Alterações na membrana eritrocitária humana exposta a extratos aquosos e etanólicos de Uncaria Tomentosa

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Abstrato: Uncaria tomentosa (Willd.)DC é uma espécie de trepadeira lenhosa originária da América do Sul e Central que tem sido utilizada na terapia da asma, reumatismo, hipertensão e purificação do sangue. Nosso estudo anterior mostrou que U.tomentosaextratosalteração da forma dos eritrócitos humanos, o que pode ser devido à incorporação dos compostos contidos nos extratos na membrana dos eritrócitos. O objetivo do presente estudo foi determinar como os compostos contidos nos extratos de UI.tomentosa se incorporam à membrana eritrocitária humana. O estudo avaliou o efeito de extratos aquosos e etanólicos de folhas e casca de U. tomentose sobre a resistência osmótica do eritrócito humano, a viscosidade do interior do eritrócito e a fluidez da membrana plasmática do eritrócito. Humanoeritrócitosforam incubados com os extratos estudados nas concentrações de 100.250 e 500ug/mL por 2,5 e 24 h. Todos os extratos testados causaram diminuição da fluidez da membrana eritrocitária e aumento da sensibilidade osmótica eritrocitária. Os extratos etanólicos da casca e das folhas aumentaram a viscosidade dos eritrócitos. As maiores alterações nos parâmetros estudados foram observadas nas células incubadas com extrato etanólico da casca. Consideramos que os compostos do extrato de U. tomentosa se acumulam principalmente na monocamada hidrofílica externa da membrana eritrocitária, protegendo assim os eritrócitos contra os efeitos adversos do estresse oxidativo.

Palavras-chave: eritrócitos; fluidez da membrana; resistência osmótica; Uncaria tomentosa; extratos

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1. Introdução

Uncaria tomentosaextratossão comumente usados ​​para apoiar o tratamento de várias doenças devido à suaantioxidante[1-4] e atividades imunoestimulantes [5,6]. Extratos de U.tomentosa também demonstraram exibir atividades anticancerígenas [7-9], antimutagênicas [10,11] e anti-herpéticas [11].

Pesquisas etnomedicinais e outros estudos mostraram inúmeras aplicações desta planta na medicina tradicional de diferentes culturas, por exemplo, no tratamento de inflamações, artrite, asma, câncer, úlceras gástricas, doenças do trato urinário e hemorragias [12,13]. Tais propriedades diversas devem-se à complexa composição química da U. tomentosa estando associada principalmente ao alto teor de vários metabólitos secundários biologicamente ativos, principalmente fenólicos e alcalóides [14].

Muitos trabalhos também indicaram a ação benéfica (sem efeitos colaterais) dos extratos de UI.tomentosa (usados ​​em dosagens terapêuticas) em células sanguíneas tanto em estudos in vivo[15,16] quanto in vitro [17-19]. Sheng et ai. [20] não observaram nenhuma alteração na apresentação do sangue após a administração de altas concentrações de extrato de U. tomentosa C-MED-100TM a voluntários saudáveis. Eles não observaram alterações estatisticamente significativas, incluindo nível de hemoglobina, valor de hematócrito e volume médio de glóbulos vermelhos (RBC), o que excluiu a possível eliminação prematura de eritrócitos expostos a extratos de U. tomentosa.

Da mesma forma, ensaios clínicos conduzidos por Piscoya et al. [21] em pacientes com osteoartrite de joelho, quanto à avaliação da eficácia de Uncaria gujanensis na terapia dessa doença, não mostraram alterações no hematócrito, nível de hemoglobina, bem como no valor da velocidade de hemossedimentação (VHS), comparado a um grupo dos pacientes que receberam placebo. No entanto, mais estudos em coortes humanas maiores são necessários para excluir a possibilidade de eliminação deeritrócitosda circulação de humanos expostos a espécies de Uncaria. Nossos estudos anteriores mostraram que extratos etanólicos e aquosos das folhas e cascas de U. tomentosa, mesmo em uma concentração muito alta de 500 ug/mL, não eram tóxicos para os eritrócitos. Também observamos que os extratos estudados aliviaram a oxidação da hemoglobina e a peroxidação lipídica, bem como diminuíram a formação de ROS e hemólise induzida por um tóxico 24-diclorofenol (2,4-DCP)[17]. Além disso, encontramos um efeito protetor dos extratos de U. tomentosa sobre a atividade da catalase em eritrócitos humanos incubados com 2,4-DCP e catecol [22].

