Carvedilol, um bloqueador adrenérgico, suprime a síntese de melanina ao inibir a via de sinalização CAMP/CREB em melanócitos humanos e cultura de pele humana ex vivo

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Myoung Eun Choi 1,†, Hanju Yoo 1,2,†, Ha-Ri Lee 2,3, Ik Joon Moon 1, Woo Jin Lee 1, Youngsup Song 3,*,‡ e Sung Eun Chang 1

Abstrato:As catecolaminas funcionam via receptores acoplados à proteína G, desencadeando um aumento nos níveis intracelulares de 30, 50-monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) em várias células. A biossíntese de catecolaminas e o receptor -adrenérgico existem emmelanócitos; assim, as catecolaminas podem desempenhar papéis críticos na pigmentação da pele. No entanto, sua ação e mecanismos mediadores da melanogênese na pele humana ainda não foram investigados. Portanto, examinamos o potencial efeito anti-melanogenético do carvedilol, um -bloqueador não seletivo com atividades 1-de bloqueio fracas. Carvedilol reduziu o conteúdo de melanina e a atividade celular da tirosinase sem comprometer a viabilidade celular em humanos normaismelanócitosbem como em melanócitos de camundongo imortalizados por Mel-Ab. Fator de transcrição associado à microftalmia (MITF) regulado negativamente, tirosinase, proteína relacionada à tirosinase (TRP)-1 e TRP-2. O tratamento com carvedilol levou à regulação negativa da proteína de ligação ao elemento de resposta de fósforo-cAMP (CREB). Além disso, o aumento dos níveis de AMPc após o tratamento com forscolina reverteu a ação anti-melanogênica do carvedilol. Além disso, o carvedilol reduziu notavelmente o índice de melanina em culturas de pele humana irradiadas com ultravioleta. Em conjunto, nossos resultados indicam que o carvedilol suprime efetivamente a melanogênese em humanos.melanócitose pele humana ex vivo por inibição da sinalização de cAMP/proteína quinase A/CREB. Os efeitos anti-melanógenos do carvedilol têm significado potencial para a pelebranqueamentoagentes.

Palavras-chave:carvedilol; bloqueador adrenérgico;síntese de melanina; Sinalização de cAMP/CREB

Cistancheé capaz de inibir a síntese de melanina

1. Introdução

Uma ampla gama de distúrbios pigmentares da pele tem um impacto psicológico e social significativo nos pacientes. Várias modalidades de tratamento, incluindo agentes sistêmicos e tópicos, bem como terapia a laser, foram desenvolvidas [1-3]. No entanto, os resultados são muitas vezes insatisfatórios e reações adversas, como hiperpigmentação pós-inflamatória (PIH) e hipopigmentação, do tratamento são comuns. Além disso, o tratamento é caro e demorado [4-6].

As catecolaminas, que incluem dopamina, epinefrina e norepinefrina, são moléculas sinalizadoras que atuam como neurotransmissores e hormônios endócrinos. Na pele, a biossíntese e degradação de catecolaminas ocorrem nos queratinócitos humanos, mas a síntese de catecolaminas nos melanócitos é um pouco diferente [7-9]. As catecolaminas funcionam através de receptores acoplados à proteína G (GPCRs). A ligação das catecolaminas aos GPCRs desencadeia a ativação da adenilatociclase intracelular, que sintetiza 30, 50-monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) a partir do ATP [10]. O segundo mensageiro AMPc exerce sua atividade ligando-se à subunidade R da proteína quinase A (PKA), resultando na fosforilação da proteína de ligação ao elemento de resposta do AMPc (CREB). Os GPCRs são ativados por aminas e peptídeos, incluindo glucagon, hormônio da paratireoide, secretina e calcitonina.

Os antagonistas dos receptores adrenérgicos incluem antagonistas dos receptores - e -receptores. -Os antagonistas dos receptores são subcategorizados em não seletivos, 1-seletivos e 2-agentes seletivos, enquanto os antagonistas dos receptores são subclassificados como não seletivos, 1-seletivos e 2-seletivos agentes baseados em suas atividades de bloqueio seletivo. Ao contrário dos antagonistas de receptores não seletivos de primeira geração, como propranolol, timolol e nadolol, o carvedilol é um bloqueador não seletivo de terceira geração que exibe ações vasodilatadoras bloqueando 1-adrenorreceptores ( 1-ARs) [11]. Portanto, carvedilol é um -bloqueador não seletivo com atividades 1-de bloqueio fracas [12]. É usado principalmente como medicação oral para controlar a pressão arterial elevada e doenças cardíacas congestivas, semelhante a outros bloqueadores [12]. No entanto, os bloqueadores de terceira geração exibem atividades angiogênicas, antioxidantes, antiproliferativas, anti-hipertróficas e antiapoptóticas que requerem maior elucidação [11]. Na área dermatológica, devido às suas ações antioxidantes e anti-inflamatórias, o carvedilol é frequentemente utilizado em formulações orais para o tratamento da rosácea eritematotelangiectásica [13,14]. Além disso, a atividade antioxidante do carvedilol resulta na prevenção da carcinogênese cutânea induzida por ultravioleta (UV), tornando-o um agente atraente no tratamento de doenças de pele associadas à radiação UV [15-18]. No entanto, os efeitos quimiopreventivos do carvedilola não são mediados diretamente pelos RAs. [19] Embora o mecanismo exato seja relativamente desconhecido, a via de sinalização de AMPc/PKA e PKC-δ pode estar relacionada às propriedades do carvedilol contra metástases cutâneas [20].

