Golgi Alpha1,2-Manosidase IA promove a degradação eficiente associada ao retículo endoplasmático de NKCC2

Abstrato

Mutações no cotransportador Na-K{1}}Cl NKCC2 localizado apicalmente no rim causam a síndrome de Bartter tipo I, um distúrbio renal com risco de vida. Anteriormente, mostramos que o transporte do RE representa a fase limitante na jornada do NKCC2 para a superfície celular. No entanto, muito pouco se sabe sobre os componentes de controle de qualidade ER específicos para NKCC2 e seus mutantes causadores de doenças. Aqui, relatamos a identificação de Golgi alpha1, 2-manosidase IA (ManIA) como um novo parceiro de ligação da forma imatura de NKCC2. A interação do ManIA com o NKCC2 ocorre principalmente na rede cis-Golgi. A coexpressão de ManIA diminuiu a abundância total da proteína NKCC2, enquanto o knockdown de ManIA produziu o efeito oposto. É importante ressaltar que a coexpressão de ManIA teve um efeito mais profundo nos mutantes de dobramento de NKCC2. O ensaio de perseguição de cicloheximida mostrou que em células que superexpressam ManIA, a estabilidade de NKCC2 e a maturação são fortemente prejudicadas. A deleção da região citoplasmática de ManIA atenuou sua interação com NKCC2 e inibiu seu efeito na maturação do cotransportador. As reduções induzidas por ManIA na expressão de NKCC2 foram compensadas pelo inibidor de proteassoma MG132. Da mesma forma, o tratamento com kifunensina reduziu bastante o efeito ManIA, sugerindo fortemente que o corte de manose está envolvido no ERAD aprimorado do cotransportador. Além disso, privar ManIA de seu domínio catalítico aboliu totalmente seu efeito sobre NKCC2. Em resumo, nossos dados demonstram a presença de uma via ERAD mediada por ManIA em células renais promovendo a retenção e degradação de proteínas NKCC2 mal dobradas. Eles sugerem um modelo pelo qual Golgi ManIA contribui para o ERAD de NKCC2, promovendo a retenção, reciclagem e ERAD de proteínas mal dobradas que inicialmente escapam à vigilância do controle de qualidade da proteína dentro do ER.

Palavras-chave

rim; NKCC2; controle de qualidade de proteínas; ERAD; Golgi; alfa1,2-manosidase IA; membrana; tráfico; síndrome de Bartter; hipertensão

Clique aqui para conhecer os benefícios Cistanche

Introdução

O balanço de sódio e sua regulação pelo rim, por meio da regulação do volume extracelular, é um determinante chave do controle da pressão arterial (PA) a longo prazo, conforme ilustrado por raras síndromes monogênicas que afetam o manuseio renal de sal e alteram consideravelmente a PA [1, 2]. De fato, embora vários fatores contribuam para a patogênese e manutenção da elevação da pressão arterial, acredita-se que os mecanismos renais desempenhem um papel primordial, conforme hipótese inicial de Guyton [1]. O ramo ascendente espesso da alça de Henle (TAL) do rim é responsável pela reabsorção de 20 a 30 por cento da carga filtrada de NaCl [3-5]. No nível molecular, a reabsorção de TAL Na-Cl é mediada pelo cotransportador luminal Na-K-2Cl NKCC2 [5]. Como consequência, a função de transporte de NKCC2 tem um impacto considerável na excreção final de sal na urina, influenciando subsequentemente o equilíbrio de sódio no sangue a longo prazo [3,5]. Assim, variações herdadas do cotransportador e/ou seus reguladores afetam a PA em humanos [3,6-8]. De fato, a inativação de NKCC2 causa a síndrome de Bartter tipo I (BS1), uma doença renal com risco de vida que apresenta baixa pressão arterial juntamente com anormalidades eletrolíticas [9], enquanto a atividade aumentada do cotransportador tem sido associada a alta pressão arterial [2,10– 13]. Além disso, em vários modelos animais de hipertensão sensível ao sal [14,15], a expressão da proteína NKCC2 é aumentada e contribui para o desenvolvimento da hipertensão. Além de seu papel na homeostase da PA, a atividade do NKCC2 também é essencial para a regulação do balanço hídrico [5,16]. Em apoio a essa noção, a inativação de NKCC2 em pacientes com BS1 e BS5 causa o desenvolvimento de poliúria grave [7,8,17]. Além disso, a capacidade prejudicada de concentração urinária dos rins envelhecidos é atribuída, pelo menos em parte, ao nível reduzido da proteína NKCC2 [18,19]. Vale ressaltar que em todos os modelos animais de hipertensão e envelhecimento, NKCC2 parece ser regulado principalmente por mecanismos pós-traducionais [5,16,19], destacando, portanto, a necessidade de estudar os fatores que regulam a biogênese e o tráfico de NKCC2. Apesar disso, nosso conhecimento dos mecanismos moleculares subjacentes ao tráfico intracelular de proteínas NKCC2 de tipo selvagem e mutantes em células de mamíferos, em particular sua regulação pela interação proteína-proteína, permaneceu muito pobre. Além disso, a grande maioria dos relatórios anteriores se concentrou principalmente na regulação pós-Golgi do cotransportador, em particular pela fosforilação [20-22] e, portanto, muito pouco se sabe hoje sobre a regulação dos transportadores no RE e pré-Golgi nível.