A concentração fisiológica de polifenóis vegetais é difícil de avaliar. Na literatura, geralmente, as informações sobre as doses recomendadas das preparações ou as concentrações dos compostos testados (para humanos 210-500 mg/dia ou para animais 350-500 mg/kg de massa corporal) são fornecidas [23,24 ].

Alguns dos compostos são absorvidos sem alterar sua forma, enquanto outros, especialmente na forma de glicosídeos, durante a absorção são privados de todos ou parte dos resíduos de açúcar. A flora intestinal também participa da transformação dos polifenóis vegetais.

A maior parte da dose absorvida é excretada do corpo através da urina e fezes. Estima-se que não mais do que 10-20 por cento da dose ingerida de quercetina e isoflavonas (genisteína e daidzeína) seja detectada no plasma após 1-3 h da administração. As antocianinas são consideradas menos eficientemente absorvidas - sua absorção é estimada em 1-2 por cento da dose inicial [25]

O estresse oxidativo ocorre quando o nível de ROS em uma célula supera o nível deantioxidantesistema de defesa. A hemácia é particularmente suscetível ao estresse oxidativo devido ao alto teor de ácidos graxos poliinsaturados presentes em sua membrana e à auto-oxidação da hemoglobina. A membrana eritrocitária humana é composta de ácidos graxos saturados, ácidos graxos monoinsaturados, ácidos graxos poliinsaturados e ácidos graxos poliinsaturados N-3 de cadeia longa [26]. Os agentes oxidantes alteram a rigidez da membrana, alteram o potencial dipolar da membrana e causam a formação de complexos espectrina-hemoglobina [27]. Para lidar com o estresse oxidativo, os eritrócitos são equipados com um citoesqueleto especializado que fornece a estabilidade mecânica e a flexibilidade necessárias para resistir às forças que ocorrem durante a circulação. A membrana dos eritrócitos é composta por uma bicamada lipídica, proteínas transmembrana e uma rede filamentosa de proteínas (como espectrina, F-actina, proteína 4.1 e domínio de proteínas de ligação à actina, aducina, tropomiosina e tropomodulina) que formam um esqueleto de membrana ao longo da membrana. toda a superfície citoplasmática de sua membrana [28]. ROS também são capazes de induzir eriptose por alterações na translocação de fosfatidilserina (PS) de membrana [29]. O estresse oxidativo também pode levar à exaustão dos componentes redutores celulares e causar alterações estruturais e funcionais na membrana dos glóbulos vermelhos: degradação da fosfatidilserina e ácido siálico, que são os principais componentes que estabelecem a carga negativa no lado externo da membrana [30].

Está comprovado que os polifenóis isolados de U.tomentosa apresentam propriedades antioxidantes muito fortes. Vários relatos mostraram que extratos aquosos e metanólicos obtidos de diferentes partes de U. tomentosa protegeram as células da produção de radicais livres e peroxidação lipídica in vitro, bem como inibiram danos ao DNA induzidos por radicais livres e morte celular [2,3,31]. Em nosso estudo anterior, também mostramos que os extratos de UI.tomentosa em condições fisiológicas protegeram os eritrócitos contra a formação de EROs e hemólise. Além disso, demonstramos que os extratos etanólicos de .tomentosa exibiram os efeitos protetores mais fortes [17].

Para descobrir se os compostos testados podem penetrar na membrana (e em que profundidade eles estão localizados), a fluidez da membrana eritrocitária foi avaliada. Muitos fatores físicos e químicos afetam a fluidez da membrana[32,33]. Os agentes químicos incluem xenobióticos que causam oxidação de lipídios e proteínas e os compostos que se intercalam

na membrana [34,35]. A incorporação de compostos estranhos na estrutura da membrana pode romper o arranjo de seus elementos, o que geralmente resulta em uma mudança na fluidez da membrana. Alterações na fluidez da membrana podem levar à disfunção eritrocitária, bem como a alterações nas propriedades reológicas do eritrócito [36]. Por outro lado, as substâncias com propriedades antioxidantes com capacidade de penetrar na membrana podem apresentar um papel protetor em relação à célula [37]. Portanto, para esclarecer se os compostos contidos nos extratos de U.tomentosa podem se acumular no folheto da membrana interna e/ou externa, avaliamos as alterações na fluidez da membrana em seus diferentes níveis, bem como avaliamos a resistência osmótica e a viscosidade interna dos eritrócitos. Escolhemos concentrações relativamente altas (mas não tóxicas como mostrado em estudos anteriores) dos extratos testados para observar possíveis mudanças nos parâmetros estudados, bem como para determinar a localização dos componentes do extrato na membrana eritrocitária.

