Cistanche Deserticola melhora a lesão celular nervosa do hipocampo em ratos da doença de Parkinson através da regulação da via antioxidante Keap1/Nrf2/Ho -1}

Resumo:

 

Objetivo de explorar o efeito deCistanche Deserticola sobre lesão celular nervosa na doença de Parkinson (DP)ratos e seu mecanismo relacionado. Métodos Os ratos machos Sprague-Dawley (SD) foram divididos aleatoriamente em três grupos (1 0 ratos em cada grupo): grupo controle, grupo modelo e grupo de cistanche. Os ratos no grupo modelo e o grupo de tratamento foram injetados intracranialmente com 6- hidroxitopamina (6- ohda). Os ratos no grupo de cistanche receberam 0,216g/ ml de solução de cistanche, ratos no grupo em branco e grupo modelo receberam irrigação salina normal, a quantidade de irrigação foi de 1 ml/ (100g · d) por duas semanas. A morfologia e a ultraestrutura de células nervosas no hipocampo foram observadas por hematoxilina-eoosina, manchada de células nervosas no hipocampo foram observadas por hematoxilina-eosina-eoosina, e a hematoxilina-eoosina de células do hipocampopus. A morfologia dos corpos de Nishi na região de Hemimani foi observada pela coloração de Nishi. Os níveis de malondialdeído (MDA) e superóxido dismutase (SOD) foram detectados pelo método do ácido tiobarbitúrico e método de tetrazólio nitroblue. As alterações da proteína 1 relacionada à ECH do tipo Kelch (KEAP 1), fator nuclear E 2- fator 2 relacionado (NRF 2) e heme cyclooxigenase 1 (HO -1}) foram analisadas por Western blot. Resultados Após o tratamento da medicação deserticola de cistanche, a estrutura do tecido do hipocampo dos ratos DP foi melhorada, a morfologia dos neurônios foi melhorada, a piretose nuclear foi aliviada, o conteúdo de enzima antioxidante foi gradualmente aumentado e o teor de teor de estresse oxidativo mdA mdA diminuído. A expressão proteica de Nrf 2 e Ho -1 aumentou. Conclusões Deserticola de Cistanche podem melhorar os danos dos neurônios do hipocampo e reduzir o nível de resposta ao estresse oxidativo no hipocampo de ratos PD. OEfeito de Cistanche DeserticolanoTratamento da DPOs ratos estão intimamente relacionados à regulação de Keap -1 /nrf 2 /ho -1 via de sinalização.

 

 

 

Cistanche de alta qualidade para tratamento de DP

 

Palavras -chave: Cistanche Deserticola;Doença de Parkinson; Estresse oxidativo; hipocampo; neurônios; Keap1; Nrf2; Ho -1

 

De acordo com as estatísticas do estudo de dados de doenças globais, as doenças neurológicas tornaram -se a principal causa de incapacidade em todo o mundo. Nesse campo, a doença de Parkinson (DP) tornou-se uma das doenças que mais crescem com seu aumento significativo de prevalência padrão de idade, crescendo casos de incapacidade e aumento da taxa de mortalidade. um.
De 1990 a 2020, o número de pacientes com DP em todo o mundo aumentou 118%, atingindo 6,2 milhões, e a incidência ainda está aumentando ano a ano [1-2]. Os pacientes com DP geralmente apresentam sintomas motores, como tremor, rigidez muscular, bradicinesia e dificuldade em equilíbrio no estágio final. No entanto, sintomas não motores, como o declínio cognitivo, podem ocorrer no estágio inicial da doença. À medida que a doença avança, o comprometimento cognitivo piorará progressivamente e se tornará mais grave.