Para operar corretamente, o NKCC2 deve ser direcionado adequadamente para a superfície celular apical e expresso o suficiente para permitir que as células TAL se adaptem adequadamente aos desafios fisiológicos ou patológicos [3,23]. Como todas as proteínas transmembrana, a preparação para o tráfego apropriado de NKCC2 para a membrana celular começa quando a proteína cotransportadora é sintetizada no retículo endoplasmático (ER) e continua enquanto a proteína transita pela rede de Golgi [24,25]. Da mesma forma, assim como praticamente todas as proteínas destinadas à membrana plasmática, as proteínas NKCC2 translocadas para o retículo endoplasmático (ER) passam por controle de qualidade, de forma que apenas proteínas dobradas são movidas pela via secretora [26,27]. O controle do enovelamento de proteínas no RE está frequentemente relacionado à N-glicosilação, uma modificação pós-traducional iniciada pela ligação covalente de um oligossacarídeo específico (Glc3Man9GlcNAc2) a uma proteína nascente [28,29]. Uma vez que este oligossacarídeo é transferido, várias etapas sucessivas de maturação da proteína seguem ao longo da via secretora [28,30]. Após a remoção de três resíduos de glicose e o início do corte de manose no RE, como parte do processo de controle de qualidade, as proteínas corretamente enoveladas são transferidas para o aparelho de Golgi para maturação [26,28]. Os N-glicanos com alto teor de manose são então reduzidos por manosidases específicas, como Golgi 1,2-manosidases no cis-Golgi [31,32]. A adição de açúcares GlcNAc, galactose, ácido siálico e fucose gera N-glicanos híbridos e complexos dentro dos compartimentos medial e trans-Golgi [33,34]. Posteriormente, as proteínas maduras N-glicosiladas são direcionadas para o seu destino final. Quando o processo de dobramento falha, os resíduos de manose terminais da estrutura do glicano central são progressivamente cortados e as proteínas defeituosas são translocadas através da membrana para degradação do proteassoma citosólico por meio de mecanismos conhecidos como ERAD (degradação associada ao retículo endoplasmático [26,35]). As proteínas aberrantes restantes, que podem formar agregados ou não podem ser detectadas por chaperonas ERAD, são entregues aos lisossomos para depuração através de vias coletivamente referidas como ER-page [36,37]. No entanto, algumas proteínas mal dobradas ainda podem escapar do RE e avançar para o Golgi, onde são submetidas a um controle de qualidade de Golgi (GQC) e direcionadas ao lisossomo ou proteassoma para degradação [38]. Ambas as variantes de tipo selvagem e mutante de proteínas transmembrana são propensas a degradação e controle de qualidade ER. A proteína de canal de cloro CFTR (regulador de condutância transmembrana de fibrose cística), caracterizada como o primeiro substrato ERAD de mamífero integral de membrana, é o melhor exemplo [39,40]. Em condições normais, até 70% do CFTR de tipo selvagem é degradado pelo ERAD [39,40]. Ainda mais impressionante, a deleção da fenilalanina 508 (∆F508), a mutação do CFTR responsável pela fibrose cística, reduz a eficiência de dobramento, resultando em quase 99% do CFTR mutante sendo degradado antes de atingir a membrana plasmática [39,40]. Semelhante ao CFTR e várias outras proteínas transmembrana, como HERG [41], ROMK [42] e NCC [43], mostramos anteriormente que a maioria das proteínas NKCC2 recentemente sintetizadas estava presa no RE e destinada à degradação, um processo que envolve principalmente a via do proteassoma [44-46]. O ERAD começa com a detecção de uma proteína mal dobrada por chaperonas moleculares [47]. O tipo de chaperonas envolvidas neste processo depende principalmente da posição da lesão dobrada do substrato que pode ocorrer no lúmen do RE, na membrana do RE ou no citoplasma [27,47]. Consequentemente, três vias ERAD diferentes foram propostas como ERAD-L (ERAD de substratos com lesões mal dobradas dentro do lúmen do RE), ERAD-M (membrana) e ERAD-C (citoplasma) [27,47,48]. Por exemplo, o ERAD do CFTR nascente envolve chaperonas citoplasmáticas e luminais do RE [49]. Da mesma forma, NCC, outra proteína transmembrana, envolve várias chaperonas citoplasmáticas para seu ERAD [43,50]. Semelhante ao NCC eletroneutro específico do rim relacionado, o NKCC2 possui 12 regiões transmembranares, dois grandes domínios citoplasmáticos e um grande loop exofacial exposto ao RE [5]. Uma vez que NKCC2 contém domínios no RE e no citoplasma, é concebível uma interação do cotransportador com as chaperonas moleculares do RE em ambos os lados ou em ambos os lados da membrana do RE. Além disso, dado que o domínio C-terminal de NKCC2 é a região citoplasmática predominante [5], é provável que seja o principal local de interação proteína-proteína e, portanto, desempenhe um papel fundamental na biogênese e tráfego do cotransportador. De acordo com esta noção, identificamos anteriormente vários parceiros de ligação do NKCC2 C-terminal [46,51-53]. Entre eles, mostramos que a aldolase B e o SCAMP2 se ligam ao terminal C do NKCC2 no nível pós-Golgi e regulam a redistribuição subcelular do cotransportador [51,52]. Mais recentemente, fornecemos evidências de que STCH, Hsp70 e a proteína lectina OS9 interagem com a forma imatura de NKCC2 principalmente no RE para regular sua degradação associada ao RE [46,53]. Neste relatório, descrevemos uma nova interação proteína-proteína entre a cauda C-terminal de NKCC2 e Golgi 1,2-manosidase IA (Golgi ManIA, também chamada Man9-manosidase), uma proteína onipresente que pertence à família de classe I -1,2 manosidases que inclui a ER -manosidase I (MAN1B1) e duas outras Golgi 1,2-manosidases, Golgi -manosidase IB [MAN1A2] e Golgi -manosidase IC [MAN1C1] [31,54-56]. Curiosamente, um crescente corpo de evidências indicou que -1,2-manosidases não estão apenas implicadas no dobramento e maturação de proteínas, mas também desempenham um papel fundamental na degradação de proteínas mal dobradas [57-60]. Aqui, mostramos que ManIA interage com a forma imatura de NKCC2 principalmente na rede cis-Golgi e promove sua degradação pela via do proteassoma, revelando, portanto, um checkpoint adicional na vigilância e remoção de proteínas NKCC2 mal dobradas. Consequentemente, essas descobertas podem abrir novos caminhos no estudo do controle de qualidade do RE e do Golgi das proteínas NKCC2 para ajudar no desenvolvimento de novas estratégias para prevenir e/ou tratar distúrbios renais relacionados ao tráfego e expressão aberrante de NKCC2.

Suplemento Cistanche

Materiais e métodos

1. Ensaio de Dois Híbridos de Levedura

A triagem de dois híbridos de levedura (Y2H) foi realizada conforme descrito anteriormente em detalhes [51], usando como isca a região proximal do terminal C NKCC2 (resíduos 661–1095). Resumidamente, o AH109 expressando a isca foi cruzado com a cepa de levedura Y187 transformada com uma biblioteca de cDNA de rim humano. Para a seleção de clones positivos que codificam proteínas de interação putativas, as células de levedura acasaladas foram primeiro cultivadas em placas de seleção de baixo rigor (−Leu, −Trp, −His) e depois em placas de seleção de alto rigor (−Leu, −Trp, −His, − Ade). As colônias selecionadas também foram testadas quanto à atividade de -galactosidase e o DNA dos clones positivos foi isolado de células de levedura usando o kit de isolamento de plasmídeo de levedura RPM (BIO 101 Systems). Depois de resgatar os plasmídeos de presa por transformação em bactérias DH5 (Invitrogen) e isolamento usando um kit Qiagen, os plasmídeos de cDNA foram sequenciados e avaliados usando o programa BLAST.

2. Construção de plasmídeo e mutagênese direcionada ao local

A geração de WT Myc-NKCC2, Myc-NKCC2 não glicosilado ((N442Q/N452Q) e WT EGFP-NKCC2 foi descrita anteriormente [45,46,51]. A sequência de codificação de ManIA de camundongo foi subclonada no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.1/V5 (Invitrogen, Paris, França) para gerar o construto WT ManIA-V5. O plasmídeo compreendendo ManIA sem sua cauda C-terminal (ManIA-∆Cter) foi gerado através da amplificação do construto de expressão WT MAnIAV5 usando o iniciador direto 50 CCGGAGCGATGAAGTTCGTGCTGCTGC 30 e o iniciador reverso 50 TTTCTCTTTGCCATCAATTTC 30. O construto contendo ManIA desprovido de sua região N-terminal (ManIA-∆Nter) foi gerado também a partir do plasmídeo WT MAnIA-V5 pelo método de mutagênese dirigida ao local QuikChange (Stratagene, Les Ulis, França) usando o iniciador direto 50 GAGGGCAAAGATCAAAGAGTAGATGACCCATGCTTGGAAT 3 0 e primer reverso 50 ATTCCAAGCATGGGTCATCTACTCTTTGATCTTTGCCCTC 30. Todas as mutações e truncamentos foram confirmados por sequenciamento.

3. Cultura Celular

Células de rim de gambá (células OKP) foram mantidas em DMEM (Gibco 42430) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Eurobio, Les Ulis, França), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 U/mL) a 37 ◦ C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. Células 293 de rim embrionário humano (HEK) foram cultivadas em meio DMEM complementado com 10 por cento de soro bovino fetal e 1 por cento de penicilina/estreptomicina. Para a transfecção de DNA plasmidial, as células foram cultivadas até 60-70 por cento de confluência antes de serem transfectadas transitoriamente por 5 h usando o kit Lipofectamine plus de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, Paris, França). Para experimentos de degradação de proteínas, as células foram tratadas com MG132 (2 µM) ou cloroquina (100 µM) 6 h antes da lise celular, conforme descrito anteriormente [53,61]. A kifunensina (Sigma k1140, Saint-Quentin-Fallavier, França) foi usada a 25 µM 6 h antes da lise celular.

4. Preparação de Proteína, Immunoblotting e Imunoprecipitação

Após a transfecção, as células foram lavadas com PBS frio antes de serem solubilizadas em um tampão de lise contendo 120 mM Tris/Hepes, pH 7,4; 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 3 mM KCl; 1 por cento (v/v) Triton X-100 e inibidores de protease (Complete Roche 1697498, Meylan, França). As amostras foram então colhidas e centrifugadas a 16,{{10}} rpm por 15 min a 4 ◦C. Para imunoprecipitação, as células foram solubilizadas com tampão de lise contendo NaCl 0,4 M; 1,5 mM MgCl2; Hepes 10 mM, pH 7,9; 5 por cento (v/v) de glicerol; 0,5 por cento (v/v) Nonidet P-40) e inibidores de protease (Complete, Roche Diagnostics). A imunoprecipitação foi realizada utilizando anticorpo anti-V5 (Invitrogen) ou anti-ManIA (Sigma ), e a purificação por afinidade utilizando grânulos de proteína G-agarose (Dynabeads, Invitrogen, Paris, França). Após incubação com grânulos de proteína G-agarose por 1 h à temperatura ambiente, o imunocomplexo foi lavado em PBS (Invitrogen). As amostras de proteína foram então fervidas em tampão de carregamento, executadas em um gradiente de 7,5 por cento ou 10 por cento, ou 15 por cento de géis SDS-poliacrilamida e sondadas com anticorpos primários de interesse e anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano. As proteínas foram visualizadas por detecção de quimioluminescência aprimorada (Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, França) de acordo com as instruções do fabricante.