2. Resultados

2.1.Fluidez da Membrana

2.1.1. Parâmetro de pedido S

Após 2h e 24h de incubação dos eritrócitos com extratos aquosos e etanólicos da casca e das folhas, estatisticamente, foram observadas alterações significativas no parâmetro de ordem S A Figura 1 mostra os valores médio e desvio padrão para quatro (2h de incubação) e cinco ( 24 h de incubação) experiências independentes. Após 2 h de incubação, todos os extratos estudados a 500 ug/mL causaram um aumento no parâmetro de ordenação S em hemácias humanas. Após 24 h de incubação, estatisticamente, mudanças significativas no parâmetro estudado foram observadas tanto em 250 ug/mL quanto em 500 ug /mL de todos os extratos examinados.

2.1.2. Correlação Tempo TB e Tempo TC

Após 2 h de incubação, estatisticamente, foram observadas alterações significativas para a correlação tempo TB e tempo tc para os eritrócitos tratados apenas com extrato etanólico a 500ug/mL. Após 24 h de incubação, não foram observadas alterações estatisticamente significativas no tempo e no tempo Tc nas hemácias tratadas com qualquer extrato testado (Tabela 1).

2.2. Viscosidade interna dos glóbulos vermelhos

Após 2 h e 24 h de incubação das hemácias com água e extratos etanólicos da casca e das folhas nas concentrações de 100 a 500 ug/mL, não foram observadas alterações estatisticamente significativas na viscosidade relativa do interior dos eritrócitos (Figura 2) . Os gráficos mostram os valores de média e desvio padrão para quatro (2 h) e cinco (24 h) experimentos independentes.

Deve-se notar que após 2 h, e principalmente após 24 h de incubação dos eritrócitos com extratos etanólicos da casca, pode ser observada uma tendência ao aumento da viscosidade do eritrócito interno (os resultados não foram estatisticamente significativos) (Figura 2) .

2.3. Fragilidade Osmótica

A incubação dos eritrócitos com extratos aquosos e etanólicos da casca e das folhas na concentração de 100 ug/L foi realizada por 2 h, 5 h e 24 h. O diagrama de resistência osmótica (Figura 3) apresenta os resultados médios de 5 experimentos independentes para cada tempo de incubação. Para a legibilidade do gráfico, não foram plotados desvios padrão. Os gráficos IC5o (Figura 4) mostram os valores calculados de média e desvio padrão para 5 experimentos independentes para cada tempo de incubação.

Após 2 h de incubação dos eritrócitos com os extratos testados, não foram observadas alterações na sensibilidade osmótica dessas células e, portanto, alterações nos valores dos parâmetros ICs0 foram observadas (Figuras 3 e 4). Notou-se também que os extratos testados após 5 h de incubação aumentaram a sensibilidade osmótica dos eritrócitos humanos. Com exceção do extrato aquoso da folha, os demais extratos sensibilizaram as hemácias a danos por estresse osmótico. Os eritrócitos incubados com os extratos estudados sofreram hemólise em concentrações mais elevadas de NaCl quando comparados aos eritrócitos controle (Figura 3). Um aumento nos valores do parâmetro IC50 também foi estatisticamente significativo para os eritrócitos incubados por 5 h com extrato aquoso e etanólico da casca e extrato etanólico da folha (Figura 4). Após 24 h de incubação, observou-se maior sensibilidade ao estresse osmótico nos eritrócitos tratados com todos os extratos testados em comparação com os

RBCs de controle (Figura 3). Da mesma forma, um aumento estatisticamente significativo nos valores de CIs foi observado nos eritrócitos incubados com todos os extratos de U.tomentosa estudados (Figura 4).

3. Discussão

Um estudo anterior mostrou que extratos de U.tomentosa alteraram a morfologia dos eritrócitos humanos [19]. Foi constatada a formação de esquistócitos, o que indicou a incorporação dos componentes dos extratos na monocamada externa da membrana dos eritrócitos[38,39]. Outro estudo mostrou que os compostos contidos nos extratos de U. tomentosa inibiram o vazamento de hemoglobina (hemólise) provavelmente por selar a membrana celular [17]. Uma das propriedades da membrana biológica, resultante de sua estrutura e interação entre seus componentes, é a fluidez da membrana. A fluidez da membrana é inversamente proporcional à sua viscosidade.