Cistanche de alta qualidade para tratamento de DP

Afetar a qualidade de vida dos pacientes [3]. O hipocampo é uma organização importante no cérebro para aprender e receber informações externas. É a principal estrutura para realizar funções cognitivas humanas. A disfunção do hipocampo está intimamente relacionada ao início da disfunção cognitiva em pacientes com DP. O estresse oxidativo está envolvido no desenvolvimento de células nervosas no tecido hipocampo. Dano [4-5]. Portanto, se os neurônios do hipocampo são protegidos em pacientes com DP, isso pode melhorar a cognição do paciente e atrasar a progressão da doença.
Nos últimos anos, uma variedade de medicamentos fitoterápicos chineses provou ser eficaz no tratamento de doenças relacionadas a neurológicas [6]. Cistanche Deserticola é uma medicina tradicional chinesa que pode nutrir Yang rim e reabastecer a essência e o sangue. Foi usado para tratar doenças neurológicas, como acidente vascular cerebral isquêmico e neuromielite [7]. Estudos anteriores do grupo de pesquisa mostraram que a deserticola de Cistanche pode melhorar o comportamento dos ratos com modelos de DP e reduzir a apoptose das células nervosas dopamina na área de Nigra Substantia do mesencéfalo [8-9}]. No entanto, não está claro se a deserticola de Cistanche pode melhorar os danos nos tecidos do hipocampo em ratos modelo de PD. Portanto, este estudo estabeleceu um modelo de rato PD para observar o efeito da deserticola de Cistanche nos danos nos tecidos do hipocampo e explorar seu mecanismo, a fim de fornecer novas idéias para o tratamento da DP. Reagente de coloração da Nissl (Nanjing Senbeijia Biological Company); ISOFLURANA (Shanghai Yaji Biological Company).

 

1 materiais e métodos

1.1 Materiais

1.1.1 Animais experimentais

30 6- ratos machos SD da semana de idade pesando 210-230 g foram usados. O Centro Animal Experimental da Universidade Fujiana de Medicina Tradicional Chinesa forneceu animais experimentais e instalações gerais de ambiente animal experimental. O experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal desta instituição, e o número de registro de ética é 1N2023019.

1.1.2 Reagentes experimentais
GRANULOS DE CISTANCHE DESERTICOLA (Hospital Popular do Terceiro Popular de Fujiano); 6- hidroxitopamina (6- ohda) reagente (Pequim Biolabor Technology Co., Ltd.); Reagente de coloração de hematoxilina-eosina (HE) (Taizhou Yunke Biotechnology Co., Ltd.); Lisado de proteína de tecido animal (Beijing Solebao Biological Company); Inibidores da proteína fosfatase (Wuhan Pujian Biological Company); Inibidores de protease (Hunan Yunbang Biotechnology Company); Proteína associada à ECH do tipo Kelch -1 (Keap1) anticorpo monoclonal (empresa de biotecnologia Wuhan Saning Biotechnology); Gliceraldeído 3- anticorpo monoclonal fosfato desidrogenase (GAPDH) (Wuhan Huamei biológico); Fator nuclear E2 Related Factor 2 (nrf2), heme oxigenase 1 (hemoxygenas -1, ho -1}) anticorpo monoclonal (Wuhan Pujian Biotechnology Co., Ltd.); Superóxido Dismutase (SOD) e Kits de detecção de Malondialdeído (MDA) (Shanghai Biotech Co., Ltd.); Reagente de coloração Nissl (Nanjing Senbeijia Biotechnology Co., Ltd.); Isoflurane (Shanghai Yaji Biotechnology Co., Ltd.).