5. Imunocitoquímica

Vinte e quatro a quarenta e oito horas após a transfecção, as células confluentes foram lavadas com PBS plus plus (pH 8, 1 mM MgCl2 e 0,1 mM CaCl2). As células foram então fixadas com 2 por cento de paraformaldeído em PBS por 20 min à temperatura ambiente antes de serem incubadas com 50 mM de NH4Cl e permeabilizadas com 0,1 por cento de Triton X-100 por 1 min. Para bloquear nenhuma ligação específica de anticorpo, as células foram incubadas com DAKO (diluente de anticorpo com componentes redutores de fundo) por 30 min. As células fixadas foram incubadas por 1h em temperatura ambiente com o anticorpo primário de interesse. Os anticorpos primários usados ​​neste estudo são os seguintes: anti-V5 de camundongo (Invitrogen, Paris, França), anti-Myc de camundongo (Takara, Clontech, Saint-Germain-en-Laye, França), anti-V5 de rato (Abcam, Paris, França), coelho anti-Calnexin (Abcam), coelho anti-Giantin (Abcam), coelho anti-GM130 (Abcam), coelho anti-ManIA (Abcam), Os anticorpos secundários utilizados são os seguintes: cabra anti-coelho Alexa Fluor 555 (Invitrogen), cabra anti-coelho Alexa Fluor 488 (Invitrogen), cabra anti-coelho FITC (DakoCytomation, Trappes, França), cabra anti-rato Texas red (Invitrogen), cabra anti-rato Alexa Fluor 555 (Invitrogen), cabra anti-rato Alexa Fluor 488 (Invitrogen), Alexa Texas Red conjugado anti-rato (Jackson ImmunoResearch, Ely, Reino Unido), frango anti-rato Alexa Fluor 647 (Invitrogen). Após incubações com anticorpos primários e secundários de interesse, as células foram então lavadas com PBS e montadas com Vectashield.

Herba Cistanche

6. Ensaios de Perseguição de Cicloheximida

Para monitorar a estabilidade e maturação de NKCC2, a cicloheximida foi adicionada a uma concentração de 100 µM a células OKP ou HEK 14-16 h após a transfecção com plasmídeos NKCC2. Para o período de perseguição, os lisados ​​​​celulares foram coletados em 0, 1, 2 e 4 h após o tratamento com cicloheximida e analisados ​​por imunoblotting.

7. Nocaute de siRNA

Os siRNAs ManIA foram adquiridos da Dharmacon como conjuntos ON-TARGET mais SMART (L-012174-00-0005). As células HEK foram primeiro transfectadas com controle ou siRNAs ManIA específicos com Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) usando as especificações do fabricante0 conforme realizado anteriormente [46,53]. Um dia após a transfecção de siRNA, as células foram transfectadas com plasmídeos NKCC2. Após 24-48 h, os lisados ​​​​celulares foram analisados ​​para cada proteína usando os anticorpos indicados.

8. Análises Estatísticas

Os dados são expressos como média ± SE. As diferenças entre as médias foram avaliadas usando testes t pareados ou não pareados ou ANOVA, conforme apropriado. p < 0.05 foi considerado estatisticamente significativo.

Discussão

Este estudo foi realizado para obter informações sobre os mecanismos moleculares subjacentes à regulação da degradação associada a ER durante a biogênese de NKCC2. Usando análise de dois híbridos de levedura e ensaios de co-imunoprecipitação, identificamos GolgiMannosidase IA como um novo parceiro de ligação de NKCC2. A associação envolve apenas a forma glicosilada imatura e rica em manose do cotransportador e ocorre principalmente na rede cis-Golgi. Descobrimos que o knock-down de ManIA aumenta a abundância da proteína NKCC2, enquanto sua superexpressão tem o efeito oposto. A co-expressão de ManIA prejudicou a maturação de NKCC2 promovendo sua retenção, reciclagem para o RE e degradação via proteassoma. É importante ressaltar que os mutantes de dobramento NKCC2 são mais propensos à via ERAD mediada por ManIA. Esses achados podem ajudar a entender melhor como as anormalidades no tráfego da proteína NKCC2 levam à síndrome de Bartter, essencial para elucidar a fisiopatologia da BS1 e melhorar os tratamentos disponíveis.

Agora está claramente estabelecido que o corte de manose por classe I 1,2-manosidases está envolvido no estágio de reconhecimento para o ERAD de glicoproteínas, uma vez que esse processo é bastante reduzido por seus inibidores 1-desoximanojirimicina e kifunensina [67, 70–73]. Inicialmente, pensava-se, com base em estudos conduzidos principalmente em leveduras, que esses compostos dificultavam o ERAD inibindo o ER 1,2-manosidase I que cliva principalmente a manose do ramo B intermediário de Man9 para formar Man8, um sinal de glicano propôs iniciar o ERAD [70,74]. No entanto, em células de mamíferos, essa hipótese não é necessariamente sólida, uma vez que tanto a kifunensina quanto a 1-desoximanojirimicina também inibem Golgi 1,2-manosidases. Além disso, houve evidências crescentes em células de mamíferos demonstrando que o aparamento adicional de três a quatro 12-resíduos de manose ligados, para formar Man6GlcNAc2 (M6) ou Man5GlcNAc2 (M5), também contribui para desencadear a degradação de glicoproteínas mal dobradas [ 32,75-77]. No entanto, não ficou claro quais 1,2-manosidases são responsáveis ​​por esse corte adicional. Um candidato é ER a 1,2-a própria manosidase I, uma vez que sua superexpressão leva ao aumento do corte de manose e ERAD acelerado [78-80]. Outros possíveis candidatos poderiam ser as proteínas semelhantes à manosidase (EDEM) intensificadoras da degradação do ER porque foi relatado que EDEM1 e EDEM3 estimulam o corte de manose e aceleram a glicoproteína ERAD quando superexpressas nas células [81,82]. Outro candidato possível poderia ser a manosidase IA de Golgi, que corta Man9 para Man6 e Man5 [31,54]. Esta enzima e duas outras manosidases Golgi 1,2 (IB e IC) demonstraram aumentar a degradação e o corte de manose de um substrato ERAD-L, NHK 1-antitripsina, quando superexpresso em células cultivadas [57]. No presente estudo, mostramos evidências de uma interação específica de ManIA com NKCC2, uma proteína transmembrana renal. É importante ressaltar que demonstramos que a associação ManIA in vivo envolve apenas a forma imatura do cotransportador. Mais importante ainda, fornecemos evidências de que a ligação de ManIA está envolvida na retenção e degradação de NKCC2 associada ao ER.