Utilizando espectroscopia de ressonância paramagnética (EPR), a fluidez da membrana eritrocitária incubada com etanol e extratos aquosos de casca e folhas foi determinada em dois níveis de 5 e 16 átomos de carbono do resíduo de ácido graxo.

Com base nos espectros de EPR obtidos para o 5-spin tag de ácido doxi-esteárico (5-DSA), foi calculado o parâmetro de ordenação S, que forneceu informações sobre as mudanças de fluidez no nível de 5 átomos de carbono do resíduo de ácido graxo. Para o parâmetro de ordenação S, observou-se um aumento estatisticamente significativo em seu valor após a incubação dos eritrócitos com etanol e extratos aquosos da casca e folhas de U. tomentosa, que apresentou

uma diminuição na fluidez da membrana ao nível de 5 átomos de carbono de um resíduo de ácido graxo. Um aumento estatisticamente significativo no parâmetro S foi observado após 2-h de incubação de eritrócitos com extratos etanólicos da casca, bem como água e extrato etanólico das folhas a 250 ug/mL e 500 ug/mL, enquanto o extrato aquoso de a casca apenas a 500 ug/mL causou alterações no parâmetro discutido (Figura 1A). O prolongamento do tempo de incubação até 24 h causou um aumento estatisticamente significativo no parâmetro S nos eritrócitos incubados com todos os extratos estudados a partir de sua concentração de 250ug/mL (Figura 1B). A diminuição da fluidez da membrana ao nível de 5 átomos de carbono de um resíduo de ácido graxo pode ter sido associada ao efeito dos polifenóis na estrutura da membrana plasmática como descrito por Duchnowicz et al.[40]. A pesquisa de Koren et al.[37]implicava um efeito benéfico dos polifenóis na capacidade antioxidante total do sangue, especialmente dos eritrócitos. Eles postularam que eritrócitos circulantes e possivelmente outras células sanguíneas podem ser constantemente revestidos por polifenóis de nutrientes suplementados, que atuam como depósitos de antioxidantes e, portanto, podem se comportar como protetores contra as consequências nocivas do estresse oxidativo. Os compostos polifenólicos determinados em U. tomentosa são classificados como metabólitos secundários que têm efeito positivo no corpo humano. Eles exibem atividade antioxidante, quelando íons metálicos (ferro, cobre) e suportam atividades de enzimas antioxidantes. O efeito protetor dos polifenóis no corpo humano está principalmente associado à proteção celular contra o estresse oxidativo, que pode estar associado à prevenção do desenvolvimento de várias doenças, incluindo aterosclerose ou câncer [41,42]. Pesquisa realizada por Heitzman et al. [43] assim como nosso estudo[17] mostraram a presença de polifenóis em extratos de U.tomentosa. Os autores, analisando vários extratos, determinaram o maior teor de polifenóis no extrato etanólico da casca e o menor no extrato aquoso das folhas. Compostos fenólicos presentes em Ul. tomentosa são representados principalmente por taninos, derivados de flavonóis, catequinas, taninos (incluindo catequinas e epicatequinas) e procianidinas. Os polifenóis devido à sua estrutura têm solubilidades diferentes em água, mas todos eles se dissolvem bem em solventes orgânicos. Portanto, os extratos etanólicos de plantas geralmente têm uma composição mais diversificada e uma maior concentração de polifenóis do que os extratos aquosos.

No caso da tag de spin de ácido 16-doxil esteárico (16-DSA), foram determinados dois tempos de correlação T e tc. Após incubação dos eritrócitos por 2 h com extrato etanólico da casca na concentração de 500 ug/mL, observou-se um aumento na correlação tempo tp e tempo Tc. No entanto, não foram observadas alterações estatisticamente significativas nestes parâmetros após 24 h de incubação. Outros extratos testados não causaram alterações estatisticamente significativas no tempo de correlação de TB tanto após 2 h quanto 24 h de incubação. Uma tendência ascendente para este parâmetro foi mostrada em eritrócitos incubados (particularmente por 24 h) com todos os extratos estudados a 500ug/mL (Tabela 1). Um aumento nos tempos de correlação tB e tc indica um endurecimento do filme ao nível de 16 átomos de carbono do resíduo de ácido graxo. No entanto, nenhuma alteração após 24 h de incubação sugere que este seja um efeito temporário causado pelos componentes do extrato, que são inicialmente incorporados à membrana, mas após um tempo de incubação maior, são removidos para fora da célula. Tais efeitos dos polifenóis foram descritos no estudo de Tarahovsky et al. [44]. Esses autores sugeriram que os flavonóides penetraram no local hidrofóbico da bicamada lipídica, particularmente nos compartimentos conhecidos como jangadas lipídicas, ou nos bolsos de proteínas hidrofóbicas. Os flavonoides, após complexados com metais, ainda possuem potencial antioxidante, enquanto sua lipofilicidade pode aumentar, facilitando a proteção dos lipídios da membrana contra a oxidação.