 

1.1.3 Instrumentos

JEA3001 Equilíbrio Eletrônico (Shanghai Puchun Medição Instrument Co., Ltd.); Equilíbrio eletrônico BSA224S (Sartorius, Alemanha); STAB S2T Shaker de baixa temperatura (Shanghai Hetian Scientific Instrument Co., Ltd.); RM2235 Slicer de parafina totalmente automático (Leica, Alemanha); leitor de microplacas multifuncionais de Pectramax i3x (Molecular Devices, EUA); BX63
microscópio de fluorescência (Olympus, Japão); DLAB Centrífuga portátil D1008/D1008E (Pequim Dalong Xingchuang Experimental Instrument Co., Ltd.); Cryocube F740HI Ultra-Low Temperature Gelic Frigerator (Epend, Alemanha); Minipro Epbasic Basic Eletroforese INSTRUMENTO SONDA DE PODER (Xangai Yisheng Biotechnology Co., Ltd.); Forno de secagem de temperatura constante (Hangzhou Notting Scientific Equipment Co., Ltd.); ASCUNTO MAX CHOP DUCTLESS FUME (Shanghai Yishike Enterprise Development Co., Ltd.).

 

1.2 Métodos

1.2.1 Estabelecimento de modelos e agrupamento de animais

Rats were placed in an environment with a temperature of 24-25℃, a humidity of 55%-60%, and a 12/12 h light/dark cycle, with free access to food and water. SD rats were randomly divided into 3 groups (10 rats in each group): blank group, model group, and Cistanche deserticola group. According to the PD animal model establishment method [5], SD rats in the model group and Cistanche deserticola group were anesthetized by 2% isoflurane inhalation and fixed on a brain stereotaxic instrument. The skin was incised along the midline of the skull, and the skull membrane was bluntly separated. The coordinates of the right striatum were determined by referring to the rat brain stereotaxic atlas. 8μL of 6-OHDA was injected intracranially at the above target at a concentration of 2μg/μL, and the blank group rats were injected with an equal volume of saline. Successful modeling criteria: One week after modeling, apomorphine (0.5 mg/kg) was intraperitoneally injected to induce rat rotation. The rats rotated from the healthy side to the affected side, and the number of rotations within 30 min was >21 0 círculos, que foram considerados uma modelagem bem -sucedida. Depois disso, os ratos no grupo deserticola de Cistanche foram adquiridos com solução de 0,216 g/ml de solução deserticola de cistanche todos os dias, e o grupo em branco e o grupo modelo foram formados com solução salina normal. O volume de gavagem dos três grupos de ratos foi de 1 ml/(100 g · d) por duas semanas [9]. Após a conclusão do tratamento de cada grupo de ratos, os ratos foram sacrificados por 2% de anestesia de inalação de isoflurano e os tecidos cerebrais foram coletados para estudos experimentais subsequentes.

 

1.2.2 Observação de mudanças patológicas no tecido hipocampal por coloração com hematoxilina-eosina

 

Os tecidos do hipocampo de ratos em cada grupo foram coletados, colocados em solução de formaldeído, desidratados com etanol gradiente, assados ​​em um forno de secagem, cera dissolvida, seca, deswaxada, corada com Microscópio.

 

1.2.3 Observação da microscopia eletrônica de transmissão da ultraestrutura de células nervosas do hipocampo

O tecido hipocampo foi colocado em fixador de glutaraldeído a 3%, desidratado com etanol gradiente, incorporado (resina epóxi) e seções ultrafinas foram preparadas. A coloração de citrato de chumbo e acetato de uranil foram usados ​​para observar as alterações ultraestruturais das células nervosas hipocampal (em microscopia eletrônica de transmissão).

 

1.2.4 coloração Nissl para observar as mudanças dos corpos NISSL no tecido hipocampo

As seções de parafina do tecido hipocampo acima mencionadas foram hidratadas em etanol anidro, etanol de 95% e 70%, respectivamente. Após a lavagem com água destilada 3 vezes, mancha com solução de coloração com Nissl por 5 min, depois lave com álcool gradiente desidratado e água destilada e limpe com xileno. As seções foram seladas com cola neutra e observadas e registradas sob um microscópio óptico após a solidificação.

 

1.2.5 Método Colorimétrico Químico para detectar o conteúdo de MDA e SOD no tecido hipocampo

Depois que os tecidos do hipocampo de diferentes grupos experimentais foram homogeneizados, eles foram centrifugados a 1000 g por 20 min e o sobrenadante de cada grupo experimental foi coletado. De acordo com as instruções do kit, os kits de ensaio MDA e SOD foram usados ​​para detectar o conteúdo de MDA e SOD em cada grupo de amostras experimentais.