Cápsulas Cistanche

Anteriormente, fornecemos evidências de que o ERAD e a exportação do RE constituem o regulador significativo da maturação do NKCC2 e da expressão da superfície celular [8,44-46]. De fato, demonstramos que a maioria das proteínas NKCC2 recentemente sintetizadas são direcionadas à degradação associada ao ER envolvendo as vias proteassômica e lisossômica [8,44-46,53]. Além disso, mostramos que o STCH e a proteína lectina OS9 estão envolvidos nesses processos interagindo com a forma imatura de NKCC2 principalmente no RE [46,53]. Semelhante ao OS9 e STCH, o envolvimento de ManIA no ERAD do cotransportador foi sugerido pela primeira vez no presente estudo por ensaios de co-imunoprecipitação revelando que a associação das proteínas envolve apenas a forma imatura de NKCC2. É digno de nota que a exclusão da cauda citoplasmática de ManIA reduziu, mas não inibiu totalmente sua interação com NKCC2, abrindo, portanto, a possibilidade de uma interação do cotransportador com outras regiões da proteína ManIA. Além disso, apesar da interação de ManIA apenas com o núcleo glicosilado e forma imatura de NKCC2, nossos estudos imunocitoquímicos revelaram que ManIA não colocaliza com NKCC2 no RE. A esse respeito, vale a pena notar que ManIA foi relatado como estando no Golgi ou no RE [31,83-85]. Outro estudo independente relatou que a manosidase IA também pode residir em vesículas de controle de qualidade [58]. Consequentemente, como a distribuição celular de ManIA pode depender do tipo de célula, conduzimos nosso estudo em duas linhagens de células renais diferentes, células OKP e HEK. Os estudos de localização realizados nessas células mostraram claramente que ManIA é expresso no aparelho de Golgi em ambas as linhagens celulares e revelaram que o local de interação com o cotransportador é a rede cis-Golgi. Digno de nota, dado que o N-glicano de glicoproteínas na entrada do aparelho de Golgi ainda é do tipo alta manose, é concebível que a interação de NKCC2 com ManIA possa ocorrer de fato na rede cis-Golgi. Usando abordagens de siRNA e superexpressão, mostramos que ManIA interage com o NKCC2 imaturo para promover sua degradação associada ao ER. É importante ressaltar que o efeito de ManIA na forma madura de NKCC2 foi evitado quando a cauda citoplasmática de ManIA foi deletada. Ainda mais impressionante, o efeito ManIA nas formas imatura e madura de NKCC2 foi completamente anulado quando a enzima foi privada de seu domínio catalítico. Além disso, a regulação de NKCC2 por ManIA também foi impedida na presença do inibidor de proteassoma MG132, mas não com cloroquina, um inibidor da função lisossômica, indicando que ManIA tem como alvo a forma imatura do cotransportador para a via ERAD dependente de proteassoma. Para apoiar ainda mais o papel de ManIA no ERAD de NKCC2, testamos também o efeito do inibidor de corte de manose kifunensine. Curiosamente, o tratamento com kifunensina inibiu o efeito ManIA em NKCC2, indicando que o corte de manose é um processo importante na degradação de NKCC2 associada a ER mediada por ManIA. No entanto, o efeito ManIA não foi totalmente prevenido pela kifunensina, o que implica que, pelo menos em parte, a ação ManIA no cotransportador não é totalmente dependente de N-glicano. Em apoio a esta noção, as mutações dos locais de glicosilação de NKCC2 não inibiram totalmente o efeito ManIA no cotransportador, confirmando, portanto, que, pelo menos sob nossas condições experimentais, parte do efeito ManIA pode ser independente de N-Glicano. Em apoio a esta noção, Ron et al. forneceram evidências de que, sob condições de estresse de RE, a expressão aumentada de EDEM1, outra proteína alfa-manosidase, contorna o evento de corte de manose e entrega a glicoproteína diretamente aos estágios tardios de ERAD [86]. De fato, eles mostraram claramente que, após a superexpressão de EDEM1, a degradação da glicoproteína H2a não foi bloqueada pela kifunensina [86]. Isso é de particular interesse porque nosso cenário experimental, ou seja, a superexpressão heteróloga de proteínas secretoras e de membrana (NKCC2) causa estresse de RE [87-89], o que pode explicar, pelo menos em parte, a persistência de um efeito de ManIA, independentemente do corte de manose , no cotransportador nestas condições. Vale a pena notar que o efeito restante de ManIA na proteína NKCC2 não glicosilada foi totalmente bloqueado por MG132, corroborando ainda mais a noção de que ManIA promove o ERAD de NKCC2 em uma via dependente de proteassoma.

O acúmulo de polipeptídeos mal dobrados e propensos à agregação é prejudicial à saúde celular [90-92]. Um número maior (mais de 70) de doenças humanas resulta de defeitos no dobramento de proteínas secretoras e de membrana [91,92]. Para evitar o dobramento incorreto de proteínas e manter a homeostase da proteína na via secretora, as células eucariotas possuem vários mecanismos de controle de qualidade (QC) [26]. Eles incluem o controle de qualidade ER (ERQC) através da via de degradação associada ao retículo endoplasmático (ERAD) [36,48] e ER-page [93] Controle de qualidade de Golgi (QCG) [38] e controle de qualidade de membrana plasmática (PM) [94 ]. Portanto, proteínas mal dobradas, em particular proteínas transmembrana com topologias complexas como NKCC2, são rigorosamente inspecionadas por sucessivos pontos de verificação de controle de qualidade antes de chegarem a seus destinos finais [26,94]. Além disso, as vias QC podem cooperar para neutralizar eficientemente o dobramento incorreto de uma única proteína. Por exemplo, embora a maioria das proteínas transmembrana mal dobradas sejam degradadas pelo ERAD, algumas proteínas aberrantes, em particular sob condições de estresse do RE, podem escapar da vigilância do RE para serem empacotadas em vesículas COPII para tráfego anterógrado para o Golgi [95-97]. Evidências obtidas de vários estudos apóiam a noção de que o aparelho de Golgi serve como um ponto de verificação QC [26,38] De fato, proteínas mal dobradas ou desmontadas que evitam ERAD e ER-page, saem do ER e se tornam substratos GQC que são encaminhados para o vacúolo/ lisossoma para degradação [26,38]. A este respeito, é muito improvável que a via GQC direcionada ao lisossoma/vacúolo seja o mecanismo subjacente à regulação negativa induzida por ManIA de NKCC2, uma vez que o inibidor lisossômico cloroquina não impediu o efeito ManIA no cotransportador. Outra possibilidade é que algumas proteínas mal dobradas que entram no Golgi podem ser direcionadas para degradação proteassômica após a entrega de volta ao RE. Mais precisamente, o GQC captura os substratos que escaparam mais provavelmente no cis-Golgi e os recicla de volta ao ER para ERAD pelo proteassoma. Isso é de grande interesse porque demonstramos que ManIA colocaliza com NKCC2 principalmente na rede cis-Golgi. Além disso, em contraste com a cloroquina, o inibidor de proteassoma MG132 aboliu o efeito ManIA em NKCC2, sugerindo fortemente, portanto, que o GQC direcionado ao proteassoma é muito provável que seja a principal via que governa a regulação de NKCC2 por ManIA. Digno de nota, um estudo muito recente em levedura propôs que algumas proteínas mal dobradas que entram no Golgi podem ser direcionadas diretamente para a degradação proteassômica sem serem cicladas de volta ao RE, um mecanismo chamado EGAD [98]. No entanto, embora não se possa excluir esse mecanismo adicional, mostramos claramente que, após a co-expressão de ManIA, NKCC2 é amplamente retido no RE. Portanto, nossos dados sugerem fortemente que ManIA promove a retenção, reciclagem e ERAD dependente de proteassoma de proteínas NKCC2 mal dobradas que inicialmente escapam ao controle de qualidade do RE.

cistanche tubulosa

Uma exploração exaustiva dos mecanismos subjacentes ao maquinário ERAD forneceu vários novos insights sobre como o ERAD contribui para a saúde humana durante os estados normais e doentes [48,92]. A importância do controle de qualidade do RE, em geral, e do fenômeno ERAD, em particular, tem sido mencionada em um grande número de patologias humanas, denominadas doenças conformacionais [48,92]. Em relação ao NKCC2, documentamos anteriormente que a síndrome de Bartter tipo 1 está entre as doenças ligadas à via ERAD [61]. De fato, embora vias celulares distintas possam ser responsáveis ​​pela perda de função de NKCC2 na doença BS1, nossos dados revelaram que a degradação proteica associada ao ER é o mecanismo mais comum subjacente à BS1 [61]. Consequentemente, a identificação de proteínas que se ligam especificamente às formas imaturas de WT NKCC2 e seus mutantes enoveláveis ​​é importante para decifrar os mecanismos moleculares subjacentes à regulação de seu ERAD. No presente estudo, fornecemos evidências de que, além de WT NKCC2, ManIA interage com a forma imatura dos mutantes NKCC2 A508T e Y998X. Além disso, demonstramos que a co-expressão de ManIA tem um efeito mais profundo no mutante de dobramento NKCC2 A508T quando comparado ao WT NKCC2, sugerindo fortemente que ManIA pode ter um papel importante no ERAD de mutantes NKCC2 durante BS1. Isso é de particular interesse porque relatamos anteriormente que A508T e Y998X são retidos no pronto-socorro [45,61]. Dado que nossos experimentos de imunolocalização revelaram que, independentemente do sistema de expressão, ManIA é expresso na rede cis-Golgi, a interação da enzima com esses dois mutantes NKCC2 sugere fortemente que, embora a maioria dos A508T e Y998X estejam amplamente presos no ER, há uma transferência significativa desses dois mutantes do RE para o cis-Golgi, onde podem ser capturados pelo ManIA para serem devolvidos ao RE. A esse respeito, Hosokawa et al. mostraram também que, embora a maioria das proteínas NHK transfectadas sejam retidas no RE, algumas delas escaparam do controle de qualidade do RE e atingiram o cis-Golgi, onde são cortadas pelo Golgi a 1,2-manosidases para serem direcionadas para ERAD [ 57]. Além disso, vários estudos recentes demonstraram que o ERManI, que foi inicialmente previsto para funcionar no RE, também foi localizado no complexo de Golgi em células de mamíferos, onde contribui para um ponto de verificação de controle de qualidade baseado em Golgi que facilita a recuperação de substratos ERAD capturados. para o pronto-socorro [59,60,99]. Digno de nota, dado que, como NKCC2, ManIA é uma proteína transmembranar, ela também pode interagir transitoriamente com o cotransportador no RE, permitindo, portanto, que a enzima participe da geração do sinal que direciona as proteínas NKCC2 mal dobradas para ERAD, tanto quando elas transitam pelo RE ou a caminho do Golgi.