Sugerimos que os polifenóis do extrato da casca de U. tomentosa não apenas penetraram em níveis mais profundos da membrana eritrocitária, mas também foram transferidos para dentro da célula, o que foi confirmado pelo aumento da viscosidade interna das hemácias. Um dos principais parâmetros que afetam a deformabilidade dos eritrócitos é sua viscosidade interna [45]. Neste estudo, as alterações na viscosidade eritrocitária foram avaliadas por marcadores de spin. Não houve alterações estatisticamente significativas na viscosidade relativa dos eritrócitos tratados com extratos aquosos de U.tomentosa tanto após 2-h e 24-h de incubação, enquanto os extratos etanólicos induziram alterações no parâmetro discutido (Figura 2). Isso pode indicar que os polifenóis contidos em muitos

concentrações mais elevadas nos extratos etanólicos penetraram intensamente na membrana das hemácias causando alterações na viscosidade do interior do eritrócito. Os eritrócitos incubados com extratos aquosos podem compensar facilmente as alterações na viscosidade, provocadas por menores concentrações de substâncias polifenólicas (Figura 6).

Deve-se ressaltar, no entanto, que a localização dos polifenóis nas camadas mais profundas da membrana celular e, consequentemente, sua penetração na célula com perturbação simultânea da viscosidade das hemácias pode ocorrer apenas em uma concentração muito alta dessas substâncias que não são encontradas no corpo humano mesmo após tratamento terapêutico com extratos de U. tomentosa. Em baixas concentrações, os polifenóis localizam-se principalmente na monocamada externa, como demonstrado pelas mudanças no valor do parâmetro S. Alterações na viscosidade do interior dos eritrócitos podem estar associadas a uma mudança na forma dos eritrócitos. Isso foi indicado por mudanças no parâmetro do canal de dispersão direta (FSC) obtido da análise de citometria de fluxo e fotos obtidas a partir de um exame microscópico de contraste de fase [19]. A formação de esquistócitos pode resultar da colocação de polifenóis presentes nos extratos de U.tomentosa tanto na região hidrofílica quanto na região hidrofóbica da monocamada externa da membrana celular, como sugerido por alterações no parâmetro de ordenação S e tempos de correlação tB e Tc. As alterações na forma dos glóbulos vermelhos podem estar associadas à perda de água e ao aumento da viscosidade no interior das células. Além disso, podem ser devidos a uma diminuição da resistência osmótica dos eritrócitos. A colocação de eritrócitos alterados em uma solução isotônica de NaCl pode levar a uma lise celular mais rápida (em comparação com células de controle) devido ao aumento do efeito da água e uma possibilidade limitada de deformação da membrana eritrocitária e, portanto, mudanças na forma da célula.

Os resultados mostraram que dependendo do tempo de incubação, os extratos de U, tomentosa podem ter um impacto diferente na fluidez da membrana plasmática e na resistência osmótica dos eritrócitos.

