Propriedades Químicas de um Manoglucano de Cistanche Deserticola

Contato: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

1. Materiais

Foram utilizadas pastas orais para equinos de dois fabricantes diferentes contendo 10 mg/g (A) ou 20 mg/g (B) de ivermectina, respectivamente. O ensaio quantitativo para ivermectina foi realizado e o conteúdo foi de 104,4 a 107,7 por cento da concentração declarada.

2. Teste de dissolução

O teste foi realizado com um Ph. Eur. aparelho de pás (Pharma Test, Heinberg, Alemanha), em agitações de 75 rpm ou 50 rpm, a 37 -0,5 C. Lauril sulfato de sódio (BDH Chemicals, Poole, Inglaterra) 0,5 por cento (w /v) foi utilizada solução aquosa como meio de dissolução (900 ml). A pasta (4 g de A ou 2 g de B) foi colocada no recipiente com uma seringa com cânula (A) ou gotejando a amostra na superfície do meio de dissolução (B). Após os intervalos de tempo (15, 30, 45, 60 min e 2 h), uma amostra do meio de dissolução foi retirada (2 ml), filtrada em filtro de vidro e analisada.

3. Análise de HPLC

A determinação de ivermectina foi realizada com um método de HPLC modificado conforme descrito em Ph. Eur. As soluções analisadas foram diluídas com metanol (1:10). O sistema HPLC consistia em uma coluna octadecil (250 -4 mm; 5 mm; Lichrospher RP-18; Merck), um integrador D-12500 A, um detector UV-Vis L{{7} }, bomba L-6200A (Merck-Hitachi, Darmstadt, Alemanha). Uma mistura de acetonitrila:metanol:água (64:24:16) foi usada como fase móvel com um fluxo de 1,9 ml/min. O volume da amostra injetada foi de 20 ml e a detecção foi realizada em 254 nm.

4. Estudos de solubilidade

Um acesso da substância foi agitado em frascos de vidro bem fechados com um solvente adequado (Tabela 1) por 20 h a 37 0.1 C. As suspensões foram filtradas e o filtrado, após diluição em metanol, foi analisado por HPLC .

5. Estabilidade em solução ácida

Soluções de ivermectina em HCl {{0}}.1 M foram armazenadas em frascos de vidro bem fechados a 20 C e 37 C. Cromatogramas das soluções foram registrados em t ¼ 0 e após 1, 2 e 6 h. A área da ivermectina (tempo de retenção 10,5 min) e picos adicionais foram calculados.

Referências

Orientação da FDA para a indústria: Formas farmacêuticas semi-sólidas não estéreis SUPAC-SS. Mudanças de ampliação e pós-aprovação: química, fabricação e controles; testes de liberação in vitro e documentação de bioequivalência in vivo. Maio de 1997. Diretrizes FIP para testes de dissolução de produtos orais sólidos (1997) Dissolute. Tecnol. 4: 5–14. Siewert M, Dressman J, Brown C, Shah VP (2003) Diretrizes FIP/AAPS para testes de dissolução/liberação in vitro de formas farmacêuticas novas/especiais, AAPS PharmSciTech, 4 (1) artigo 7 Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, School de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Pequim, Pequim, China

Xiang mei Wu, Pengfei Tu Recebido em 13 de fevereiro de 2004, aceito em 4 de abril de 2004, Prof. Dr. Pengfei Tu, Centro de Pesquisa Moderna de Medicina Tradicional Chinesa, Escola de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Pequim, No. 38, Xueyuan Road , Haidian District, Pequim 100083, China Pengfeitu@bjmu.edu.cn Pharmazie 59: 815–816 (2004)

Um novo manoglucano deCistanche deserticolada China é caracterizada. O composto é responsável por uma estimulação suave da proliferação de linfócitos T e B induzida por mitógenos.