Em resumo, descobrimos que Golgi ManIA interage com a forma imatura de NKCC2 no cis-Golgi para promover sua retenção no RE e acelerar seu ERAD pela via do proteassoma. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo que descreve o papel significativo do mecanismo de controle de qualidade de Golgi na biogênese de NKCC2. Além disso, este também é o primeiro relato que fornece evidências de que, além das proteínas luminais, ManIA também pode estar envolvido no ERAD de proteínas transmembrana. Nossos dados sugerem fortemente que ManIA manobra dentro de um ponto de controle de qualidade localizado cis-Golgi para servir como um sistema de backup para a vigilância ERAD no pronto-socorro, fornecendo, portanto, uma poderosa rede adicional para remoção adequada de proteínas NKCC2 mal dobradas indesejadas, protegendo, portanto, células da proteotoxicidade causada pela formação de agregados de proteínas, em particular durante a doença da síndrome de Bartter. Inegavelmente, ManIA não pode trabalhar isoladamente para mediar o ERAD do cotransportador. Apropriadamente, pode-se postular plausivelmente que ManIA trabalha em conjunto, sequencial ou simultaneamente, com outras proteínas de ligação NKCC2 e componentes ERAD, como OS9 [46] e STCH [53] para mediar o controle de qualidade ER do cotransportador. Nesse sentido, propomos um modelo em que, sob condições de estresse do RE: (1) OS9 está envolvido na retenção de proteínas NKCC2 mal dobradas no RE e seu ERAD pelo proteassoma. (2) O STCH desempenha um papel crucial no ERAD de NKCC2 pelas vias proteassômica e lisossômica. (3) Golgi ManIA contribui para o ERAD de NKCC2 capturando proteínas NKCC2 mal dobradas que escaparam ao controle de qualidade do RE e as devolvendo ao RE. Mais experimentos são necessários para descobrir o mecanismo preciso por trás desse modelo. A caracterização e identificação completas da composição molecular específica dos controles de qualidade ER e Golgi de NKCC2 e seus mutantes causadores de doenças podem oferecer uma base para definir novas estratégias terapêuticas visando o transporte de cotransportadores das redes ER e Golgi para a superfície celular.

Referências

1. Guyton, AC Controle da pressão arterial - papel especial dos rins e fluidos corporais. Ciência 1991, 252, 1813–1816. [CrossRef] [PubMed]

2. Lifton, RP; Gharavi, AG; Geller, DS Mecanismos moleculares da hipertensão humana. Cell 2001, 104, 545–556. [CruzRef]

3. Castrop, H.; Schiessl, IM Fisiologia e fisiopatologia do cotransportador renal Na-K-2Cl (NKCC2). Sou. J. Physiol. Ren. Physiol. 2014, 307, F991–F1002. [CruzRef]

4. Greger, R.; Velazquez, H. O ramo ascendente espesso cortical e o túbulo contorcido distal inicial no mecanismo de concentração urinária. Rim Int. 1987, 31, 590-596. [CrossRef] [PubMed]

5. Gamba, G. Fisiologia molecular e fisiopatologia dos cotransportadores de cátion-cloreto eletroneutros. Physiol. Rev. 2005, 85, 423–493. [CrossRef] [PubMed]

6. Ares, GR; Cáceres, PS; Ortiz, PA Regulação molecular de NKCC2 no ramo ascendente espesso. Sou. J. Physiol. Ren. Physiol. 2011, 301, F1143–F1159. [CrossRef] [PubMed]

7. Komhoff, M.; Laghmani, K. Fisiopatologia da síndrome de Bartter pré-natal. atual Opin. Nefrol. Hipertensos. 2017, 26, 419–425. [CrossRef] [PubMed]

8. Laghmani, K.; Beck, BB; Yang, SS; Seaayfan, E.; Wenzel, A.; Reusch, B.; Vitzthum, H.; Priem, D.; Demaretz, S.; Bergmann, K.; e outros Polidrâmnio, síndrome pré-natal transitória de Bartter e mutações MAGED2. N. Engl. J. Med. 2016, 374, 1853–1863. [CruzRef]

9. Simon, DB; Lifton, RP A base molecular da alcalose hipocalêmica hereditária: síndromes de Bartter e Gitelman. Sou. J. Physiol. 1996, 271, F961–F966. [CruzRef]

10. Aviv, A.; Hollenberg, NK; Weder, A. Excreção urinária de potássio e sensibilidade ao sódio em negros. Hipertensão 2004, 43, 707–713. [CruzRef]

11. Hoorn, EJ; Walsh, SB; McCormick, JA; Furstenberg, A.; Yang, CL; Roeschel, T.; Paliege, A.; Howie, AJ; Conley, J.; Bachmann, S.; e outros O inibidor de calcineurina, tacrolimus, ativa o cotransportador renal de cloreto de sódio para causar hipertensão. Nat. Med. 2011, 17, 1304–1309. [CrossRef] [PubMed]

12. Borschewski, A.; Himmerkus, N.; Boldt, C.; Blankenstein, KI; McCormick, JA; Lazelle, R.; Willnow, TE; Jankowski, V.; Planície, A.; Bleich, M.; e outros A calcineurina e o receptor relacionado à classificação com repetições do tipo A interagem para regular o cotransportador renal Na( mais )-K( mais )-2Cl(-). Geléia. Sociedade Nefrol. 2016, 27, 107–119. [CruzRef]

13. Trudu, M.; Janas, S.; Lanzani, C.; Debaix, H.; Schaeffer, C.; Ikehata, M.; Citterio, L.; Demaretz, S.; Trevisani, F.; Ristagno, G.; e outros Variantes comuns do gene UMOD não codificante induzem hipertensão sensível ao sal e danos renais por aumentar a expressão da uromodulina. Nat. Med. 2013, 19, 1655-1660. [CruzRef]

14. Alvarez-Guerra, M.; Garay, RP Renal Na-K-Cl cotransportador NKCC2 em ratos Dahl sensíveis ao sal. J. Hipertensos. 2002, 20, 721-727. [CruzRef]

15. Capasso, G.; Rizzo, M.; Evangelista, C.; Ferrari, P.; Geelen, G.; Lang, F.; Bianchi, G. Expressão alterada da membrana plasmática apical renal Na mais transportadores na fase inicial da hipertensão genética. Sou. J. Physiol. Ren. Physiol. 2005, 288, F1173–F1182. [CruzRef]

16. Fenton, RA; Knepper, MA Modelos de camundongos e o mecanismo de concentração urinária no novo milênio. Physiol. Rev. 2007, 87, 1083–1112. [CrossRef] [PubMed]

17. Komhoff, M.; Laghmani, K. MAGED2: Uma nova forma de síndrome de Bartter pré-natal. atual Opin. Nefrol. Hipertensos. 2018, 27, 323–328. [CruzRef]

