Aumentando a atividade anticancerígena do taxol "endófito de jojoba" de Aspergillus Favus por meio de conjugação com nanopartículas de ouro mediadas por irradiação
May 30, 2023
Taxol Ervas Chinesas Alternativas Cistanche
Palavras-chave:Aspergillus favus · Jojoba · Fungos endofíticos · Nanopartículas de ouro · Taxol · -Irradiação · Otimização nutricional
Introdução
O taxol é um dos compostos de amplo espectro mais comercializadosdrogas anticancerígenas[1]. A atividade do Taxol é elaborada a partir de sua especificidade única para a ligação com o heterodímero de subunidades da tubulina celular, promovendo a polimerização da tubulina, interrompendo assim a divisão mitótica das células tumorais [2]. Taxol mostrou uma forte atividade contra mama, pulmão, cabeça e pescoço, cânceres uterinos e formas avançadas de sarcoma de Kaposi [3]. O taxol foi inicialmente produzido a partir da casca dos teixos Taxus brevifolia "família Taxaceae" [4, 5]; no entanto, o menor rendimento de Taxol que é<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as asma,inflamação, eCâncer[32]. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi explorar um novo isolado fúngico da planta de jojoba com estabilidade metabólica única para a produção de Taxol, avaliar as diferentes abordagens para maximizar seu rendimento de Taxol, bem como, aumentar a atividade antiproliferativa dos compostos de Taxol extraídos via conjugação com nanopartículas de ouro, mediada por irradiação gama.
Material e métodos
Isolamento e Cultivo de Fungos Endofíticos
Diferentes partes da jojoba (Simmondsia chinensis) como folhas, cascas, galhos e brotos foram coletados da Faculdade de Agricultura da Universidade do Cairo e usados como fonte de fungos endofíticos. As partes da planta foram coletadas e lavadas em água corrente, esterilizadas com etanol 70% por 1 minuto e depois enxaguadas com água estéril [28]. As partes da planta esterilizadas na superfície foram cortadas em pequenos pedaços sob condições estéreis e colocadas em placas de meio de batata dextrose agar (PDA), Czapek's-Dox e meio de ágar extrato de malte [33-36], e as placas foram incubadas a 30 graus para 10 dias. A eficácia da esterilização da superfície das partes da planta foi avaliada pela centrifugação da água de enxágue, então 500 ul de água estéril foram adicionados ao precipitado e semeados em meio BDA [37]. Os isolados fúngicos endofíticos purificados foram inoculados em PDA inclinados por 7 dias e armazenados a 4 graus
Triagem, Extração e Quantificação de Taxol de Fungos Endofíticos
Os fungos endofíticos recuperados que habitam a jojoba foram rastreados quanto à produção de Taxol crescendo em caldo de dextrose de batata (PDB) [38]. Um tampão de cada um dos isolados fúngicos de 7 dias de idade foi inoculado em 100 ml de PDB/250 ml Erlenmeyer tasks, incubados por 15 dias a 30±1 graus, sob condições de agitação (120 rpm). Após a incubação, as culturas foram filtradas e o filtrado foi corrigido com bicarbonato de sódio a 0,2 por cento para precipitar os ácidos graxos. O taxol foi extraído com diclorometano, e a fase orgânica foi coletada e evaporada até a secura, e os resíduos foram redissolvidos em metanol [17, 39]. O taxol foi separado e identificado por TLC usando placas de gel de sílica pré-revestidas Merck 1 mm (20 x 20 cm) (TLC Silica gel 60 F254, Darmstadt, Alemanha), detectadas por iluminação UV a 254 nm [39]. As manchas putativas de Taxol foram raspadas das placas de gel de sílica TLC e dissolvidas em metanol, agitadas vigorosamente por vórtex durante 10 min e centrifugadas a 1000 rpm durante 5 min. As partículas de sílica precipitadas foram removidas e o sobrenadante foi levado para quantificação de Taxol e verificação de pureza por HPLC (YOUNG In, Chromass, 9110 plus Quater nary Pump, Coréia) da coluna de fase reversa C18 (Eclipse Plus C18 4.6 ×150 mm, 3,5 μm, Cat. # 959,963–902). A fase móvel utilizada foi metanol/acetonitrila/água (25:35:40, v/v/v) a uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min por 20 min [40], e as frações de Taxol foram medidas a 227 nm, e suas a identidade química e as concentrações foram confirmadas a partir do tempo de retenção e da área do pico de absorção em comparação com a amostra autêntica.