A resistência osmótica dos eritrócitos é um parâmetro que indica a sensibilidade das hemácias à ação de um ambiente hipotônico. Pela exposição dos eritrócitos ao ambiente isotônico, pode-se observar um pequeno movimento osmótico da água na membrana celular, que não altera o volume e a forma da célula. No caso de um ambiente hipotônico, a água entra na célula, o que faz com que seu volume aumente, além de mudar a forma de um disco côncavo para uma forma esférica. As células podem aumentar seu volume apenas até certo ponto. O aumento adicional de um volume resulta em uma ruptura da integridade da membrana celular e liberação do conteúdo celular por Ivsis osmótica. 3 e 4), bem como alterações no parâmetro IC50, foram observadas. No entanto, após 24-h de incubação, observou-se maior sensibilidade osmótica dos eritrócitos e, assim, observou-se aumento do valor de ICso em relação ao controle (Figuras 3 e 4). Efeitos mais fortes foram observados após a incubação de eritrócitos com extratos etanólicos em comparação com extratos aquosos. Isso provavelmente se deve ao fato de que os extratos etanólicos possuem mais compostos polifenólicos e taninos [17]. Alterações semelhantes (um aumento no valor de IC50) após maior tempo de incubação (90 min a 37 graus) de eritrócitos com catequinas foram observadas por Naparlo et al. [46]. Esses autores sugeriram que provavelmente durante a incubação prolongada, as catequinas são absorvidas pelos eritrócitos, o que pode levar a um aumento da osmolaridade do interior da célula e, assim, facilitar a hemólise em soluções hipotônicas devido à maior diferença de osmolaridade entre o interior e o exterior da célula. A segunda explicação para tais alterações foi uma sugestão de que as catequinas geram EROs durante a incubação prolongada, por exemplo, peróxido de hidrogênio, que pode danificar a membrana eritrocitária e aumentar sua fragilidade, incluindo fragilidade osmótica.

A localização dos compostos no nível de 5 carbonos da cadeia de ácido graxo eritrocitário resultou em um aumento da sensibilidade osmótica dessas células (deslocamento das curvas de resistência osmótica para valores de concentração de NaCl mais altos, aumento nos valores de IC50). No entanto, em experimentos anteriores conduzidos por Bors et al. [17] em condições isotônicas (0,9 por cento NaCl), os extratos de U.tomentosa inibiram a hemólise induzida por substâncias tóxicas, como 2,4-DCP e catecol. Esses pesquisadores também demonstraram o papel protetor dos extratos de U. tomentosa contra a ação oxidativa de 2,4-DCP em eritrócitos humanos manifestada na redução dos níveis de metemoglobina e ROS. Assim, o efeito final dos extratos no organismo é provavelmente positivo. No sistema in vivo, os extratos de U. tomentosa (em baixas concentrações) se incorporam à membrana (sem interferir em sua estrutura) e apresentam propriedades antioxidantes protetoras [12,47]. Os resultados dos estudos em ratos, bem como em voluntários saudáveis ​​que receberam U.tomentosa, não mostraram nenhuma alteração na membrana dos glóbulos vermelhos ou outras alterações nos eritrócitos, o que excluiu a possibilidade de remoção prematura dessas células da circulação. 20,48].

Afirmamos que a ligação de polifenóis à superfície eritrocitária pode ser responsável por suas propriedades protetoras (observadas em estudos anteriores). Os polifenóis, que são os mais frequentemente representados em extratos de U.tomentosa, podem interagir diretamente com membranas biológicas, além de atuarem como sequestradores de radicais livres e inibidores da peroxidação lipídica, aumentando a resistência celular ao dano oxidativo. Isso foi confirmado pelas últimas pesquisas realizadas em membranas bioativas. Kim et al.[49] adicionado extrato de U. tomentosa no processo de formulação de membranas de alginato nanoestruturado para melhorar suas atividades biológicas. Os autores mostraram que os componentes contendo membrana de U. tomentosa possuem uma excelente atividade antioxidante, mostrando quase 100 por cento da capacidade de redução de radicais livres em 15 min.

A limitação deste estudo é a falta de avaliação do efeito dos extratos testados na composição de ácidos graxos na membrana eritrocitária. A membrana eritrocitária humana é composta de ácidos graxos saturados (palmítico, esteárico), ácidos graxos monoinsaturados (palmitoleico, vacênico, cis-oleico, trans-oleico), ácidos graxos poliinsaturados (cis-linoleico, transinoleico, linolênico, eicosanóide, eicosatrienoico, aracosatrienoico) , e ácidos graxos poliinsaturados N-3 de cadeia longa (eicosapentaenóico, docosahexaenóico).

No entanto, neste estudo, os extratos foram aplicados em eritrócitos obtidos de doadores saudáveis. Assim, pode-se supor que a composição lipídica da membrana eritrocitária é típica para células normais [26]. Como os eritrócitos maduros humanos não possuem núcleo, eles não sintetizam componentes celulares, incluindo ácidos graxos. Por esta razão, a composição lipídica não deve mudar ao contrário dos estudos in vivo: no carcinoma espinocelular da pele [26] ou durante a suplementação [50,51]. O processo flip-flop, oxidação lipídica, mudança de interações nos domínios lipídicos e sua distribuição são possíveis, mas como a biossíntese lipídica nos eritrócitos não ocorre, a composição qualitativa e quantitativa dos lipídios da membrana eritrocitária sob a influência dos extratos testados adicionados in vitro é muito improvável de ocorrer.