Nos estágios iniciais da investigação da pigmentação,melanócitosforam encontrados para expressar -1-sinalização AR após indução extracelular com norepinefrina. No entanto, -ARs não foram encontrados após estimulação com sinalização adrenérgica emmelanócitos[8]. Por outro lado, Cillbro et al. posteriormente demonstrou que existe um sinal funcional específico 2-AR nos melanócitos humanos e que a estimulação 2-AR leva à pigmentação através da via 2-AR/cAMP [7]. Portanto, foi sugerido o papel das catecolaminas no controle da pigmentação, sendo o AMPc considerado o principal eixo para o controle das catecolaminas da melanogênese.

A melanogênese é um processo complexo que envolve inúmeras vias. Tirosinase, proteína 1 relacionada à tirosinase (TRP-1), e TRP-2, também chamada de dopacromo tautomerase (DCT), são as três principais enzimas específicas de melanócitos envolvidas nasíntese de melanina[21]. A melanogênese é induzida ou inibida por vários fatores, incluindo hormônios, citocinas, neurotransmissores, fatores de crescimento e micromoléculas.

O regulador positivo mais importante é o receptor de melanocortina-1 e seus ligantes, melanocortina e hormônio adrenocorticotrófico [23]. No entanto, diversos fatores envolvidos na melanogênese são endorfinas, estrogênios, andrógenos, vitamina D3 e catecolaminas. Evidências cumulativas sugerem que a L-tirosina e a L-DOPA, que são substratos e intermediários da melanogênese, atuam como indutores e reguladores positivos da via melanogênica, além de reguladores de outras funções celulares [24]. Além disso, Jeff Howe et al. sugeriram que a indução e regulação da melanogênese pela L-tirosina é mediada pela ativação direta dos receptores adrenérgicos pela L-tirosina, e não causada por seus produtos metabólicos, como as catecolaminas [25]. Em seus estudos, a norepinefrina e a epinefrina estimularam a atividade da tirosinase, mas seu efeito indutor nasíntese de melaninafoi comparativamente inferior à L-tirosina [25].

As catecolaminas podem desempenhar papéis importantes no sistema de pigmentação da pele; entretanto, seus efeitos na melanogênese em relação à ação do -bloqueador não seletivo de terceira geração ainda não foram explorados. Portanto, no presente estudo, nosso objetivo foi investigar se o carvedilol afeta a melanogênese e explorar seus mecanismos de ação em humanos.melanócitose pele humana ex vivo e seu uso potencial comobranqueamentoprodutos.

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2. Resultados

2.1. Carvedilol suprime a melanogênese

A citotoxicidade do carvedilol contra humanos normaismelanócitos(NHMs) e células Mel-ab foi avaliada por um ensaio de proliferação de células WST. Uma concentração de carvedilol de 10 µM começou a mostrar citotoxicidade contra NHMs e células Mel-ab (Figura 1A, B). Portanto, em avaliações posteriores, usamos 8 µM de carvedilol, que não é citotóxico para NHMs.

O tratamento com carvedilol diminuiu o conteúdo de melanina de forma dose-dependente sem afetar a viabilidade dos NHMs (Figura 1C). O teor de melanina foi diminuído em 28,36 por cento após o tratamento de 96 hof 8 µM com carvedilol (Figura 1C). A adição de 100 mg/mL de arbutina reduziu o teor de melanina em menor grau do que o carvedilol (Figura 1C). Após 4 dias de tratamento com carvedilol, o conteúdo de melanina diminuiu de forma tempo-dependente (Figura 1D). No entanto, o tratamento com forscolina (FSK) por 4 dias após o pré-tratamento com carvedilol induziu um aumento no conteúdo de melanina (Figura 1E). FSK aumenta a transcrição de MITF em maior grau em 2 h em NHMs e acredita-se que funcione através do AMPc Via /PKA/CREB (Figura 1F).

2.2. Carvedilol inibe a expressão de MITF e seus genes alvo e diminui os níveis de fosfo-CREB em NHMs

Como o carvedilol diminuiu o acúmulo de melanina, investigamos a atividade da tirosinase celular. O tratamento com carvedilol diminuiu a atividade da tirosinase celular de maneira dose-dependente em NHMs (Figura 2A). A atividade da tirosinase diminuiu 28,48 por cento após 96 h de tratamento com 8 µM de carvedilol (Figura 2A). Em seguida, determinamos se o carvedilol afeta a expressão de MITF, que desempenha um papel crucial na regulação da tirosinase e dos genes melanogênicos a jusante. O tratamento com FSK aumentou os níveis de AMPc intracelular e reverteu as ações anti-melanogênicas do carvedilol. O carvedilol reduziu significativamente os níveis de proteína de MITF, um fator de transcrição central da melanogênese, em 72 h (Figura 2B). Além disso, a expressão de seus genes-alvo, como tirosinase e TRP-1, foi diminuída após o tratamento com carvedilol (Figura 2B). Esses resultados indicam que o carvedilol inibe a melanogênese pela regulação negativa da sinalização do MITF.