 

1.2.6 Imunotransferência de proteínas para detectar a expressão específica de proteínas Keap1, Nrf 2 e Ho -1 no tecido hipocampo

Os tecidos do hipocampo de cada grupo foram adicionados com tampão de lise e centrifugados a 12, 000 r · min -1 por 15 min. O sobrenadante foi coletado para uso em espera. A concentração de proteínas foi determinada pelo método BCA. De acordo com os resultados da quantificação de proteínas, o volume correspondente da proteína total foi adicionado e carregado com eletroforese em gel de proteína. As amostras foram desnaturadas a 95 graus por 10 min, transferidas para a membrana, cortadas e bloqueadas em solução de bloqueio por 1 h. Foram adicionados os anticorpos primários diluídos Keap1, NRF 2, HO -1 e GAPDH (1: 500), reagiram durante a noite a 4 graus, lavados com 1 × TBST, incubados com anticorpos secundários (1: 4000) e lavados com 1 × TBST novamente para imaginação de cores.

 

1.3 Análise estatística

Os dados de contagem foram expressos como média ± desvio padrão. Os dados que estão em conformidade com a distribuição normal e a homogeneidade de variância foram submetidos ao teste t, os dados que se conformavam à distribuição normal e à variação desigual foram submetidos a teste t corrigido; Os dados que não estavam em conformidade com a distribuição normal foram submetidos a um teste não paramétrico. A ANOVA unidirecional foi usada para comparar as diferenças entre diferentes grupos e, em seguida, o método LSD foi usado para comparar os dois grupos. P <0. 05 foi considerado estatisticamente significativo.

 

2 resultados

2.1 Efeito da deserticola de cistanche na estrutura morfológica da região do hipocampo CA1 em ratos modelo de DP que ele coloca os resultados mostrou que os neurônios na região de CA1 do hipocampo dos ratos em branco do grupo foram dispostos de danos nas células neuronais regulares; As células neuronais do grupo modelo foram dispostas mais desordenadas, os núcleos celulares foram encolhidos, a coloração nuclear foi aprofundada e o dano neuronal das células era óbvio; As células neuronais do grupo deserticola de Cistanche foram organizadas com mais regularidade do que as do grupo modelo, o número de condensação nuclear foi relativamente reduzido e os danos nas células neuronais foram aliviados. Os resultados são mostrados na Figura 1.

 

 

Figura 1 Efeito do deserticola de Cistanche na estrutura patológica na região CA1 do hipocampo em Rat de Parkinson (He, × 400) Nota: A: Grupo de controle; B: grupo modelo; C: Grupo Cistanche. As setas pretas indicam células nervosas danificadas.

 

2.2 Efeito do deserticola de Cistanche na ultraestrutura dos neurônios do hipocampo em ratos modelo de PD

No grupo em branco, ao observar os neurônios do hipocampo, pode -se observar que a estrutura celular mantém uma morfologia clara, o núcleo apresenta uma forma redonda ou oval regular, a membrana nuclear permanece lisa e intacta e a cromatina no núcleo é distribuída uniformemente e não há agregação da borda do cromatle nuclear. Por outro lado, os neurônios do hipocampo do grupo modelo mostraram mudanças óbvias: a densidade geral de elétrons das células aumentou, o núcleo condensado, a cromatina no núcleo agregada e ligada ao fundo da membrana nuclear, a membrana nuclear e os vacuoles foram observados na citoplasma. After intervention with Cistanche deserticola, compared with the model group, the hippocampal neurons of the Cistanche deserticola group showed a certain recovery trend: the size of the neuronal cell body was restored, the cell membrane remained intact, the edge aggregation of nuclear chromatin was alleviated to a certain extent, the thickening of the nuclear membrane was also alleviated, and the number of vacuoles in the O citoplasma diminuiu, indicando que a deserticola de Cistanche tem um certo efeito de proteção ou reparo nas células nervosas. Veja a Figura 2.