Identificação Morfológica e Molecular dos Fungos Endofíticos Recuperados
Os isolados de fungos endofíticos foram identificados em seus níveis de espécie com base em suas características macro e micromorfológicas, crescendo em PDA, Czapek's-Dox e meios de extrato de malte de acordo com as chaves de referência [33-36]. A identidade dos mais potentes isolados fúngicos produtores de Taxol foi posteriormente confirmada molecularmente com base na sequência do espaçador transcrito interno (ITS) [41, 42]. O DNA genômico fúngico (gDNA) foi extraído pela pulverização do micélio (~0,2 g) em nitrogênio líquido e, em seguida, dispensado em 1 ml de tampão de extração CTAB (2 por cento CTAB, 2 por cento PVP40, { {21}},2 por cento 2-mercaptoetanol, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl em 100 mM Tris-HCl, pH 8,0). Os conjuntos de primers de PCR foram ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ e ITS5 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′. A reação de PCR contém 10 ul de mistura mestre 2×PCR (i-Taq™, Cat. No. 25027), 2 ul de gDNA, 1 ul de cada iniciador (10 pmol/ul) e completou para 20 ul com destilado estéril água. A PCR foi programada para desnaturação inicial a 94 graus por 2 min, desnaturação a 94 graus por 30 s, anelamento a 55 graus por 10 s, extensão a 72 graus por 30 s por 35 ciclos e extensão final a 72 graus por 2 min. Os amplicons de PCR foram analisados por gel de agarose a 1,5 por cento em tampão 1×TBE (Ambion Cat# AM9864), usando 1 kb DNA ladder (Cat. # PG010-55DI) e visualizados pelo sistema de documentação de gel. Os amplicons foram purificados e sequenciados pelo Applied Biosystems Sequencer, HiSQV Bases, Versão 6.0 com os mesmos conjuntos de primers. As sequências obtidas foram pesquisadas pelo BLAST de forma não redundante no banco de dados NCBI, importadas para o software MEGA 6.0 e alinhadas com o algoritmo do músculo Clustal W [43] e a árvore filogenética foi construída com o método de junção de vizinhos do MEGA 6.0 [44].
Estrutura Química do Taxol Extraído
As manchas putativas de Taxol foram raspadas das placas de gel de sílica TLC e purificadas, e a pureza e a concentração foram determinadas pelas análises UV-Vis a λ 227 nm (RIGOL, Série Ultra-3000) em comparação com o Taxol autêntico [39]. Meios em branco nas mesmas condições foram usados como linha de base negativa para as análises espectrofotométricas. O espectro FT-IR das amostras de Taxol purificado foi analisado pelo espectrofotômetro JASCO FT-IR 3600. A amostra de Taxol foi moída com pastilhas de KBr, prensadas em discos sob vácuo, e a absorção foi medida na região de 400 a 4000 cm−1 [3], comparada com a amostra autêntica. A estrutura química do Taxol extraído foi confirmada a partir da espectroscopia HNMR (JEOL, ECA-500II, 500 MHz NMR) em comparação com o Taxol autêntico. As amostras foram dissolvidas em CDCl3, os desvios químicos são dados em ppm (escala δ) e as constantes de acoplamento são expressas em hertz (Hz).
Efeito de diferentes tipos de mídia na produção de taxol
Dois tampões de ágar (9 mm) de culturas com 7 dias de idade de cada isolado fúngico foram inoculados em triplicata em 100 ml de meio/frasco Erlenmeyer de 250 ml de batata dextrose (PDB), Czapekʼs-Dox (CZD), M1D e extrato de malte (ME ) meios de caldo. Controles não inoculados de cada meio que estão livres de esporos fúngicos foram usados como controle negativo, incubados a 30 graus por 15 dias nas mesmas condições. Após a incubação, as culturas de fungos foram filtradas e o Taxol foi extraído e determinado como mencionado acima.