Em seguida, investigamos as vias de sinalização intracelular da melanogênese, que regulam a transcrição de MITF, medindo os níveis de expressão de fosfo-CREB e fosfo-ERK. Os níveis de fosfo-ERK não mudaram ao longo do tempo após o tratamento com carvedilol; entretanto, os níveis de fosfo-CREB estavam diminuídos (Figura 2B). Consistente com observações anteriores, nossos resultados revelaram que o carvedilolin inibe a melanogênese inibindo a via de sinalização cAMP/PKA/CREB. Além disso, o tratamento com FSK reverteu a ação anti-melanogenica do carvedilol aumentando os níveis de cAMP.

2.3. Índice de Melanina e Coloração Imuno-histoquímica em Cultura de Pele Humana Ex Vivo

A densidade de melanócitos epidérmicos e o índice de melanina em cortes de tecido de cultura de pele humana ex vivo foram detectados pela coloração de Melan-A e Fontana-Masson, respectivamente. O carvedilol não afetou o número de Melan-A (mais)melanócitosna amostra tratada com carvedilol mais radiação UV (UVR) em comparação com a amostra tratada apenas com UVR (Figura 3A). Os melanócitos HMB45(mais) podem indicar que a atividade melanocítica aumentou após o tratamento com UVR e foi inversamente regulada negativamente após o tratamento com carvedilol (Figura 3B). No entanto, o conteúdo de melanina foi significativamente reduzido em espécimes tratados com carvedilol mais RUV em comparação com espécimes tratados apenas com RUV (Figura 3C). Para o cálculo do índice de melanina, foi calculada e comparada a fração da área corada de Fontana–Masson sobre a área total entre uma amostra exposta à RUV e aquela ao carvedilol mais RUV foi calculada e comparada (Figura 3D). Os lisados ​​celulares de cada espécime foram analisados ​​por Western blotassay, que revelou que a tirosinase, TRP1 e DCT foram aumentadas por UVR e reguladas negativamente pelo tratamento com carvedilol (Figura 3E). Como resultado, o carvedilol reduziu notavelmente o índice de melanina e as proteínas relacionadas à melanogênese, mostrando seu efeito anti-melanógeno na pele humana tratada com UVR.

3. Discussão

A melanina é o pigmento responsável pela cor da pele e do cabelo e é sintetizada nos melanossomas pormelanócitos. Embora a melanina epidérmica desempenhe um importante papel protetor contra a RUV, a superprodução e o acúmulo de melanina na pele causam distúrbios hiperpigmentares da pele problemáticos, como PIH, despigmentação associada ao fotoenvelhecimento, melasma e lentigos solares [18,26]. Portanto, a inibição da melanogênese tem sido o foco de tratamentos medicinais e cosméticos para a beleza e saúde da pele. Esforços consideráveis ​​foram feitos para identificar agentes anti-pigmentação novos e eficazes. No entanto, os mecanismos anti-melanogênese dos agentes específicos são atualmente incertos e geralmente têm sido avaliados em células de camundongos, o que produz resultados que nem sempre são consistentes com os de testes em pele humana [27,28]. Além disso, como a melanogênese dos melanócitos é fortemente regulada por queratinócitos e outras células vizinhas, células humanas co-cultivadas ou pele humana ex vivo são cenários experimentais mais confiáveis ​​para a exploração debranqueamentoagentes [29]. A maioria dos agentes clareadores da pele, sejam naturais ou quimicamente derivados, pode causar toxicidade ou irritação na pele, o que pode ser previsto até certo ponto usando ensaios de viabilidade celular in vitro com melanócitos. Em nosso estudo, o carvedilol não apresentou citotoxicidade quando usado em doses moderadas.

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Cremes tópicos de hidroquinona podem resultar em distúrbios indesejáveis ​​de hipopigmentação e toxicidade cutânea [30-32]. Além disso, algunsbranqueamentocosméticos têm consequências desastrosas por induzir hipopigmentação através da degradação de proteínas tirosinase [33-35]. Agentes clareadores podem ser usados ​​em doses mais altas dependendo do usuário para maximizar o clareamento de lesões hiperpigmentares. Portanto, os esforços para descobrir agentes clareadores de pele seguros e saudáveis ​​estão continuamente em exploração.

Portanto, o presente estudo foi projetado para ser realizado em células humanas normais e pele humana ex vivo. Além disso, com base no mecanismo de ação de sinalização G estabelecido pelas catecolaminas, que aumenta o nível de cAMP celular, acreditamos que um bloqueador adrenérgico poderia diminuir os níveis de cAMP e inibir a via de sinalização UVR/cAMP/CREB, que é o principal mecanismo para a hiperpigmentação cutânea induzida por UV [36,37]. Portanto, hipotetizamos que os bloqueadores adrenérgicos que diminuem os níveis de AMPc reduzemsíntese de melanina.