18. Sands, JM Concentração urinária e diluição no rim envelhecido. Semin. Nefrol. 2009, 29, 579–586. [CruzRef]

19. Tian, ​​Y.; Riazi, S.; Khan, O.; Klein, JD; Sugimura, Y.; Verbalis, JG; Ecelbarger, subunidade CA Renal ENaC, abundâncias de cotransportadores Na-K-2Cl e Na-Cl em ratos F344 x Brown Norway idosos com restrição de água. Rim Int. 2006, 69, 304–312. [CrossRef] [PubMed]

20. Schiessl, IM; Castrop, H. Regulação do splicing e fosforilação de NKCC2. atual Opin. Nefrol. Hipertensos. 2015, 24, 457–462. [CrossRef] [PubMed]

21. Davies, M.; Fraser, SA; Galic, S.; Choy, SW; Katerelos, M.; Gleich, K.; Kemp, BE; Monte, PF; Power, DA Novos mecanismos de Na mais retenção na obesidade: Fosforilação de NKCC2 e regulação de SPAK/OSR1 por AMPK. Sou. J. Physiol. Ren. Physiol. 2014, 307, F96–F106. [CruzRef]

22. Gamba, G. Regulação da atividade NKCC2 por isoformas truncadas SPAK. Sou. J. Physiol. Ren. Physiol. 2014, 306, F49–F50. [CrossRef] [PubMed]

23. Edwards, A.; Castrop, H.; Laghmani, K.; Vallon, V.; Layton, AT Efeitos da regulação da isoforma NKCC2 no transporte de NaCl no ramo ascendente espesso e na mácula densa: um estudo de modelagem. Sou. J. Physiol. Ren. Physiol. 2014, 307, F137–F146. [CruzRef]

24. Vitale, A.; Denecke, J. A porta de entrada do retículo endoplasmático da via secretora. Plantar. Cell 1999, 11, 615–628. [PubMed]

25. Caplan, MJ Polaridade da membrana em células epiteliais: separação de proteínas e estabelecimento de domínios polarizados. Sou. J. Physiol. 1997, 272, F425–F429. [CruzRef]

26. Sol, Z.; Brodsky, JL Controle de qualidade de proteínas na via secretora. J. Cell Biol 2019, 218, 3171–3187. [CrossRef] [PubMed]

27. Ruggiano, A.; Foresti, O.; Carvalho, P. Controle de qualidade: Degradação associada ao ER: Controle de qualidade de proteínas e além. J. Cell Biol. 2014, 204, 869–879. [CrossRef] [PubMed]

28. Ruddock, LW; Molinari, M. Processamento de N-glicanos no controle de qualidade ER. J. Cell Sci. 2006, 119, 4373–4380. [CruzRef]

29. Molinari, M. A estrutura do N-glicano determina a extensão do dobramento da proteína ou o início do descarte. Nat. Chem. Biol. 2007, 3, 313–320. [CruzRef]

30. Hebert, DN; Garman, SC; Molinari, M. O código glicano do retículo endoplasmático: carboidratos ligados à asparagina como marcadores de maturação e controle de qualidade de proteínas. Trends Cell Biol. 2005, 15, 364-370. [CruzRef]

31. Igdoura, SA; Herscovics, A.; Lal, A.; Moremen, KW; Morales, CR; Hermo, L. Alfa-manosidases envolvidas no processamento de N-glicanos mostram especificidade celular e subcompartimentalização distinta dentro do aparelho de Golgi de células no testículo e epidídimo. EUR. J. Cell Biol. 1999, 78, 441–452. [CruzRef]

32. Lederkremer, GZ; Glickman, MH Uma janela de oportunidade: cronometrar a degradação de proteínas pelo corte de açúcares e ubiquitinas. Tendências Bioquímica. ciência 2005, 30, 297–303. [CrossRef] [PubMed]

33. Stanley, P.; Taniguchi, N.; Aebi, M. N-Glycans. Em Essentials of Glycobiology, 3º; Varki, A., Cummings, RD, Esko, JD, Stanley, P., Hart, GW, Aebi, M., Darvill, AG, et al., Eds.; Cold Spring Harbor: Nova York, NY, EUA, 2015; pp. 99–111.

34. Barlowe, CK; Miller, EA Biogênese e tráfego de proteínas secretoras na via secretora inicial. Genética 2013, 193, 383–410. [CruzRef]

35. Wu, X.; Rapoport, TA Mechanistic insights sobre a degradação de proteínas associadas ao ER. atual Opin. Cell Biol. 2018, 53, 22–28. [CruzRef]

36. Sol, Z.; Brodsky, JL A via de degradação de uma proteína modelo mal dobrada é determinada pela propensão à agregação. Mol. Célula Biol. 2018, 29, 1422–1434. [CruzRef]

37. Fresno, I.; Molinari, M. Depuração proteassômica e lisossômica de proteínas secretoras defeituosas: vias de degradação associada ao ER (ERAD) e degradação associada ao ER para lisossoma (ERLAD). Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2019, 54, 153–163. [CrossRef] [PubMed]

38. Briant, K.; Johnson, N.; Swanton, E. Os sistemas de controle de qualidade do domínio transmembrana operam no retículo endoplasmático e no aparelho de Golgi. PLoS ONE 2017, 12, e0173924. [CrossRef] [PubMed]

39. Jensen, TJ; Loo, MA; Pind, S.; Williams, DB; Goldberg, AL; Riordan, JR Múltiplos sistemas proteolíticos, incluindo o proteassoma, contribuem para o processamento CFTR. Cell 1995, 83, 129–135. [CruzRef]

40. Ward, CL; Omura, S.; Kopito, RR Degradação de CFTR pela via ubiquitina-proteassoma. Cell 1995, 83, 121–127. [CruzRef]

41. Gong, Q.; Keeney, DR; Molinari, M.; Zhou, Z. Degradação de canais mutantes tipo II da síndrome do QT longo com defeito de tráfego pela via ubiquitina-proteassoma. J. Biol. Chem. 2005, 280, 19419–19425. [CruzRef]

42. O'Donnell, BM; Mackie, TD; Subramanya, AR; Brodsky, JL A degradação associada ao retículo endoplasmático do canal de potássio renal, ROMK, leva à síndrome de Bartter tipo II. J. Biol. Chem. 2017, 292, 12813–12827. [CrossRef] [PubMed]

43. Needham, PG; Mikoluk, K.; Dhakarwal, P.; Khadem, S.; Snyder, AC; Subramanya, AR; Brodsky, JL O cotransportador de NaCl sensível à tiazida é direcionado para a degradação associada ao retículo endoplasmático dependente de chaperona. J. Biol. Chem. 2011, 286, 43611–43621. [CrossRef] [PubMed]

44. Zaarour, N.; Demaretz, S.; Defontaine, N.; Zhu, Y.; Laghmani, K. Múltiplos motivos di-leucina evolutivamente conservados no terminal carboxila controlam o tráfego anterógrado de NKCC2. J. Biol. Chem. 2012, 287, 42642–42653. [CruzRef]

45. Zaarour, N.; Demaretz, S.; Defontaine, N.; Mordasini, D.; Laghmani, K. Um motivo altamente conservado no terminal COOH dita a saída do retículo endoplasmático e a expressão da superfície celular de NKCC2. J. Biol. Chem. 2009, 284, 21752–21764. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Seaayfan, E.; Defontaine, N.; Demaretz, S.; Zaarour, N.; Laghmani, K. A proteína OS9 interage com o cotransportador Na-K-2Cl (NKCC2) e direciona sua forma imatura para a via de degradação associada ao retículo endoplasmático. J. Biol. Chem. 2016, 291, 4487–4502. [CruzRef]

47. Brodsky, JL Os papéis protetores e destrutivos desempenhados por chaperonas moleculares durante ERAD (degradação associada ao retículo endoplasmático). Bioquim. J. 2007, 404, 353–363. [CruzRef]

48. Guerriero, CJ; Brodsky, JL O delicado equilíbrio entre dobramento de proteína secretada e degradação associada ao retículo endoplasmático na fisiologia humana. Physiol. Rev. 2012, 92, 537–576. [CruzRef]

49. Ahner, A.; Gong, X.; Frizzell, RA Degradação do regulador de condutância transmembrana da fibrose cística: Conversa cruzada entre as vias de ubiquitilação e SUMOilação. FEBS J. 2013, 280, 4430–4438. [CruzRef]

