Desafios e dificuldades encontrados na aplicação da Terapia Celular CAR-T

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A imunoterapia de células T de receptor de antígeno quimérico (célula T de receptor de antígeno quimérico, CAR-T) é a engenharia genética de células T isoladas de pacientes ou doadores alogênicos para expressar o receptor de antígeno quimérico (receptor de antígeno quimérico). receptor, CAR), uma terapia celular adotiva que reconhece e mata especificamente células tumorais. CAR-T é um dos maiores avanços no campo da imunoterapia do câncer nos últimos anos. Apresenta grandes vantagens no tratamento de neoplasias hematológicas e tem amplas perspectivas de desenvolvimento. Atualmente, a terapia com células CAR-T também enfrenta grandes desafios. O conteúdo a seguir levará você a entender os desafios enfrentados pela terapia com células CAR-T, identificar os mecanismos que levam a limitações e superar esses obstáculos, para que as células CAR-T possam exercer melhor seu potencial, otimizar estratégias de tratamento e melhorar os resultados dos pacientes. Vários fatores-chave que afetam a eficácia da terapia com células CAR-T incluem a fabricação de células CAR-T, o gerenciamento de efeitos colaterais tóxicos e a recorrência de resistência a medicamentos.

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1 Problema na Fabricação de Células CAR-T

Os desafios enfrentados pela fabricação de células CAR-T envolvem vários links, como aquisição, isolamento e triagem de células T, transdução, expansão de cultura e seleção inicial de fenótipo de células T. Através da otimização de métodos em cada link, os produtos de células CAR-T podem ser realizados com maior eficácia clínica e menos efeitos colaterais tóxicos. Atualmente, as células CAR-T aprovadas pelo FDA são todas autólogas e não há risco de rejeição alogênica e doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD), mas é difícil de obter e a qualidade da célula muitas vezes não está disponível . Assegurar. Usar células de doadores saudáveis ​​para produzir produtos CAR-T é uma solução para o problema de fontes de células CAR-T de baixa qualidade. Os primeiros estudos clínicos demonstraram a viabilidade do uso de células CAR-T derivadas de doadores em pacientes com recidiva da doença após transplante alogênico com menor risco de DECH. Além disso, as células T derivadas de doadores facilitam o desenvolvimento de produtos CAR-T universais, o que é de grande importância para superar os problemas existentes de fontes insuficientes de células CAR-T, baixa qualidade e longos ciclos de produção, mas são necessárias modificações genéticas adicionais para reduzir o risco de rejeição imune e GVHD. Além disso, as estruturas CAR geralmente contêm sequências exógenas. Devido à dificuldade de preparação, a maioria dos scFvs de células CAR-T são de origem murina e são imunogênicas. Anticorpos humanos anti-ratinho contra scFv foram detectados em pacientes tratados.

Estudos mostraram que o fenótipo inicial de células T dos produtos de células CAR-T desempenha um papel importante nas respostas clínicas subsequentes. Fenótipos de células T específicos, como células T de memória central, células T de memória semelhantes a haste e células T precursoras, podem melhorar a capacidade de expansão e a persistência das células T CAR. Um estudo de terapia com células CAR-T direcionadas a CD19-em pacientes com LLC descobriu que a população de células CAR-T de respondedores tinha expressão gênica relacionada a células T de memória abundante em comparação com não respondedores. Outra equipe de pesquisa induziu a proteína CAR a entrar em um estado quiescente, forçando a regulação negativa da proteína CAR através de um sistema regulador de drogas ou dasatinib, obtendo assim um fenótipo semelhante à memória, revertendo com sucesso o fenótipo e as características transcricionais de células CAR-T esgotadas , e, em seguida, restaurar a função antitumoral das células CAR-T.

Além disso, o momento da infusão de células CAR-T também tem um impacto importante na resposta ao tratamento. Ao encurtar o ciclo de produção de células CAR-T por meio de otimização tecnológica, espera-se reduzir o atraso da doença dos pacientes e beneficiar mais pacientes. Além disso, os genes que codificam as estruturas CAR são geralmente transduzidos em células T por retrovírus ou lentivírus, mas com o desenvolvimento de sistemas de transposons, é mais econômico usar transposons em vez de vetores virais para produção de células CAR-T. Atualmente, o sistema de transposon da Bela Adormecida tem sido aplicado à fabricação de células CAR-T direcionadas a CD19-.

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2 Efeitos tóxicos e colaterais da terapia com células CAR-T

Quase todos os pacientes tratados com células CAR-T direcionadas a CD19-desenvolveram efeitos colaterais tóxicos de vários graus, incluindo síndrome de liberação de citocinas (CRS) e síndrome de neurotoxicidade associada a efetores imunes, ICANS), etc., esta última também conhecida como neurotóxica efeitos colaterais. A Sociedade Americana de Transplante e Terapia Celular (ASTCT) desenvolveu e publicou recomendações de classificação padronizadas para CRS e ICANS, que têm significado orientador para o manejo e tratamento da toxicidade do CAR-T.