Além disso, para desenvolver segurançabranqueamentoagentes, mecanismos confiáveis ​​e reprodutíveis de anti-melanogênese devem ser perseguidos em paralelo. O estímulo fisiologicamente mais significativo é o UV, e entre a sinalização do UVR para a epidermemelanócitos, o eixo CREB é a via mais estabelecida para a regulação da melanogênese na epiderme humana [29]. A exposição ao UV ativa sucessivamente a produção de AMPc, PKA e o fator de transcrição CREB, que, por sua vez, induz a expressão de MITF e genes melanogênicos alvo a jusante [38,39]. Além da fosforilação de CREB por PKA, estudos recentes demonstraram que o recrutamento de coativador de transcrição regulado por CREB (CRTC) 3 para o complexo de transcrição de CREB também é necessário para MITF estimulado por cAMP. O MITF desempenha o papel mais essencial na regulação desíntese de melaninae a transcrição resultante de enzimas melanogênicas [26,40,41]. Durante este processo de sinalização intracelular, a melanogênese é regulada por uma enzima chave, tirosinase e proteínas enzimáticas adicionais, como TRP-1 e DCT [1–4]. indica que reduziu as proteínas MITF e tirosinase ao inibir a transcrição de MITF (Figura 4). Considerando que a regulação do gene do mRNA do MITF é intrinsecamente controlada e resgatada por outras moléculas de sinalização intracelular e coativadores, a regulação do nível transcricional do MITF é uma estratégia promissora para explorar ingredientes de clareamento da pele saudável, pois a função de sobrevivência do MITF é preservada e resgatada [1,38,40]. De fato, quando investigamos a transcrição de MITF induzida por FSK, o mRNA de MITF mostrou ter sua própria curva de resposta de pico para melanogênese e sobrevivência celular para homeostase celular. As funções biológicas demelanócitosparecia ser intrinsecamente regulado por outros sinais de feedback em melanócitos humanos. Além disso, o carvedilol apresenta menor risco de eventos adversos de hipopigmentação, pois atenua a atividade da tirosinase celular ao longo do tempo, e não abruptamente.

As catecolaminas incluem dopamina, epinefrina e norepinefrina e são sintetizadas a partir da tirosina dietética pela ação de enzimas [42]. A biossíntese e degradação de catecolaminas ocorrem em uma ampla gama de células, incluindo os neurônios dos nervos simpáticos e do cérebro, células adrenomedulares, células endoteliais, neutrófilos e células mononucleares [43-45]. Na pele humana, a síntese de catecolaminas ocorre nos queratinócitos. Por outro lado, os melanócitos também expressam mRNA e enzimas para a síntese autócrina de norepinefrina, mas não de epinefrina [7,42]. Em humanosmelanócitos, -1-AR pode ser importante na reação à norepinefrina, massíntese de melaninatambém é influenciado por 2-ARsignaling funcional [7,8]. Curiosamente, pacientes com vitiligo têm densidade aumentada de 2-AR em queratinócitos [46]. Níveis aumentados de norepinefrina são encontrados na urina e plasma de pacientes com vitiligo não segmentar, o que implica que o metabolismo das catecolaminas pode estar associado ao desenvolvimento e progressão do vitiligo [47]. Além dos neurotransmissores clássicos de estresse, os melanócitos produzem neuropeptídeos e hormônios, como fator liberador de corticotropina e pró-opiomelanocortina. Essa produção é estimulada pela RUV e outros agentes que atuam no sistema neuroendócrino da pele [48]. Portanto, a ação das catecolaminas e a função melanocítica estão intimamente relacionadas em uma variedade de vias complexas. Além disso, o carvedilol pode interferir nas reações químicas na via melanogênica e essa possibilidade deve ser mais estudada. O carvedilol pode ter vantagens, pois tem efeitos anti-inflamatórios simultâneos, pois a maioria dos distúrbios hiperpigmentares são HIP clínica ou subclínica em pacientes de pele escura. Como a permeação do carvedilol pela pele foi estudada tanto in vitro quanto ex vivo, o carvedilol pode ser desenvolvido comobranqueamentoagente no futuro [49-51].

A administração sistêmica de carvedilol pode causar bradicardia, tontura, hipotensão, cefaleia e tontura. A aplicação tópica de carvedilol não costuma causar sintomas sistêmicos, porém devemos prestar muita atenção a esses sintomas ao aplicá-lo em pacientes com barreiras cutâneas defeituosas, como aqueles com dermatite atópica. Além disso, eczema, prurido e erupção liquenóide são relatados em casos raros ao tomar carvedilol. Esses efeitos colaterais dermatológicos, bem como a dermatite de contato, também devem ser levados em consideração ao aplicar o carvedilol como agente tópico.branqueamentoagente.

Em conclusão, mostramos que o carvedilol reduziu efetivamente a melanogênese em humanosmelanócitose pele humana ex vivo pela inibição da via cAMP/CREB/MITF, o que sugere seu potencial uso como agente clareador eficaz. Uma investigação mais aprofundada do envolvimento funcional do receptor adrenérgico pelo carvedilol em melanócitos humanos deve seguir.