50. Donnelly, BF; Needham, PG; Snyder, CA; Roy, A.; Khadem, S.; Brodsky, JL; Subramanya, AR Hsp70 e Hsp90 complexos multichaperona regulam sequencialmente a biogênese e degradação associada ao retículo endoplasmático do cotransportador sensível à tiazida. J. Biol. Chem. 2013, 288, 13124–13135. [CruzRef]

51. Benziane, B.; Demaretz, S.; Defontaine, N.; Zaarour, N.; Cheval, L.; Bourgeois, S.; Klein, C.; Froissart, M.; Blanchard, A.; Paillard, M.; e outros Expressão de superfície de NKCC2 em células de mamíferos: Regulação negativa por nova interação com aldolase BJ Biol. Chem. 2007, 282, 33817–33830. [CruzRef]

52. Zaarour, N.; Defontaine, N.; Demaretz, S.; Azroyan, A.; Cheval, L.; Laghmani, K. A proteína de membrana transportadora secretora 2 regula a inserção exocítica de NKCC2 na membrana celular. J. Biol. Chem. 2011, 286, 9489–9502. [CruzRef]

53. Bakhos-Douaihy, D.; Seaayfan, E.; Demaretz, S.; Komhoff, M.; Laghmani, K. Efeitos diferenciais de STCH e Hsp70 induzível por estresse na estabilidade e maturação de NKCC2. Int. J. Mol. ciência 2021, 22, 2207. [CrossRef]

54. Herscovics, A.; Schneikert, J.; Athanassiadis, A.; Moremen, KW Isolamento de um cDNA de manosidase Golgi de camundongo, um membro de uma família de genes conservada desde leveduras até mamíferos. J. Biol. Chem. 1994, 269, 9864–9871. [CruzRef]

55. Tempel, W.; Karaveg, K.; Liu, ZJ; Rosa, J.; Wang, BC; Moremen, KW A estrutura da alfa-manosidase IA de Golgi de camundongo revela a base molecular para a especificidade do substrato entre a classe 1 (família 47 glicosilhidrolases) alfa1,2-manosidases. J. Biol. Chem. 2004, 279, 29774–29786. [CruzRef]

56. Tulsiani, DR; Touster, O. A purificação e caracterização de manosidase IA de membranas de Golgi de fígado de rato. J. Biol. Chem. 1988, 263, 5408-5417. [CruzRef]

57. Hosokawa, N.; Você, Z.; Tremblay, LO; Nagata, K.; Herscovics, A. Estimulação de ERAD de alfa de Hong Kong nula1- antitripsina por Golgi alpha1,2-manosidases. Bioquim. Biophys. Res. Comum. 2007, 362, 626–632. [CrossRef] [PubMed]

58. Ogen-Shtern, N.; Avezov, E.; Shenkman, M.; Benyair, R.; Lederkremer, GZ Manosidase IA está em vesículas de controle de qualidade e participa do direcionamento de glicoproteína para ERAD. J. Mol. Biol. 2016, 428, 3194–3205. [CruzRef]

59. Iannotti, MJ; Figard, L.; Sokac, AM; Sifers, RN A manosidase localizada em Golgi (MAN1B1) desempenha um papel de guardião não enzimático no controle de qualidade da biossíntese de proteínas. J. Biol. Chem. 2014, 289, 11844–11858. [CrossRef] [PubMed]

60. Pan, S.; Cheng, X.; Sifers, retículo endoplasmático situado no RN Golgi alfa-1, 2-manosidase contribui para a recuperação de substratos ERAD através da interação direta com gama-COP. Mol. Biol. Cell 2013, 24, 1111–1121. [CrossRef] [PubMed]

61. Shaukat, I.; Bakhos-Douaihy, D.; Zhu, Y.; Seaayfan, E.; Demaretz, S.; Frachon, N.; Weber, S.; Komhoff, M.; Vargas-Poussou, R.; Laghmani, K. Novos insights sobre o papel da degradação associada ao retículo endoplasmático na Síndrome de Bartter Tipo 1. Hum. mutante. 2021, 42, 947–968. [CruzRef]

62. Fujita, E.; Kouroku, Y.; Isoai, A.; Kumagai, H.; Misutani, A.; Matsuda, C.; Hayashi, YK; Momoi, T. Dois sistemas de degradação associada ao retículo endoplasmático (ERAD) para a nova variante da disferlina mutante: Ubiquitina/proteassoma ERAD(I) e autofagia/lisossoma ERAD(II). Zumbir. Mol. Genet. 2007, 16, 618–629. [CruzRef]

63. Bernasconi, R.; Molinari, M. ERAD e sintonia ERAD: Descarte de carga e reguladores ERAD do ER de mamíferos. atual Opin. Célula. Biol. 2011, 23, 176–183. [CruzRef]

64. Arvan, P.; Zhao, X.; Ramos-Castaneda, J.; Chang, A. Controle de qualidade da via secretora operando em Golgi, plasmalema e sistemas endossomais. Traffic 2002, 3, 771–780. [CruzRef]

65. Stolz, A.; Wolf, DH Degradação de proteínas associadas ao retículo endoplasmático: uma jornada assistida por um acompanhante para o inferno. Biochim. Biophys. Acta 2010, 1803, 694-705. [CrossRef] [PubMed]

66. Wang, F.; Canção, W.; Brancati, G.; Segatori, L. A inibição da degradação associada ao retículo endoplasmático resgata o dobramento nativo em doenças de dobramento incorreto de proteínas com perda de função. J. Biol. Chem. 2011, 286, 43454–43464. [CrossRef] [PubMed]

67. Tokunaga, F.; Brostrom, C.; Koide, T.; Arvan, P. A degradação associada ao retículo endoplasmático (ER) de glicoproteínas N-ligadas mal dobradas é suprimida após a inibição da manosidase ER IJ Biol. Chem. 2000, 275, 40757–40764. [CrossRef] [PubMed]

68. Groisman, B.; Shenkman, M.; Rony, E.; Lederkremer, GZ O corte de manose é necessário para a entrega de uma glicoproteína de EDEM1 para XTP3-B e etapas de degradação tardia associadas ao retículo endoplasmático. J. Biol. Chem. 2011, 286, 1292–1300. [CrossRef] [PubMed]

69. Vargas-Poussou, R.; Feldmann, D.; Vollmer, M.; Konrad, M.; Kelly, L.; van den Heuvel, LP; Tebourbi, L.; Brandis, M.; Karolyi, L.; Hebert, SC; e outros Novas variantes moleculares do gene cotransportador Na-K-2Cl são responsáveis ​​pela síndrome de Bartter pré-natal. Sou. J. Hum. Genet. 1998, 62, 1332–1340. [CrossRef] [PubMed]

70. Helenius, A.; Aebi, M. Papéis de glicanos ligados a N no retículo endoplasmático. Annu. Rev. Biochem. 2004, 73, 1019–1049. [CruzRef]

71. Spiro, RG Papel dos oligossacarídeos de polimanose ligados a N no direcionamento de glicoproteínas para degradação associada ao retículo endoplasmático. Célula Mol. Ciência da Vida. 2004, 61, 1025–1041. [CruzRef]

72. Marcus, NY; Perlmutter, DH Glucosidase e inibidores de manosidase medeiam o aumento da secreção de alfa1 antitripsina mutante ZJ Biol. Chem. 2000, 275, 1987–1992. [CruzRef]

73. Liu, Y.; Choudhury, P.; Cabral, CM; Sifers, RN A eliminação intracelular de alfa1-antitripsina humana incompletamente dobrada envolve a liberação da calnexina e o corte pós-traducional de oligossacarídeos ligados à asparagina. J. Biol. Chem. 1997, 272, 7946–7951. [CrossRef] [PubMed]

74. Cabral, CM; Liu, Y.; Sifers, RN Dissecando o controle de qualidade da glicoproteína na via secretora. Tendências Bioquímica. ciência 2001, 26, 619–624. [CruzRef]