Os sintomas clínicos da RSC geralmente começam com febre, e casos graves podem levar à resposta inflamatória sistêmica, hipotensão, hipóxia e falência de órgãos. A ICANS se manifesta principalmente como encefalopatia tóxica, casos graves podem levar a convulsões, edema cerebral e coma. A maioria dos pacientes com ICANS tinha história de RSC, sugerindo que a RSC pode atuar como fator iniciador ou fator promotor de ICANS. Se os primeiros sintomas de SRC e ICANS puderem ser detectados e intervindos com eficácia, o curso clínico de ambos é reversível, mas a RSC e ICANS graves podem ser fatais. Compreender os mecanismos fisiopatológicos da CRS e ICANS é útil para o desenvolvimento de drogas direcionadas para suprimir a toxicidade das células CAR-T com base na retenção da atividade antitumoral das células CAR-T tanto quanto possível. A CRS está associada a níveis elevados de várias citocinas, entre as quais a IL-6 é uma importante molécula imune mediadora da CRS. O tocilizumab, que bloqueia o receptor IL-6, é atualmente o principal tratamento para RSC. Ensaios pré-clínicos mostraram que a SRC é desencadeada por uma rede multicelular de células CAR-T e células hospedeiras, com o sistema monócito-macrófago desempenhando um papel central no processo de ativação. A IL-1 é um dos principais produtos de citocinas do sistema monócito-macrófago, e pode estar envolvida no elo de condução da RSC, e o bloqueio desse alvo é eficaz no alívio da RSC. TNF, interferon- (IFN-), fator estimulador de colônias de granulócitos/macrófagos (GM-CSF) e outras citocinas pró-inflamatórias também estão envolvidos no processo de RSC, podendo ser o alvo do potencial. Atualmente, a RSC de baixo grau é tratada principalmente com tratamento antipirético e de suporte, e outras complicações que podem levar à febre, como infecção, são prevenidas ativamente. Para RSC moderada a grave, geralmente utiliza-se tocilizumabe, e os esteróides são usados ​​seletivamente como terapia adjuvante de acordo com a condição do paciente, sendo o efeito mais significativo. Para pacientes com SRC grave, geralmente são usados ​​esteróides para inibir a proliferação e secreção de citocinas de células CAR-T e outras células "espectadoras". Deve-se notar que os esteróides não podem ser usados ​​em grandes doses, e seu efeito inibitório sobre o sistema imunológico levará a uma diminuição na eficácia do CAR-T. Alguns inibidores de moléculas pequenas, como ruxolitinib e ibrutinib, podem inibir extensivamente a produção e a transdução de sinal de várias citocinas e podem se ligar a vários alvos, regulando assim a função imunológica das células CAR-T e reduzindo os efeitos colaterais.

O mecanismo de ICANS pode estar relacionado ao acúmulo de células CAR-T e citocinas pró-inflamatórias no sistema nervoso central. Estudos pré-clínicos observaram uma correlação entre o número de células CAR-T no líquido cefalorraquidiano e o nível de citocinas e a gravidade da ICANS. A incidência de ICANS na terapia CAR-T direcionada a CD19-é maior do que na terapia com células CAR-T direcionadas a CD22-, o que pode ser porque o CD19 é expresso em células parietais mediais do cérebro humano. O método de tratamento clínico para pacientes com ICANS é administrar esteróides, e a dosagem deve ser a mais baixa para evitar o impacto na eficácia do CAR-T e imunossupressão grave. O tocilizumab tem obtido bons resultados no tratamento da RSC, mas seu efeito sobre o ICANS é muito limitado, o que pode estar relacionado à sua dificuldade de passagem pela barreira hematoencefálica.

Os efeitos colaterais tóxicos são atualmente um fator importante que limita a eficácia do CAR-T, dificultando o aumento do efeito antitumoral das células CAR-T, aumentando a dose de células CAR-T ou aumentando a atividade efetora. Acredita-se que a alta carga tumoral, idade avançada e pré-condicionamento linfodepletor de alta intensidade estejam associados à ocorrência de efeitos colaterais imunotóxicos. Com o aumento dos casos de tratamento e a extensão do tempo de seguimento, surgiram mais efeitos tóxicos e colaterais, como linfo-histiocitose hemofagocítica/toxicidade semelhante à síndrome de ativação de macrófagos, disfunção imune relacionada à anemia aplástica de células B Estado danificado complicado por infecção fatal, fatal edema cerebral, etc. Estudos existentes descobriram que a adição de genes suicidas, como caspase induzível-9 ou timidina quinase do vírus herpes simplex, ao CAR é uma maneira possível de reduzir os efeitos colaterais citotóxicos do CAR-T, mas causar depuração irreversível das células CAR-T e reduzir a resistência. Eficácia do tumor.