Em resumo, os extratos de U. tomentosa são incorporados principalmente temporariamente na membrana, e exatamente em sua monocamada externa. No entanto, em concentrações muito altas, eles podem penetrar mais profundamente na membrana e, finalmente, alterar a viscosidade dos eritrócitos. Com base nos resultados obtidos e em dados da literatura, consideramos que concentrações fisiológicas baixas dos compostos contidos nos extratos de U.tomentosa estarão na monocamada externa da membrana celular e protegerão os eritrócitos contra estresse oxidativo e danos.

4. Materiais e Métodos

4.1. Produtos químicos

5-ácido doxilesteárico (5-DSA),16-ácido doxilesteárico (16-DSA),4-hidroxi-2,2,6,{{ 8}}tetrametil piperidina-1-oxil(TEMPOL) foram comprados da Sigma-Aldrich, Saint Louis, MI, EUA. Outros produtos químicos foram obtidos de Roth, Karlsruhe, Alemanha, e Avantor Performance Materials Polônia, Gliwice, Polônia.

4.2.Material Biológico

4.2.1. Planta

A matéria-prima (casca e folhas) de U. fomentosa originária do Instituto Peruano de Investigaciones Fitoterapia Andina em Lima, Peru, foi gentilmente cedida por Wilcaccora

Centro Lomianki, Polônia. As características gerais deste material foram descritas anteriormente por Pilarski et al. [3].

Os materiais do comprovante foram depositados no Laboratório de Fitoquímica, Instituto de Química Bioorgânica, Academia Polonesa de Ciências, Poznan, Polônia.

Preparação das amostras: um grama da matéria-prima (casca e folhas) de U.tomentosa foi extraído com um volume de 10 mL de água ou etanol 96 por cento a 37 graus por 8 h. Em seguida, os extratos foram centrifugados a 4000 rpm por 15 min. Os sobrenadantes foram evaporados com Speed-Vac até a massa seca e, em seguida, dessecados com P2O5. Nestas condições, foram cobertos cerca de 111 mg de preparação por grama de casca e cerca de 158 mg de preparação por grama de folhas no caso de extração aquosa. Durante a extração com etanol a 96 por cento, foram obtidos 123 mg de preparação por grama de casca e 158 mg de preparação por grama de folhas. Foram obtidos quatro extratos, ou seja, extrato etanólico da casca (Bet), extrato aquoso da casca (Bag), extrato etanólico das folhas (Let), extrato aquoso das folhas (Lag). As preparações em pó foram armazenadas em geladeira em recipientes bem fechados, a partir dos quais as soluções estoque foram preparadas para cada experimento [19].

A composição qualitativa e quantitativa dos alcalóides oxindole contidos nos extratos de U. tomentosa foi determinada por meio de análise de impressões digitais por HPLC. As características gerais dos alcalóides quantitativos deste material foram descritas anteriormente por nós na publicação de Bors et al. [18].

Uncarine F, speciophylline, mitraphylline, pteropodine/isomitraphylline e isopteropo-dine foram detectados em extratos de U.tomentosa. Mitrafilina e pteropodina/isomitrafilina são alcalóides, que são dominantes em extratos de folhas, enquanto pteropodina/isomitrafilina são dominantes em extratos de casca. Os extratos etanólicos foram caracterizados por um maior teor de alcalóides do que os extratos aquosos (Figura 5).

As características gerais da determinação quantitativa de polifenóis em extratos de U. tomentosa foram descritas anteriormente por nós [17]. A análise de HPLC/DAD revelou que os extratos etanólicos e aquosos da casca continham principalmente Procianidina B2 e C1, bem como (-)-epicatequina. Os derivados do ácido cafeico foram determinados apenas nos extratos aquosos das folhas, enquanto o ácido clorogênico, flavonóis e proantocianidinas poliméricas estavam contidos em todos os extratos estudados. As maiores concentrações totais de fenóis livres foram determinadas nos extratos etanólicos da casca. O alto teor de compostos fenólicos também foi detectado no extrato etanólico das folhas, enquanto a menor concentração fenólica foi detectada no extrato aquoso da casca e nos extratos etanólicos das folhas (Figura 6).