75. Ermonval, M.; Kitzmuller, C.; Mir, AM; Cacan, R.; Ivessa, NE A estrutura do N-glicano de uma variante de vida curta da riboforina I expressa na linha celular MadIA214 com defeito na glicosilação revela o papel de uma manosidase que não é a manosidase I do ER no processo de degradação da glicoproteína. Glycobiology 2001, 11, 565–576. [CrossRef] [PubMed]

76. Foulquier, F.; Edredom, S.; Klein, A.; Mir, AM; Chirat, F.; Cacan, R. Degradação associada ao retículo endoplasmático de glicoproteínas com as espécies Man5GlcNAc2 e Man9GlcNAc2 na linha celular MI8-5 CHO. EUR. J. Biochem. 2004, 271, 398-404. [CruzRef]

77. Avezov, E.; Frenkel, Z.; Ehrlich, M.; Herscovics, A.; Lederkremer, GZ A manosidase I do retículo endoplasmático (ER) é compartimentalizada e necessária para o ajuste de N-glicano para Man5-6GlcNAc2 na degradação associada à glicoproteína ER. Mol. Biol. Cell 2008, 19, 216–225. [CruzRef]

78. Hosokawa, N.; Tremblay, LO; Você, Z.; Herscovics, A.; Wada, I.; Nagata, K. Aprimoramento da degradação do retículo endoplasmático (ER) da alfa1-antitripsina Null Hong Kong mal dobrada pela manosidase ER humana IJ Biol. Chem. 2003, 278, 26287–26294. [CruzRef]

79. Sifers, biologia celular RN. Degradação de proteínas desbloqueada. Ciência 2003, 299, 1330–1331. [CruzRef]

80. Wu, Y.; Swulius, MT; Moremen, KW; Sifers, RN Elucidação da lógica molecular pela qual alfa 1-antitripsina mal dobrada é preferencialmente selecionada para degradação. Proc. Nacional Acad. ciência EUA 2003, 100, 8229–8234. [CrossRef] [PubMed]

81. Hirao, K.; Natsuka, Y.; Tamura, T.; Wada, I.; Morito, D.; Natsuka, S.; Romero, P.; Sleno, B.; Tremblay, LO; Herscovics, A.; e outros EDEM3, um homólogo de EDEM solúvel, aumenta a degradação associada ao retículo endoplasmático glicoproteico e o corte de manose. J. Biol. Chem. 2006, 281, 9650–9658. [CruzRef]

82. Olivari, S.; Cali, T.; Salo, KE; Paganetti, P.; Ruddock, LW; Molinari, M. EDEM1 regula a degradação associada a ER acelerando a desmanosilação de polipeptídeos defeituosos de dobramento e inibindo sua agregação covalente. Bioquim. Biophys. Res. Comum. 2006, 349, 1278–1284. [CrossRef] [PubMed]

83. Bieberich, E.; Bause, E. Man9-manosidase do rim humano é expressa em células COS como uma N-glicoproteína transmembrana tipo II residente em Golgi. EUR. J. Biochem. 1995, 233, 644–649. [CrossRef] [PubMed]

84. Velasco, A.; Hendricks, L.; Moremen, KW; Tulsiani, DR; Touster, O.; Farquhar, MG Variações dependentes do tipo de célula na distribuição subcelular de alfa-manosidase I e II. J. Cell Biol. 1993, 122, 39–51. [CrossRef] [PubMed]

85. Bieberich, E.; Treml, K.; Volker, C.; Rolfs, A.; Kalz-Fuller, B.; Bause, E. Man9-manosidase de fígado de porco é uma proteína de membrana do tipo II que reside no retículo endoplasmático. Clonagem de cDNA e expressão da enzima em células COS 1. EUR. J. Biochem. 1997, 246, 681-689. [CruzRef]

86. Rony, E.; Shenkman, M.; Groisman, B.; Izenshtein, Y.; Leitman, J.; Lederkremer, GZ Desvio da entrega de glicoproteína dependente de glicano para ERAD por EDEM1 regulado positivamente. Mol. Biol. Cell 2011, 22, 3945–3954. [CruzRef]

87. Casagrande, R.; Stern, P.; Diehn, M.; Shamu, C.; Osário, M.; Zuniga, M.; Brown, PO; Ploegh, H. A degradação de proteínas do ER de S. cerevisiae requer uma via de resposta de proteína desdobrada intacta. Mol. Cell 2000, 5, 729–735. [CruzRef]

88. Schroder, M.; Kaufman, RJ Estresse de ER e a resposta de proteína desdobrada. mutante. Res. 2005, 569, 29–63. [CruzRef]

89. Liang, CJ; Chang, YC; Chang, CH; Wang, CK; Hung, YC; Lin, YE; Chan, CC; Chen, CH; Chang, HY; Sang, TK Derlin-1 regula a patogênese ligada a VCP mutante e a apoptose induzida por estresse do retículo endoplasmático. PLoS Genet. 2014, 10, e1004675. [CrossRef] [PubMed]

90. Houck, SA; Singh, S.; Cyr, DM Respostas celulares a proteínas mal dobradas e agregados de proteínas. Métodos Mol. Biol. 2012, 832, 455–461. [CrossRef] [PubMed]

91. Chaudhuri, TK; Paul, S. Doenças de dobramento incorreto de proteínas e abordagens terapêuticas baseadas em acompanhantes. FEBS J. 2006, 273, 1331–1349. [CruzRef]

92. Yadav, K.; Yadav, A.; Vashistha, P.; Pandey, vice-presidente; Dwivedi, Doenças de Desdobramento de Proteínas da ONU e Abordagens Terapêuticas. atual Proteína. Pept. ciência 2019, 20, 1226–1245. [CruzRef]

93. Fresno, I.; Molinari, M. Revitalização do retículo endoplasmático: ER-page e outros sabores na depuração seletiva e não seletiva do ER. F1000Res 2018, 7, 454. [CrossRef]

94. Okiyoneda, T.; Apaja, PM; Lukacs, GL Controle de qualidade de proteínas na membrana plasmática. atual Opin. Cell Biol. 2011, 23, 483–491. [CruzRef]

95. Caldwell, SR; Colina, KJ; Cooper, AA A degradação dos substratos de controle de qualidade do retículo endoplasmático (ER) requer transporte entre o RE e o Golgi. J. Biol. Chem. 2001, 276, 23296–23303. [CrossRef] [PubMed]

96. Táxis, C.; Vogel, F.; Wolf, DH O tráfego ER-Golgi é um pré-requisito para a degradação eficiente do ER. Mol. Biol. Cell 2002, 13, 1806–1818. [CrossRef] [PubMed]

97. Vashist, S.; Ng, DT As proteínas mal dobradas são classificadas por um mecanismo de ponto de verificação sequencial do controle de qualidade do ER. J. Cell Biol. 2004, 165, 41–52. [CrossRef] [PubMed]

98. Schmidt, O.; Weyer, Y.; Baumann, V.; Widerin, MA; Eising, S.; Angelova, M.; Schleiffer, A.; Kremser, L.; Lindner, H.; Pedro, M.; e outros A degradação endossomal e associada ao Golgi (EGAD) das proteínas da membrana regulam o metabolismo dos esfingolipídeos. EMBO J. 2019, 38, e101433. [CruzRef]

99. Pan, S.; Wang, S.; Utama, B.; Huang, L.; Blok, N.; Estes, MK; Moremen, KW; Sifers, RN A localização de Golgi de ERManI define a separação espacial do sistema de controle de qualidade da glicoproteína de mamífero. Mol. Biol. Cell 2011, 22, 2810–2822. [CruzRef]

Sylvie Demaretz 1,2, Elie Seaayfan 1,2,† , Dalal Bakhos-Douaihy 1,2, Nadia Frachon 1,2, Martin Kömhoff 3 e Kamel Laghmani 1,2,

1 Centre de Recherche des Cordeliers, Sorbonne Université, Inserm, Université de Paris, F-75006 Paris, França; sylvie.demaretz@sorbonne-universite.fr (SD); elie.seaayfan@uni-marburg.de (ES); dalal.bakhos_aldouaihy@sorbonne-universite.fr (DB-D.); nadia.frachon@sorbonne-universite.fr (NF)

2 CNRS, ERL8228, F-75006 Paris, França

3 Divisão de Nefrologia Pediátrica e Transplante, University Children's Hospital, Philipps-University, 35043 Marburg, Alemanha; Martin.Koemhoff@uk-gm.de