4. Materiais e Métodos

4.1. Materiais

Carvedilol, 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA), toxina da cólera (CT) e 12-Otetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) foram adquiridos da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EUA). O Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) e a solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco foram adquiridos da WelGENE (Daegu, Coréia). Soro fetal bovino (FBS), antibiótico-antimicótico e tripsina-EDTA foram adquiridos da Gibco (Grand Island, NY, EUA). Meio 254 (CascadeBiologics, Portland, OR, EUA) e FSK ([3R-(3,4a,5,6,6a,10,10a,10b)]-5-(Acetiloxi)-3-etenildodecahidro{ {24}},10,10b-trihidroxi-3,4a,7,7,10a-pentametil-1H-nafto[2,1-b]pirano-1-ona ) foram adquiridos da Tocris Bioscience (Bristol, Reino Unido).

4.2. Linhas de células e cultura de células

NHMs primários obtidos da Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA) foram mantidos em Meio 254 (Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA) suplementado com Suplemento de Crescimento de Melanócitos Humanos (Thermo Fisher). As células Mel-ab, uma linha celular de melanócitos imortalizada espontaneamente derivada de camundongo, foram obtidas do Korean Cell Line Bank (KCLB, Seul, Coréia) e mantidas em DMEM suplementado com 10 por cento de FBS, penicilina-estreptomicina, 100 nM TPA e 1 nM CT. Todas as células foram mantidas rotineiramente a 37 ◦C em um ambiente umidificado de 5% de CO2.

4.3. Anticorpos e Western Blots

As células foram lavadas uma vez com PBS frio e lisadas em tampão de lise de proteínas (1 por cento SDS em 1{10}} mMTris e 5 mM EDTA, pH 7,4), seguido de incubação a 98 ◦C por 10 min. As amostras de proteína foram separadas por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida a 8 por cento, transferidas para membranas de nitrocelulose (GE Healthcare Life Sciences, Chicago, IL, EUA) e depois bloqueadas com solução salina tamponada com Tris contendo 0,5 por cento de Tween 20 e 5 por cento de BSA e submetidos a immunoblotting. Os anticorpos tirosinase e TRP-1 foram adquiridos da Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, EUA), e o MITF foi adquirido da Abcam (Cambridge, Reino Unido). -tubulina (Gentex, Holanda, MI, EUA) foi usada como controle de carga interna.

4.4. Conteúdo de melanina

O efeito citotóxico do carvedilol foi avaliado usando o Ez-Cytox Cell Viability Assay Kit (Dogen-Bio Co., Ltd., Seul, Coréia) de acordo com as instruções do fabricante. Células Mel-Ab e NHMs foram semeadas em placas de seis poços a uma densidade de 6 × 105 e 3 × 105 células/poço, respectivamente. As células foram tratadas com carvedilol, conforme mostrado nas figuras, por 3 ou 5 dias (d). Antes de medir o teor de melanina, as células foram observadas em microscópio de contraste de fase e fotografadas (Olympus, Tóquio, Japão). As células foram dissolvidas em 550 µL de NaOH 1 N a 100 ◦C por 30 min e centrifugadas a 13,{16}} rpm por 5 min. A absorbância dos sobrenadantes foi medida a 405 nm por um leitor de microplacas. O conteúdo de melanina intracelular foi apresentado em porcentagem em relação ao controle não tratado das células. Arbutin (100 mg/mL) foi usado como controle positivo.

4.5. Atividade celular da tirosinase

A atividade da tirosinase foi avaliada medindo a taxa de formação de dopacromo de L-DOPA. Após a incubação com carvedilol, as células foram lavadas em PBS gelado e lisadas em tampão de lise de tirosinase (tampão de fosfato, pH 6,8, contendo 1 por cento de Triton X{ {5}}) com ciclos repetidos de congelamento/descongelamento. Os lisados ​​foram clarificados por centrifugação a 15,000 rpm a 4 ◦C por 10 min. Após quantificar os níveis de proteína do lisado e ajustar as concentrações de proteína com tampão de lise, 90 µL de sobrenadante misturado com 10 µL de L-DOPA 10 mM em tampão de lise de tirosinase foi incubado a 37 ◦C. A atividade da tirosinase celular foi medida pela leitura da absorbância em 475 nm usando um leitor de microplacas a cada 10 min por pelo menos 1 h. Arbutin (100 mg/mL) foi usado como agente de controle positivo.

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4.6. Análise imuno-histoquímica

Tecidos de pele humana embebidos em parafina foram cortados em seções de 6-µm de espessura e corados com Melan-A (Novocastra, Newcastle, Reino Unido), kits Fontana-Masson (ID labs, Londres, ON, Canadá) e HMB45 (Santa Clara , CA, EUA), de acordo com as instruções dos fabricantes. O índice de melanina foi determinado medindo-se a porcentagem da área corada em relação à área total do tecido usando o software ImageJ 1.52 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA).