Finalmente, todos os extratos foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO). A solução obtida foi adicionada em um pequeno volume de 1 μL a 1 mL de suspensão de eritrócitos (a concentração de DMSO não influenciou a membrana celular). Os eritrócitos suplementados apenas com DMSO foram usados ​​como controles.

4.2.2. Isolamento de Eritrócitos

Um leucocito-buffy coat foi obtido a partir de sangue coletado no Banco de Sangue em Lodz, Polônia. A camada leucocitária foi centrifugada (3000 rpm durante 10 min a 4 graus) e lavada duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4).

Eritrócitos isolados suspensos em PBS foram incubados por 2, 5 e 24 h com quatro tipos de extratos (extratos etanólicos e aquosos da casca e extratos etanólicos e aquosos das folhas） nas concentrações de 100 ug/mL, 250 ug/mL e 500 ug/mL.Estudos anteriores mostraram que os extratos estudados nessas concentrações não causaram danos aos eritrócitos, enquanto exibiram um efeito protetor nas hemácias [17,19,22].

4.3. Fluidez da Membrana

A fluidez da membrana eritrocitária foi determinada por meio de espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica (EPR) (Brucker 300 Spectrometer, Alemanha) usando 5-ácido doxilesteárico (5-DSA) e 16-ácido doxilesteárico ( 16-DSA)rótulos de rotação. A partir dos espectros de EPR obtidos para o rótulo de spin 5-DSA, o parâmetro de ordenação S foi calculado. Os tempos de correlação TB e TC foram calculados a partir dos espectros de EPR obtidos para o rótulo de spin 16-DSA. O parâmetro de ordenação Sas bem como os tempos de correlação TB e tc mostram a correlação inversa com a fluidez da membrana. O parâmetro de ordem S e os tempos de correlação tB e tc foram calculados conforme descrito no estudo de Koter et al. [52].

4.4. Viscosidade interna dos glóbulos vermelhos

O marcador de rotação TEMPOL foi usado para determinar a viscosidade interna dos eritrócitos [53]. A solução de TEMPOL (20 mM) dissolvida em solução salina tamponada (PBS) foi adicionada à suspensão de eritrócitos com 50 por cento de hematócrito. Após uma incubação 30-min, os eritrócitos foram lavados três vezes com solução de K3Fe(CN6 80 mM para reduzir o sinal do marcador de spin localizado no espaço intercelular. Com base no espectro obtido para TEMPOL em água e em eritrócitos , o tempo de correlação rotacional foi determinado de acordo com a fórmula:

-(2)"-1

(1)

onde: k—constante para o rótulo de spin do nitróxido, k=6.5×10-9s mT-l, ho—a altura da linha central, h_1—altura do alto- linha de campo, Wo—largura da linha central.

A viscosidade relativa foi determinada a partir da fórmula:

TR

_C

(2)"1 B

onde: TR—tempo de correlação rotacional do marcador em eritrócitos, TB—tempo de correlação rotacional do marcador em PBS, c—viscosidade interna do eritrócito,1B—viscosidade PBS (valor 1 foi assumido).

4.5. Fragilidade Osmótica

Após a incubação dos eritrócitos com extratos de U. tomentosa, as células foram centrifugadas a 3000rpm por 10min a 4 graus. As células foram então lavadas com solução de NaCl a 0,9 por cento. Este passo foi repetido duas vezes. Após a remoção do sobrenadante, os RBCs foram suspensos em uma solução de NaCl na faixa de concentração de 0,2 a 0,9 por cento (15 pontos foram selecionados). As células foram incubadas por 30 min a 37 graus e depois centrifugadas a 3000 rpm por 10 min a 4 graus C. A densidade óptica do sobrenadante foi medida a 540 nm (Adobe) usando um leitor de absorbância de microplacas (BioTek Elx808, BIOTEK).

A hemólise em cada tubo foi expressa em porcentagem, considerando a hemólise em água destilada como 100 por cento (A100 por cento):

×100 (3)

Porcentagem de hemólise (% o)= Aole

A100

4.6. Análise estatística

Os resultados foram apresentados como média ± SD alcançada de 4 a 6 experimentos individuais (4-6 doadores de sangue), enquanto para cada indivíduo (doador), o ponto experimental foi um valor médio de 2-3 replicações. As diferenças médias de comparações múltiplas entre os grupos foram analisadas por análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida de teste post hoc de Tukey. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas para p<0.05. all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" statistica="" software(statsoft,="" inc,="" tulsa,="" va,="">

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