Cistanche deserticolaYC Ma é um holoparasita que cresce nas raízes da planta dicotiledônea Haloxylon ammodendron Bunge, amplamente distribuída no noroeste da China. Como é um tônico importante na medicina oriental, muitos componentes ativos e atividades farmacológicas foram reivindicados (Karasawa et al. 1986; Yoshizawa et al. 1990). Essas propriedades podem estar associadas a alguns dos componentes polissacarídeos deCistancheque ainda não foram investigados. Polissacarídeos pécticos mitogênicos e polissacarídeos neutros foram isolados e caracterizados deCistanche deserticolada Mongólia (Radna et al. 1996; Anna et al. 1997; Bozena et al. 1999). Aqui relatamos as propriedades químicas de um novo manoglucano deCistanche deserticolada China, que é responsável pela estimulação leve da proliferação de linfócitos T e B induzida por mitógenos. Após as hastes deCistanche deserticolaYC Ma foram extraídos com 95 por cento de etanol, água destilada fria foi usada para extrair o resíduo. O extrato em água fria foi precipitado com EtOH, a proteína foi removida e dialisada, obtendo-se o polissacarídeo bruto CCDP. O polissacarídeo bruto foi fracionado em uma coluna DEAE e uma coluna Sephadex G-150 para obter um polissacarídeo livre de proteína (CDP-6), que compreendia glicose (89,2 por cento) e manose (1{{58} }.4 por cento ), e dos quais o Sr médio foi estimado em 6.8 -104. O polissacarídeo CDP-6 mostrou [a 20 D 42 (c 1, H2O). As configurações absolutas dos açúcares foram determinadas por GC de TMS (– )-2-glicosídeos butílicos. CDP-6 foi metilado (Needs et al. 1993), hidrolisado, convertido em acetatos de alditol e analisado por GC e GC-MS (Tabela). Este resultado, juntamente com dados de razão molar da análise de metilação, sugeriu que CDP-6 tem um Glcp predominantemente 1,6-ligado e um backbone 1,6- ligado em menor extensão ramificado em O{{ 24}} de manose. A análise de metilação de dois polímeros (CDP-6-1, CDP-6–2) de hidrólise parcial confirmou que o CDP-6 tem um esqueleto consistindo de 1,6-resíduos de glicosil ligados e 1,6-resíduos de manosil ligados, que são substituídos em O-3 de manose por ramificações que consistem no terminal, 1,6- resíduos de glucosil ligados e 1,3,{{38} } resíduos de manosil ligados. De acordo com as razões molares e a literatura (Bozena et al. 1999; Bacon et al. 1996), o espectro de RMN 13C de CDP-6 mostrou sinais devido a carbonos anoméricos do a- d-Glcp (C{{45 }} a 98,4 ppm), bd-Map (C-1 a 104,3–104,9 ppm) e ad-Map (C-1 a 100,0 ppm). O espectro de RMN de 1 H de CDP-6-2 em D2O mostrou sinais de prótons correspondentes ao ad-Glcp (H-1 em 4,94–4,95 ppm) e a-d-Map (H-1 em 4,96–5,00 ppm). O espectro de RMN 13C de CDP-6-2 em D2O mostrou sinais de prótons correspondentes ao aD-Glcp (C-1 a 98,6 ppm) e ad-Map (C-1 a 98,4 ppm). Mannoglucanos são relatados como tendo um backbone de 1,4-glucopiranano ligado e 1,4-manopirano ligado (Radjabi Nassab et al. 1984; Tanabe et al. 2000). CDP-6 tem algumas características estruturais diferentes por seu a-1,6-linked Glcp e b-1,6-linked Map backbone, e é substituído por ramificações de manoglucano (FIG.). Para investigar o uso deCistanche deserticolana medicina popular, foi avaliado o efeito da CDP-6 nos sistemas de células T e B. Verificou-se que estimula levemente a proliferação de linfócitos T e B induzida por mitógenos.

Experimental

1. Procedimentos gerais

A rotação óptica foi medida com um polarímetro automático W22-1S. Os espectros de IV foram determinados num espectrómetro Perkin-Elmer 599B. A análise de GC foi realizada em um instrumento Agilent HP6890N, equipado com um detector FID. A GC-MS foi realizada em um instrumento Finnigan Trace GC-MS. A homogeneidade e Mr de CDP-6 foram estimados a partir da curva de calibração do volume de eluição de dextranos padrão, que foi realizada em

um aparelho Agilent série 1100 com uma coluna Shodex KS-805. Os espectros de RMN de 1H e RMN de 13C foram registrados com um instrumento INOVA-500. O teor de proteína foi analisado pelo método de Bradford (Andre et al. 1975). Os monossacarídeos foram analisados ​​quanto ao seu acetato de alditol após terem sido hidrolisados ​​(2 M TFA, 2 h, 110 C), reduzidos e acetato. Os hidrolisados ​​foram analisados ​​usando TLC em uma placa de gel de sílica contendo 5 por cento de di-hidrogenofosfato de sódio em BuOH-EtOAc-álcool isopropílico-HOAC––H2Opiridina (3,5: 10: 6: 3,5: 3: 3) e os açúcares foram detectados por pulverização com orcinol -H2SO4. Os acetatos de alditol resultantes foram analisados ​​por GLC usando uma coluna capilar HP{25}} (30 m 0,32 mm). CDP-6 foi metilado pelo método de Ciucanu, seguido de hidrólise, e foi analisado como acetatos de alditol parcialmente metilados por GC-MS. Após hidrólise parcial, os produtos foram dialisados ​​e separados, obtendo-se dois polímeros, CDP-6-1 e CDP-6–2.

2. Material vegetal

A planta foi coletada na província da Mongólia Interior, na China, em agosto de 2001 e foi identificada por Hu-Biao Chen, do Departamento de Medicina Natural da Escola de Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Pequim. Um espécime de comprovante [E-1-(9)] desta planta foi depositado na Escola de Ciências Farmacêuticas da Universidade de Pequim. 3. Extração, isolamento e purificação do polissacarídeo CDP-6 O caule deCistanche deserticolaYC Ma (1500 g) foram extraídos com 95 por cento de etanol (6 L) sob refluxo. O resíduo insolúvel em etanol seco foi macerado três vezes com água destilada fria por 12 h. O extracto de água fria foi filtrado e o filtrado centrifugado. Após precipitação com quatro volumes de EtOH (agitação e repouso por 24 h a 4°C), obteve-se o produto precipitado (35,5 g). A proteína no precipitado foi removida pelo método de Savage. Após dissolução em água destilada, o resíduo (25,5 g) foi dialisado e liofilizado (rendimento: 10,6 g). O polissacarídeo bruto (8 g) foi dissolvido em água destilada (100 mL, 8 por cento p/v) e separado usando uma coluna DEAE (70 5 cm, o gradiente de 0-2 M NaCl, por 1,5 L). Obteve-se uma fracção eluída com água (600 mg). Uma amostra (250 mg) foi purificada por cromatografia de permeação em gel em coluna em colunas Sephadex G- 150 (4 - 80 cm, 1600 mL, 5 mL por fração). Frações de CDP-6 (1500-1600 mL) foram reunidas, dialisadas e liofilizadas. Após dessalinização pela Sephadex G-25 (60 1 cm). CDP-6 (110 mg) foi obtido e determinado como um único pico por HPSGC.

Reconhecimento:O autor agradece ao Dr. Baomei Shao e Prof. Xiaoming Gao, Escola de Ciências Médicas Básicas, Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Pequim, por medir a atividade imunomoduladora do CDP-6.