Otimização do Bioprocesso das Condições Nutricionais para Maximizar o Rendimento do Taxol
A otimização da composição do meio para maximizar o rendimento de Taxol pelo isolado fúngico potente foi conduzida pela metodologia de superfície de resposta usando o design Placket-Burman seguido pelo design composto central [17–20, 45]. A partir dos desenhos de RSM, as variáveis positivas e significativas que afetam a produção de Taxol pelo potente isolado fúngico foram avaliadas usando o pacote de software estatístico por Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc., Minneapolis, EUA). Cada experimento foi executado em três repetições biológicas e os valores médios foram considerados. Após incubação nas condições desejadas, a biomassa fúngica foi filtrada e o Taxol foi extraído e quantificado por TLC e HPLC como descrito acima.
Carcela-Burman Design
O design placket-Burman tem sido freqüentemente usado para a otimização do componente de mídia para crescimento fúngico e produção de metabólitos secundários bioativos, avaliando as variáveis significativas que afetam a produção de Taxol [18, 20, 46]. A escolha do fator foi baseada na mídia utilizada na triagem qualitativa e quantitativa. Onze fatores foram incluídos; extrato de malte, peptona, sacarose, tona de soja, glutamina, extrato de carne bovina e os valores e fatores de temperatura, pH, tempo de incubação e velocidade de agitação foram variados em dois níveis, e as faixas de níveis mínimo e máximo foram selecionadas. O estatístico Design-Expert 7.0 foi usado para gerar um conjunto de 12 experimentos. Para cada experimento, a produção de Taxol foi determinada em três réplicas biológicas, e o rendimento médio de Taxol foi considerado.
A análise de regressão dos dados foi realizada usando software estatístico. O efeito de cada variável foi calculado (Biometrika, 2020), usando a seguinte equação:
onde, E é o efeito de uma variável de teste, M mais e M− são a concentração de Taxol de ensaios em que o parâmetro estava em seus níveis mais altos e mais baixos, respectivamente, e N é o número de experimentos que foram realizados. O efeito de cada variável na produção foi determinado calculando seus respectivos valores-E.
Onde Tot high é o total de respostas no nível alto, Tot low é o total de respostas no nível baixo e No é o número de tentativas.
Design Composto Central e Interações Entre Fatores que Afetam a Produção de Taxol
Os fatores positivos mais significativos que afetam a produção de Taxol pelo isolado fúngico selecionado foram otimizados usando um projeto experimental de modelo CCD do tipo superfície de resposta [47]. Usando o CCD, as concentrações dos componentes do meio foram otimizadas e suas interações estudadas foram usadas para gerar um total de 20 experimentos para as três variáveis. Para determinar os níveis óptimos das variáveis para a produção de Taxol a partir do isolado fúngico potente, traçaram-se curvas de superfície de resposta tridimensionais (3D) para estudar a interacção entre os vários factores e para determinar a condição variável de cada factor que afecta a produção de Taxol. Os gráficos 3D foram realizados mantendo as constantes de três fatores em um nível ideal e plotando a resposta obtida do rendimento de Taxol para níveis variados dos outros dois fatores.
Efeito da irradiação gama no rendimento de taxol
Os potentes isolados endofíticos produtores de Taxol foram expostos à -irradiação com fonte de 60cobalto (célula gama 4000-A-Índia) em diferentes doses de radiação gama (0,25–3,0 kGy) em comparação ao controle da cultura não irradiada; uma taxa de dose de 1,2 kGy/h no momento dos experimentos. Os meios otimizados foram inoculados pela cultura irradiada sob condições culturais padrão, em comparação com o inóculo de esporos não irradiados como controle. As culturas foram incubadas a 30±2 graus por 15 dias em agitador rotativo (120 rpm). Após incubação, as culturas foram filtradas e o Taxol foi extraído, purificado e quantificado por TLC e HPLC como descrito acima.
