrdroacético | -6.6 | -6 | -7.8 | -7.9 |
| 10 | Ginsenoside | -7.3 | -7.9 | -8.8 | -8.3 |
| 11 | Piperina | -8.8 | -7.9 | -7.9 | -7.9 |
| 12 | Epicatequina | -9.8 | -6.9 | -9.1 | -8.7 |
| 13 | Isoquercitrin (novamente) | -8.1 | -8 | -8.2 | -8 |
| 14 | Rhein | -8.7 | -7 | -8.9 | -8.5 |
| 15 | Ácido isosalicílico | -8.7 | -6.5 | -8.3 | -9.3 |
| 16 | Pinocembrina | -9.1 | -7.6 | -8.1 | -8.6 |
| 17 | Erocitrina | -7.9 | -7.6 | -8.2 | -8.4 |
| 18 | Genistina | -8.1 | -8.2 | -9.1 | -8.2 |
| 19 | Kaempferol | -8.4 | -8.1 | -9.1 | -8.4 |
| 20 | Isoquercitrin (terceira menção) | -8.2 | -8.4 | -7.9 | -8.7 |
2.3 Avaliação eletrônica de língua da amargura de Cistanche Deserticola
2.3.1 Aquisição de sinal
Consulte o método da literatura e otimize -o [16]. Os parâmetros são: Temperatura de coleta 25 graus, tempo de coleta de dados 120 s, período de coleta 1 s, velocidade de agitação 1 r · s -1, usando água ultrapadura como fluido de limpeza, antes de cada medição da amostra limpar o sensor por 10 segundos.
2.3.2 Determinação da amostra
Pese 1. 0 g de pó de amostra de deserticola de Cistanche, respectivamente, pese -o com precisão, adicione 80 ml de água, refluxo e extração por 1 h, deixe esfriar, centrífugo, filtrar, tomar 40 ml de filtrado, adicionar água destilada para fazer o volume a 100 ml. Coloque a amostra preparada em um copo padrão de 100 ml do instrumento e execute a medição. Repita a medição três vezes para cada amostra.
2.3.3 Resultados da avaliação de amargura usando a língua eletrônica
Após a inspeção metodológica, o desvio padrão relativo (RSD) da precisão, repetibilidade e {{0}}} experimentos de estabilidade foram de 1,7%, 3,6%e 1,4%, respectivamente, todos inferiores a 5,0%, indicando que esse método é viável. Os valores quantitativos de amargura de diferentes amostras de Cistanche Deserticola variaram de 8,856 a 27.32, como mostrado na Tabela 4, com diferenças significativas.
3 discussão
In this study, 69 chemical components were identified in Cistanche deserticola using UPLC-Q-Orbitrap HRMS technology, and 20 bitter substances that stimulate bitter taste receptors in Cistanche deserticola were screened out by combining molecular docking technology, including 6 phenylethanol glycosides, 5 flavonoids, 3 phenolic acids, 2 iridoids, 2 alkaloids and 2 Outros componentes, incluindo equinacósido, verbascosídeo, tubulosídeo A, isoverboscósido, geniposídeo, etc.; 9 lotes de amostras de deserticola de cistanche frescas da mesma origem em meses diferentes foram coletadas e divididas em meses diferentes e partes diferentes. O método da língua eletrônica foi utilizado para determinar o valor quantitativo da amargura das amostras, e a HPLC foi usada para determinar os 6 componentes farmacológicos em potencial (echinacosídeo, verbascosídeo, tubulosídeo) nas amostras. Foi usado conteúdo de A, iso-verbascídeo, jinsshicanósido, geniposídeo) e espectrofotometria visível por UV para determinar os glicosídeos feniletanóides totais, polissacarídeos totais, alcalóides totais, flavonóides totais e teor de ácido fenólico total nas amostras. Nesta base, combinada com análise quimométrica, análise de correlação de Pearson, análise de correlação cinza, OPLS-DA etc. foram usadas para encontrar os componentes amargos no deserticola de Cistanche. Os resultados da análise de correlação mostraram que o conteúdo de glicosídeos feniletanóides totais e flavonóides totais no deserticola de Cistanche estava positivamente correlacionado com o valor de resposta amarga, e o total de polissacarídeos de cistanche deserticola foram negativamente corrializados com o valor da resposta amarga. Entre eles, o conteúdo dos componentes do glicosídeo feniletanóide, echinacosídeo, verbascosídeo e jinshicanósido, foi significativamente correlacionado positivamente com o valor de resposta amarga, o que foi consistente com os resultados de acoplamento molecular, verificando a precisão dos resultados moleculares de encaixe. Os dois métodos se apoiaram e forneceram uma referência para a subsequente correção de desgosto e sabor de Cistanche Deserticola.