4.7. Análise estatística

Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM), e a significância estatística foi determinada por um teste t de Student não pareado usando o software GraphPad Prism5 (San Diego, CA, EUA). Neste estudo, p < 0.05,="" p="">< 0,01="" ep="">< 0,001="" foram="" considerados="" estatisticamente="" significativos="" e="" são="" representados="" por="" *,="" **="" e="" ***,="">

Referências

1. Gillbro, JM; Olsson, MJ A melanogênese e os mecanismos dos agentes de clareamento da pele – abordagens existentes e novas. Int. J. Cosmet. Sci. 2011, 33, 210-221. [CrossRef] [PubMed]

2. Lee, YJ; Shin, HJ; Não, TK; Choi, KH; Chang, SE Tratamento de Melasma e Hiperpigmentação Pós-Inflamatória por um Laser de Alexandrita de Picosegundo 755-nm em Pacientes Asiáticos. Ana Dermatol. 2017, 29.779-781. [CrossRef] [PubMed]

3. Lee, YJ; Parque, JH; Lee, DY; Lee, JH Despigmentação Bilateral Adquirida na Face e Pescoço: Abordagens Clinicamente Apropriadas. J. Coreano Med. Sci. 2016, 31, 2042-2050. [CrossRef] [PubMed]

4. Kang, HJ; Na, JI; Lee, JH; Roh, MR; Ko, JY; Chang, SE Hiperpigmentação pós-inflamatória associada ao tratamento de lentigos solares usando um Q-Switched 532- nm Nd: YAG laser: A multicenter survey.J. Dermatologista. Tratar. 2017, 28, 447-451. [CrossRef] [PubMed]

5. Kato, H.; Araki, J.; Eto, H.; Doi, K.; Hirai, R.; Kuno, S.; Higashino, T.; Yoshimura, K. Um estudo prospectivo randomizado controlado de ácido tranexâmico oral para prevenir a hiperpigmentação pós-inflamatória após laser de rubi Q-switched. Dermatol. Surg. 2011, 37, 605-610. [CrossRef] [PubMed]

6. Taylor, CR; Anderson, RR Tratamento ineficaz do melasma refratário e hiperpigmentação pós-inflamatória pelo laser de rubi Q-switched. J. Dermatol. Surg. Oncol. 1994, 20, 592-597. [CrossRef]

7. Gillbro, JM; Marles, LK; Hiberts, NA; Schallreuter, KU A biossíntese autócrina de catecolaminas e o sinal do beta-adrenoceptor promovem a pigmentação em melanócitos epidérmicos humanos. J. Investigação. Dermatol. 2004, 123, 346-353. [CrossRef]

8. Schallreuter, KU; Korner, C.; Pittelkow, MR; Swanson, NN; Gardner, ML A indução do sistema de transdução de sinal do alfa-1-adrenoceptor em melanócitos humanos. Exp. Dermatol. 1996, 5, 20–23.[CrossRef]

9. Sivamani, RK; Shi, B.; Griffiths, E.; Vu, SM; Lev-Tov, HA; Dahle, S.; Chigbrow, M.; Lá, TD; Mashburn, C.; Peavy, TR; et ai. O ferimento agudo altera a sinalização beta2-adrenérgica e as vias sintéticas de catecolaminas nos queratinócitos. J. Investigação. Dermatol. 2014, 134, 2258-2266. [CrossRef]

10. Emery, AC Receptores de catecolaminas: Protótipos para descoberta de drogas baseadas em GPCR. Av. Pharmacol. 2013, 68.335-356.

11. Do Vale, GT; Ceron, CS; Gonzaga, NA; Simplício, JA; Padovan, JC Três gerações de betabloqueadores: história, diferenças de classe e aplicabilidade clínica. atual Hipertensos. Rev. 2019, 15, 22–31. [PubMed]

12. McTavish, D.; Campoli-Richards, D.; Sorkin, EM Carvedilol: Uma revisão de suas propriedades farmacodinâmicas e farmacocinéticas e eficácia terapêutica. Drogas 1993, 45, 232-258. [CrossRef] [PubMed]

13. Hsu, CC; Lee, JY Rubor facial pronunciado e eritema persistente da rosácea efetivamente tratados com carvedilol, um bloqueador beta-adrenérgico não seletivo. Geléia. Acad. Dermatol. 2012, 67, 491-493. [CrossRef][PubMed]

14. Pietschke, K.; Schaller, M. Manejo de longo prazo de rubor facial distinto e eritema persistente de rosácea por tratamento com carvedilol. J. Dermatologista. Tratar. 2018, 29, 310-313. [CrossRef] [PubMed]

15. Chang, A.; Yeung, S.; Thakkar, A.; Huang, KM; Liu, MM; Kanassatega, RS; Parsa, C.; Orlando, R.; Jackson, EK; Andresen, BT; et ai. Prevenção da carcinogênese cutânea pelo betabloqueador carvedilol. CâncerAnterior. Res. 2015, 8, 27-36. [CrossRef] [PubMed]

16. Chen, M.; Liang, S.; Shahid, A.; Andresen, BT; Huang, Y. O beta-bloqueador Carvedilol preveniu o dano mediado por ultravioleta de células epidérmicas murinas e pele humana reconstruída em 3D. Int. J.Mol. Sci. 2020, 21, 798. [CrossRef] [PubMed]

17. Huang, KM; Liang, S.; Yeung, S.; Oiyemhonlan, E.; Cleveland, KH; Parsa, C.; Orlando, R.; Meyskens, FL, Jr.; Andresen, BT; Huang, Y. O Carvedilol Aplicado Topicamente Atenua a Carcinogênese da Pele Induzida pela Radiação Ultravioleta Solar. Câncer Prev. Res. 2017, 10, 598-606. [CrossRef]

18. Brenner, M.; Audição, VJ O papel protetor da melanina contra os danos causados ​​pelos raios UV na pele humana. Photochem.Photobiol. 2008, 84, 539-549.