Síntese e Caracterização de Nanopartículas de Ouro (AuNPs); Conjugação com Taxol
Atividade anticancerígena do taxol
A atividade dos conjugados Taxol e Taxol-PVP-AuNPs purificados contra carcinoma hepático (HPG2) e carcinoma mamário (MCF7) foi determinada por 3- (4,5-dimetiltiazol- 2-il) -2,5-ensaio de brometo de difenil tetrazólio (MTT) [48]. A 96-placa de poços foi semeada com 103 células por poço e incubada durante a noite a 37 graus, então diferentes concentrações da droga foram adicionadas e as placas foram incubadas novamente por 48 h. O reagente MTT (25 ul) foi adicionado e incubado por 2 h, e a cor púrpura do complexo formazano desenvolvido foi medida a λ570 nm. O valor de IC50 foi expresso pela quantidade de fármaco reduzindo o crescimento de 50 por cento de um número inicial de células tumorais normalizando para controle positivo.
Atividade Antimicrobiana de Conjugados de Taxol e Taxol-AuNPs
A atividade antimicrobiana dos conjugados Taxol e Taxol-AuNPs foi avaliada contra diferentes isolados bacterianos; Bacillus subtilis ATCC 6633 e Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Enterobacter agglomerans, além de Candida albicans. As células bacterianas testadas foram suspensas em água peptonada estéril para obter inóculo padrão de ~0,5 McFarland (1–1,5)× 1{{10}}8 CFU/ml a λ6{{18 }}0 nm. A inibição do crescimento (mm) de patógenos microbianos foi avaliada pelo método de difusão em disco de ágar. Discos de antibiótico padrão estéreis com diâmetro de 6,0 mm foram usados como controles positivos. Discos de antibiótico estéreis (6,0 mm) foram carregados com 20 ul de metanol e amoxicilina-ácido clavulânico (AMC) como controle negativo e positivo. Os discos foram carregados com a mesma concentração de Taxol, Taxol-PVP-AuNPs e AuNPs (1,0 ug/ml). Três réplicas biológicas foram preparadas. As placas foram incubadas a 37 graus por 24 horas, e as zonas de inibição foram medidas. Amoxicilina, ácido clavulânico (AMC) e nistatina foram usados para normalizar a atividade antimicrobiana do Taxol. A zona de inibição do crescimento foi determinada por um paquímetro (mm).
Análise estatística
Diferença menos significativa de Fisher do teste post hoc.
Deposição fúngica
Resultados
Isolamento de Fungos Endofíticos de Jojoba; Triagem para Produção de Taxol
Vinte e quatro isolados de fungos endofíticos foram recuperados das cascas, galhos, folhas e brotos de jojoba carregados em meio BDA, CZD e ME. Esses isolados fúngicos foram derivados de cascas (6 isolados), galhos (7 isolados), folhas (4 isolados) e brotos (7 isolados) conforme registrado na Tabela 1. Esses isolados fúngicos foram inicialmente identificados em seu nível de espécie com base em sua morfologia características de acordo com as chaves universais, pertencentes a três gêneros, a saber: Aspergillus, Penicillium e Fusarium. Entre esses isolados, a prevalência do gênero Aspergillus foi relatada (83,4 por cento), enquanto Fusarium e Penicillium foram representados por 8,3 por cento. O gênero Aspergillus foi representado por cinco espécies, A. favus (3 isolados), Aspergillus oryzae (5 isolados), A. niger (5 isolados), A. fumigatus (4 isolados) e A. terreus (3 isolados). A produtividade do Taxol pelos isolados fúngicos recuperados foi avaliada por crescimento em PDB, incubação nas condições padrão, extração e quantificação do Taxol por TLC e HPLC (Fig. 1). A partir dos resultados, a produtividade máxima de Taxol foi relatada por A. favus Bd1 (88,65 µg/l), seguido por P. polonicum Br1 (54,42 µg/l), A. niger Lv1 (43,95 µg/l), A. oryzae Bd1 (38,87 µg/l), F. oxysporum Tw1 (26,80 µg/l), A. niger Lv2 (23,01 µg/l) e A. fumigatus Bd2 (17,62 µg/ eu). A identidade química estrutural do Taxol dos maiores produtores de fungos foi revelada a partir de seus espectros UV-Vis, em comparação com o espectro químico do Taxol autêntico. Além disso, a estrutura química do Taxol extraído dos quatro isolados fúngicos mais potentes foi