 

Figura 2 Efeito da deserticola de Cistanche na ultraestrutura neuronal no hipocampo dos ratos da doença de Parkinson (× 7000) Nota: A: Grupo de controle; B: grupo modelo; C: Grupo Cistanche.

 

2.3 Efeito do deserticola de Cistanche em corpos Nissl em neurônios do hipocampo de ratos modelo de PD

Os resultados da coloração com Nissl mostraram que os neurônios no grupo em branco estavam de perto, com morfologia regular, abundantes corpos NISSL e coloração escura; Os neurônios do grupo modelo foram livremente arranjados, inchados e a maioria dos corpos Nissl foram dissolvidos e levemente manchados; Os neurônios do grupo deserticola de Cistanche foram organizados de perto, com morfologia regular, e o número e a coloração dos corpos NISSL foram aprimorados em comparação com o grupo modelo. Os resultados são mostrados na Figura 3.

 

Figura 3 Efeito do deserticola de Cistanche no corpo de células nervosas do hipocampo de Nissl no rato da doença de Parkinson (NISSL, × 200) Nota: A: Grupo de controle; B: grupo modelo; C: Grupo Cistanche.

 

2.4 Efeitos do deserticola de Cistanche no conteúdo de SOD e MDA no hipocampo dos ratos da doença de Parkinson

 

Comparado com o grupo em branco, o teor de SOD no hipocampo do grupo modelo diminuiu, enquanto o teor de MDA aumentou; Comparado com o grupo modelo, o teor de SOD no hipocampo do grupo deserticola de Cistanche aumentou, enquanto o teor de MDA diminuiu. Veja a Tabela 1.

 

Guia. 1 Efeitos do deserticola de Cistanche no conteúdo de SOD e MDA no hipocampo dos ratos da doença de Parkinson

Grupo	SOD (PG/ML)	MDA (PG/ML)
Controlar	12.36±2.75	2.85±0.83
Modelo	2.75±0.83*	9.95±0.37*
Rhynchophylla	7.22±1.32#	5.16±1.75#

Nota: comparado ao grupo controle, *P<0.05; compared with model group, #P<0.05.

 

2.5 Efeito do deserticola de Cistanche na expressão de proteínas Keap1, Nrf2 e Ho -1 no hipocampo dos ratos da doença de Parkinson

Os resultados das experiências de Western blot mostraram que a expressão de proteínas Nrf2 e Ho -1 no hipocampo de ratos no grupo modelo diminuiu, enquanto a expressão da proteína Keap1 aumentou; Comparado com o grupo modelo, a expressão de proteínas Nrf2 e Ho -1 no hipocampo de ratos no grupo deserticola de Cistanche aumentou, enquanto a expressão da proteína Keap1 diminuiu. Veja a Figura 4 e a Tabela 2.

Figura 4 Efeito de Cistanche Deserticola na expressão de Keap1, Nrf2 e Ho -1 no hipocampo dos ratos da doença de Parkinson

Nota: A: Grupo de controle; B: grupo modelo; C: Grupo Cistanche

 

 

Guia. 2 Efeito de Cistanche Deserticola na expressão de Keap1, Nrf2, Ho -1 no hipocampo de Ratos da doença de Parkinson

 

Grupo	Keapl	Nrf2	Ho -1
Grupo em branco	0.16±0.05	0.38±0.07	0.33±0.05
Grupo modelo	0.85±0.23*	0.12±0.09*	0.11±0.02*
Grupo positivo	0.22±0.03#	0.86±0.06#	0.79±0.05#

 

Nota: comparado com o grupo de controle, *p <{{0}}. 05; Comparado com o grupo modelo, #P <0,05.