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3 Recaída da resistência ao medicamento após terapia com células CAR-T

Embora as células CAR-T tenham feito grandes avanços no tratamento de malignidades hematológicas, entre os pacientes que recebem terapia com células CAR-T direcionadas para CD19-, a taxa de recidiva de resistência a medicamentos é de 30% a 50%, e a maioria das recaídas ocorrem 12 anos após o tratamento. dentro de um mês. No entanto, esse tipo de recaída não é apenas para o alvo CD19, e estudos relacionados em outros alvos, como CD22 e BCMA, também provaram que a recaída resistente a medicamentos é um grande desafio comumente enfrentado pela terapia com células T CAR. Atualmente, os eventos de recaída são geralmente divididos em recaída de antígeno negativo e recaída de antígeno positivo.

O mecanismo primário de recaída de antígeno negativo é a perda de antígeno. Mecanismos atualmente reconhecidos de perda de antígeno incluem mutações de splicing, epítopo críptico e alterações de linhagem celular devido à perda de epítopos alvo. No entanto, mesmo que o antígeno não seja completamente perdido, a expressão ou densidade reduzida do antígeno através da imunomodulação é suficiente para permitir que as células tumorais escapem. Em um ensaio clínico usando células CAR-T direcionadas a CD22-para tratar pacientes com leucemia, descobriu-se que pacientes com leucemia com antígenos positivos recaíram, sugerindo que a manutenção da atividade das células CAR-T precisa atingir o limite mínimo de expressão do antígeno . Espera-se que as células CAR-T direcionadas multimoleculares combinatórias superem o escape de células tumorais da perda de antígeno ou mecanismos de regulação negativa. Para pacientes que recidivam após terapia com células CRA-T direcionadas a CD19-, o CD22 é o alvo ideal porque a maioria dos pacientes CD19-negativos permanece positiva para a expressão de CD22. Em ensaios clínicos, as células CAR-T direcionadas ao CD22 foram eficazes no tratamento de pacientes com linfoma de células B CD{14}}negativo e leucemia recidivante, mas no processo de imunoterapia sequencial, a recaída da resistência a medicamentos causada pela regulação negativa de A expressão de CD22 por células tumorais também foi encontrada. Portanto, o desenvolvimento de células CAR-T que visam simultaneamente CD19 e CD22 pode ter maior potencial na superação da resistência a drogas. Além da seleção de antígenos-alvo, também é necessário prestar atenção ao mecanismo preciso do CAR-T na formação de sinapses imunes e na morte de células-alvo. TCRs naturais podem reconhecer antígenos em níveis de baixa densidade, e especula-se que diferenças estruturais entre CARs e TCRs naturais podem levar a diferenças nos requisitos para densidade de reconhecimento de antígeno.

Vale ressaltar que nem todos os pacientes recidivantes são negativos para CD19, o que também mostra que, além da perda de antígeno e do escape de células tumorais, existem outros fatores que levam à resistência ao CAR-T. A principal causa da recaída do antígeno positivo é a exaustão das células CAR-T, que leva ao declínio da autofunção devido à exposição prolongada a altos níveis de antígeno. Acredita-se geralmente que a transdução de sinal independente de antígeno de células CAR-T está intimamente relacionada à exaustão celular, e a alta carga tumoral também é um fator importante que leva à exaustão. A tecnologia de bloqueio de checkpoint imunológico combinada com células CAR-T promete superar a exaustão e melhorar o efetor e a persistência das células CAR-T. A co-expressão do receptor de IL-7 com o CAR pode evitar a estimulação de células "espectadoras" e melhorar a capacidade proliferativa, atividade antitumoral e persistência das células CAR-T. A estrutura CAR das células CAR-T contém componentes não próprios, que são imunogênicos e podem induzir imunidade anti-CAR humoral e celular, limitando assim a eficácia e afetando a capacidade proliferativa e a persistência das células CAR-T. Estudos mostraram que 5% dos pacientes com DLBCL e 36,7% dos pacientes com B-ALL têm níveis aumentados de anticorpos anti-CAR após a infusão de células CAR-T. O pré-tratamento com ciclofosfamida ou fludarabina é considerado um fator importante na redução do grau de imunidade celular anti-CAR. O desenvolvimento de produtos humanizados CAR-T é um meio eficaz para resolver este problema, que tem demonstrado eficácia duradoura na LLA-B recidivante/refratária em ensaios clínicos. O domínio coestimulador na estrutura CAR também afeta a persistência das células CAR-T. Em geral, acredita-se que, em comparação com o domínio coestimulatório 4-1BB, os CARs derivados de CD28-são menos duráveis ​​e mais propensos à exaustão; enquanto as células CAR-T contendo o domínio coestimulador 4-1BB apresentam níveis mais elevados de proteínas antiapoptóticas BCL-2 e BCL-XL, e pode haver um mecanismo para promover a formação de células T de fenótipo de memória. As melhorias atualmente em ensaios clínicos incluem o uso de células apresentadoras de antígenos artificiais para ativar células CAR-T, regulação de fenótipos CAR-T e inibição combinada de moléculas de checkpoint imunológico. Os resultados valem a pena esperar.

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