validada por análises de FT-IR (Fig. 1). Notavelmente, o Taxol extraído dos potentes isolados fúngicos apresentou o mesmo paradigma espectral do Taxol autêntico. O pico em 3393,3 cm-1 foi atribuído à hidroxila (OH). Enquanto os picos em 2923,5 foram atribuídos ao trecho CH alifático, os picos em 1661,0 cm−1 correspondem à frequência de alongamento C=O. O pico observado em 1452,0–1404,0 cm-1 foi devido à frequência de alongamento do NH. A freqüência de estiramento do grupo carbonila-oxigênio foi observada em 1109 cm-1. Os picos observados na faixa de 1020-979,7 cm-1 foram devidos à presença de curvaturas C e H aromáticas. Das análises cromatográficas e espectrais, pôde-se concluir que o Taxol extraído é idêntico ao autêntico. Aparentemente, a atividade metabólica da mesma espécie fúngica variou muito com as diferentes plantas, garantindo a interação biológica única e a liberação de sinais específicos da parte da planta para desencadear a expressão do sistema maquinário da biossíntese do Taxol. Curiosamente, a flutuação no sistema metabólico não depende apenas das partes da planta, mas também da interação isolado-isolado, por exemplo, o rendimento de Taxol de isolados de A. niger que habitam as folhas de jojoba foi de 43,9 µg/l, enquanto o rendimento de O taxol foi zero para o isolado de A. niger recuperado da casca da planta.
Identificação Morfológica e Molecular dos Potentes Produtores de Taxol
As características morfológicas do potente isolado fúngico produtor de Taxol foram examinadas de acordo com as chaves descritivas macroscópicas e microscópicas, conforme descrito em Materiais e Métodos, e revelaram sua proximidade morfológica com A. favus (Fig. 2). O isolado fúngico foi cultivado em PDA a 30 graus por 10 dias e as características macroscópicas e microscópicas revelaram sua identidade, como cabeças de conídios, modo de ramificação, identidade de estigma e ontologia de conídios e formação de corpos de frutificação, de acordo com o padrão universal chaves morfológicas [33], e foram consideradas idênticas a Aspergillus favus. O potente isolado A. favus produtor de Taxol foi ainda identificado com base nas suas sequências ITS, utilizando gDNA como modelo. Os amplicons de PCR (~550 bp) de A. favus foram resolvidos, purificados e sequenciados (Fig. 2). A sequência ITS de A. favus foi pesquisada de forma não redundante no banco de dados NCBI, exibindo 99 por cento de similaridade com A. favus, com zero valores de E. e 95 por cento de cobertura de consulta. Assim, a partir das análises microscópicas e moleculares, o isolado alvo foi confirmado como A. favus e depositado no GenBank com número de acesso MW485934.1, bem como, o isolado foi depositado no Assiut University Mycological Center (AUMC), Egito com um número de depoimento AUMC13892. O isolado atual tinha 99% de similaridade com os isolados de A. favus MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,
Fig. 1 Vista morfológica da planta de jojoba. B Culturas em placas dos potentes fungos endofíticos produtores de Taxol; A. favus Bd1 (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polônio (23) e A. oryzae Bd (25) em PDA após 8 dias de incubação a 30 graus. Os isolados fúngicos foram cultivados em PDB e incubados nas condições padrão, e o Taxol foi extraído e verificado por TLC (C). D Cromatograma HPLC de Taxol dos potentes isolados fúngicos. E Rendimento de Taxol conforme quantificado por HPLC. F, análise espectral UV-Vis de Taxol extraído dos isolados fúngicos. G Análise FT-IR de Taxol extraído em comparação com um autêntico
Fig. 2 A Características macromorfológicas de A. favus um endófito de jojoba após 3, 5 e 8 dias de crescimento em PDA. Características micromorfológicas, cabeça conidial de A. favus em aumento de 400X. C PCR amplicon da região ITS de A. favus de 500 pb, normalizando para escada de 1 kb (Cat.#. SM0312). D Análise filogenética de ITS A. favus pelo método de máxima verossimilhança [44]