Através da previsão da farmacologia de rede, foram obtidos 245 alvos de substâncias amargas e os principais alvos foram EGFR, PIK3CB, PTK2, PIK3CD, PIK3R1, PTPN11, IK3CA, SRC, JAK2, PDGFRB, etc.; Os resultados da via do KEGG e do enriquecimento da função Go dos alvos de substância amarga mostraram que a resistência à insulina, o papel da via de sinalização PI3K-AKT nas complicações diabéticas e a via de sinalização da raiva da AGR em complicações diabéticas foram as principais vias dos alvos de substâncias amargas da cistanche deserticola. Um total de 267 funções GO foram obtidas para os alvos de substância amarga. Incluindo 123 processos biológicos, 75 funções moleculares e 69 componentes celulares; Ao executar a análise de Wayne nos alvos de substância amarga e os alvos da doença do efeito amargo de Cistanche deserticola, os resultados mostraram que 54,69%, 65,30%, 48,16%, 40,40%, 20,40%e 19,59%das metas de substância amarga podem ter efeitos imitórios da nebrosmana-diabética, afropatia, anti-osteoporose. Isso mostra que as substâncias amargas no deserticola de Cistanche têm uma certa base material para efeitos amargos.
Neste estudo, o extrato de Cistanche Deserticola foi usado como objeto de pesquisa, e as substâncias amargas no deserticola de Cistanche foram exibidas por rms UPLC-Q-Orbitrap e encaixe molecular; A HPLC foi usada para determinar o conteúdo dos principais componentes medicinais amargos, e a espectrofotometria visível por UV foi usada para determinar o conteúdo de cada categoria principal de substâncias amargas. A língua eletrônica foi usada para avaliar o grau de amargura, e os componentes amargos foram verificados pela quimiometrica. Os métodos modernos de pesquisa técnica foram totalmente utilizados para explorar as informações do sabor do deserticola de Cistanche e revelar sua base material amarga, que fornecerá uma referência para o subsequente correção de desgosto e sabor de Cistanche Deserticola. Através do estudo da farmacologia da rede, o mecanismo de ação de substâncias amargas no deserticola de Cistanche e sua relação com o alvo de eficácia amarga foram exploradas preliminarmente, o que fornecerá idéias e referências para o futuro estudo da relação "efeito do paladar" dos cinco sabores da medicina chinesa. No entanto, ainda existem algumas deficiências: esse experimento apenas selecionou plantas com boa qualidade na estação tradicional da colheita para medir o teor de substância amarga e a amargura de diferentes partes. Existe um certo grau de tamanho de amostra insuficiente e os resultados das diferenças na amargura de diferentes partes não têm certa confiabilidade. Está planejado usar amostras em larga escala para verificação e conduzir pesquisas mais sistemáticas no futuro; Acredita -se geralmente que os componentes de alcalóides sejam amargos, mas a análise de correlação desse experimento mostrou que os alcalóides e a amargura estão correlacionados negativamente, o que pode ser porque o componente alcalóide no deserticola de Cistanche é principalmente betaína, e o documento molecular mostra que se liga pouco aos destaques dos recursos amargos. Além disso, os resultados amargos rastreados pelo encaixe molecular carecem de dados específicos de verificação experimental de avaliação quantitativa de amargura, e os resultados da triagem podem ter falsos positivos, e são necessárias mais pesquisas e exploração do experimento.