19. Cleveland, KH; Liang, S.; Chang, A.; Huang, KM; Chen, S.; Guo, L.; Huang, Y.; Andresen, BT Carvedilolin inibe JB6 P mediado por EGF mais a formação de colônias através de um mecanismo independente de adrenoceptores.PLoS ONE 2019, 14, e0217038. [CrossRef]

20. Dzong, G.; Zhongbing, M.; Qinye, F.; Zhigang, Y. Carvedilol suprime a migração e invasão de células malignas da mama inativando Src envolvendo cAMP/PKA e via de sinalização PKCdelta. J. Câncer Res. Ther.2014, 10, 998-1003.

21. Rzepka, Z.; Bussman, E.; Beberok, A.; Wrzesniok, D. Da tirosina à melanina: Vias de sinalização e fatores que regulam a melanogênese. Postepy Hig. Med. Dow. Online 2016, 70, 695-708. [CrossRef]

22. Kim, Y.; Cho, JY; Oh, SW; Kang, M.; Lee, SE; Jung, E.; Parque, YS; Lee, J. A adiponectina globular atua como um sinal melanogênico em melanócitos epidérmicos humanos. Br. J. Dermatol. 2018, 179, 689-701. [CrossRef][PubMed]

23. Slominski, A.; Tobin, DJ; Shibahara, S.; Wortsman, J. Pigmentação de melanina na pele de mamíferos e sua regulação hormonal. Fisiol. Rev. 2004, 84, 1155-1228. [PubMed]

24. Slominski, A.; Zmijewski, MA; Pawelek, J. L-tirosina e L-dihidroxifenilalanina como reguladores semelhantes a hormônios das funções dos melanócitos. Res. de Melanoma de Células Pigmentadas. 2012, 25, 14-27. [CrossRef] [PubMed]

25. Howe, J.; Costantino, R.; Slominski, A. Sobre o mecanismo putativo de indução e regulação da melanogênese pela L-tirosina. Acta Derm Venereol. 1991, 71, 150-152.

26. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, BC; Askarian-Amiri, ME Signaling Pathways in Melanogenesis. Int. J.Mol. Sci. 2016, 17, 1144. [CrossRef]

27. Jung, JA; Kim, BJ; Kim, MS; Você, HJ; Yoon, ES; Dhong, ES; Parque, SH; Kim, DW Efeito protetor da toxina botulínica contra a pigmentação da pele induzida por ultravioleta. Plástico. Reconstr. Surg. 2019, 144, 347–356.[CrossRef]

28. Jeong, YM; Ah, WK; Tran, TL; Kim, WK; Sung, SH; Bae, K.; Lee, S.; Sung, JH Aglicona de Rh4 inibe a síntese de melanina em células de melanoma B16: Possível envolvimento da via da proteína quinase A.Biosci. Biotecnologia. Bioquímica. 2013, 77, 119-125. [CrossRef]

29. Kim, YH; Kim, D.; Hong, AR; Kim, JH; Yoo, H.; Kim, J.; Kim, E.; Kang, SW; Chang, SE; Song, Y. Potencial terapêutico de Rottlerin para distúrbios hiperpigmentares da pele por inibição da atividade transcricional de coativadores de transcrição regulados por CREB. J. Investigação. Dermatol. 2019, 139, 2359–2367.e2.[CrossRef]

30. Das, A.; Ghosh, A.; Kumar, P. Chemical leucoderma devido a hidroquinona: Um fenômeno incomum. Indian J. Dermatol. Venereol. Leprol. 2019, 85, 567. [CrossRef]

31. Jow, T.; Hantash, BM Despigmentação induzida por hidroquinona: Relato de caso e revisão da literatura.Dermatitis 2014, 25, e1–e5. [CrossRef]

32. Kersey, P.; Stevenson, CJ Vitiligo e exposição ocupacional à hidroquinona de manutenção de máquinas de autofotografia. Entre em contato com a Dermat. 1981, 7, 285-287. [CrossRef] [PubMed]

33. Sasaki, M.; Kondo, M.; Sato, K.; Umeda, M.; Kawabata, K.; Takahashi, Y.; Suzuki, T.; Matsunaga, K.; Inoue, S. Rhododendron, um composto fenólico indutor de despigmentação, exerce citotoxicidade nos melanócitos através de um mecanismo dependente de tirosinase. Res. de Melanoma de Células Pigmentadas. 2014, 27, 754-763. [CrossRef] [PubMed]

34. Yoshikawa, M.; Sumikawa, Y.; Hida, T.; Kamiya, T.; Kase, K.; Ishii-Osai, Y.; Kato, J.; Kan, Y.; Kamiya, S.;Sato, Y.; et ai. Análise clínica e epidemiológica em 149 casos de leucodermia induzida por rododendros.J. Dermatol. 2017, 44, 582-587. [CrossRef] [PubMed]

35. Harris, JE Chemical-Induced Vitiligo. Dermatol. Clin. 2017, 35, 151-161. [CrossRef] [PubMed]

36. Li-Sha, G.; Yi-He, C.; Na-Dan, Z.; Teng, Z.; Yue-Chun, L. Efeitos do tratamento com carvedilol na expressão e fosforilação da proteína de ligação ao elemento de resposta cAMP cardíaca e fosforilação na miocardite aguda induzida pelo vírus coxsackie B3-. BMC Cardiovasc. Desordem. 2013, 13, 100. [CrossRef] [PubMed]

37. Zhang, F.; Os polimorfismos Steinberg, SF S49G e R389G do receptor beta(1)-adrenérgico influenciam a sinalização através das vias cAMP-PKA e ERK. Fisiol. Genoma. 2013, 45, 1186-1192. [CrossRef]

38. Lee, AY; Noh, M. A regulação da melanogênese epidérmica via cAMP e/ou vias de sinalização PKC: Insights para o desenvolvimento de agentes hipopigmentados. Arco. Farmácia. Res. 2013, 36, 792-801. [CrossRef]

39. Garcia-Borron, JC; Abdel-Malek, Z.; Jimenez-Cervantes, C. MC1R, a via cAMP e a resposta ao UV solar: Estendendo o horizonte além da pigmentação. Res. de Melanoma de Células Pigmentadas. 2014, 27, 699–720.[CrossRef]

40. Lin, CB; Babiarz, L.; Liebel, F.; Roydon Price, E.; Kizoulis, M.; Gendimenico, GJ; Fisher, DE; Seiberg, M.Modulação da expressão gênica do fator de transcrição associado à microftalmia altera a pigmentação da pele.J. Investigação Dermatol. 2002, 119, 1330-1340. [CrossRef]

41. Kim, JH; Hong, AR; Kim, YH; Yoo, H.; Kang, SW; Chang, SE; Song, Y. JNK suprime a melanogênese, interferindo na expressão de MITF dependente do coativador de transcrição regulado por CREB 3-. Theranostics2020, 10, 4017-4029. [CrossRef] [PubMed]

42. Rios, M.; Habecker, B.; Sasaoka, T.; Eisenhofer, G.; Tian, ​​H.; Landis, S.; Chikaraishi, D.; Roffler-Tarlov, S. A síntese de catecolaminas é mediada pela tirosinase na ausência de tirosina hidroxilase. J. Neurosci. 1999,19, 3519-3526. [CrossRef] [PubMed]

43. Cosentino, M.; Marinho, F.; Bombelli, R.; Ferrari, M.; Lecchini, S.; Frigo, G. Síntese de catecolaminas endógenas, metabolismo, armazenamento e captação em neutrófilos humanos. Ciência da Vida. 1999, 64, 975-981. [CrossRef]

44. Marinho, F.; Cosentino, M.; Bombelli, R.; Ferrari, M.; Lecchini, S.; Frigo, G. Síntese de catecolaminas endógenas, armazenamento de metabolismo e captação em células mononucleares do sangue periférico humano. Exp. Hematol. 1999, 27, 489-495. [CrossRef]

45. Sorrento, D.; Santulli, G.; Del Giudice, C.; Anastácio, A.; Trimarco, B.; Iaccarino, G. Células endoteliais são capazes de sintetizar e liberar catecolaminas tanto in vitro quanto in vivo. Hipertensão 2012, 60, 129–136.[CrossRef] [PubMed]

46. ​​Cucchi, ML; Fratini, P.; Santagostino, G.; Preda, S.; Orecchia, G. As catecolaminas aumentam na urina do vitiligo não segmentar, especialmente durante sua fase ativa. Res. Célula de Pigmento. 2003, 16, 111-116. [CrossRef][PubMed]

47. Salzer, BA; Schallreuter, KU Investigação da estrutura da personalidade em pacientes com vitiligo e uma possível associação com metabolismo de catecolaminas prejudicado. Dermatologia 1995, 190, 109-115. [CrossRef][PubMed]

48. Slominski, A. Atividade neuroendócrina do melanócito. Exp. Dermatol. 2009, 18, 760-763. [CrossRef]

49. Gannu, R.; Vishnu, YV; Kishan, V.; Rao, YM Permeação in vitro de carvedilol através de pele de suíno: Efeito de veículos e potenciadores de penetração. PDA J. Pharm. Sci. Tecnol. 2008, 62, 256-263.

50. Kshirsagar, SJ; Bhalekar, MR; Mohapatra, SK Desenvolvimento e avaliação do sistema de liberação transdérmica de fármacos carregado com carvedilol: estudo de caracterização in-vitro e in-vivo. Desenvolvimento de drogas Ind. Farmácia. 2012,38, 1530-1537. [CrossRef]

51. Tanwar, YS; Chauhan, CS; Sharma, A. Desenvolvimento e avaliação de adesivos transdérmicos de carvedilol. Acta Pharm. 2007, 57, 151-159. [CrossRef] [PubMed]