O ácido ascórbico regula a imunidade, anti-oxidação e apoptose em Abalone Haliotis Discus Hannai Ino Parte 1

Abstrato: O presente estudo foi conduzido para investigar o papel do ácido ascórbico (AA) na resposta imune, anti-oxidação e apoptose em abalone (Haliotis discus hannai Ino). Sete dietas semipurificadas com níveis graduados de AA (0, 50, 100, 200, 500, 1000 e 5000 mg/kg) foram fornecidas a abalone (inicial peso: 12,01 ± 0,001 g, comprimento inicial da casca: 48,44 ± 0,069 mm) por 100 dias. A sobrevivência, taxa de ganho de peso e incremento diário no comprimento da concha não foram afetados pelos AA dietéticos. O conteúdo de AA nas brânquias, músculos e glândulas digestivas do abalone foi significativamente aumentado pelo AA dietético. Em termos de imunidade, o AA dietético melhorou significativamente a contagem total de hemócitos, explosão respiratória e atividade fagocítica na hemolinfa e atividade da lisozima na hemolinfa livre de células (CFH). Na glândula digestiva, as vias de sinalização TLR-MyD88-dependente e TLR-MyD88-independente foram suprimidas pela suplementação dietética de AA. Os níveis de mRNA de -defensina e arginase-I na glândula digestiva foram significativamente aumentados por AA dietético. Na brânquia, apenas a via de sinalização dependente de TLR-MyD88-foi deprimida pelo AA dietético para reduzir a inflamação no abalone. O nível de criação de mitos 6 na brânquia foi significativamente aumentado por AA dietético. Após a infecção por Vibrio parahaemolyticus, a via de sinalização TLR na glândula digestiva foi suprimida por AA dietético, o que reduziu a inflamação no abalone. Em termos de atividades antioxidantes, superóxido dismutase, glutationa peroxidase e catalase, bem como capacidade antioxidante total e conteúdo reduzido de glutationa no CFH, todos foram significativamente aumentados. O conteúdo de malondialdeído foi significativamente diminuído pelo AA dietético. A capacidade antioxidante foi aprimorada ao ativar a via Keap1-Nrf2 no ​​abalone. Em termos de apoptose, o AA dietético pode aumentar a capacidade anti-apoptose por meio da cascata de sinalização JNK-Bcl-2/Bax no abalone. Para concluir, o AA dietético estava envolvido na regulação da imunidade, anti-oxidação e apoptose em abalone.

O glicosídeo de cistanche também pode aumentar a atividade de SOD nos tecidos do coração e do fígado e reduzir significativamente o conteúdo de lipofuscina e MDA em cada tecido, eliminando efetivamente vários radicais reativos de oxigênio (OH-, H₂O₂, etc.) e protegendo contra danos ao DNA causados por radicais OH. Os glicosídeos feniletanóides cistanche têm uma forte capacidade de eliminação de radicais livres, uma capacidade redutora maior do que a vitamina C, melhoram a atividade de SOD na suspensão de esperma, reduzem o conteúdo de MDA e têm um certo efeito protetor na função da membrana espermática. Os polissacarídeos Cistanche podem aumentar a atividade de SOD e GSH-Px em eritrócitos e tecidos pulmonares de camundongos experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactose, bem como reduzir o conteúdo de MDA e colágeno no pulmão e no plasma e aumentar o conteúdo de elastina, têm um bom efeito de eliminação no DPPH, prolongar o tempo de hipóxia em camundongos senescentes, melhorar a atividade de SOD no soro e retardar a degeneração fisiológica do pulmão em camundongos experimentalmente senescentes Com degeneração morfológica celular, experimentos mostraram que Cistanche tem boa capacidade antioxidante e tem potencial para ser um medicamento para prevenir e tratar doenças de envelhecimento da pele. Ao mesmo tempo, o echinacoside em Cistanche tem uma capacidade significativa de eliminar os radicais livres DPPH e tem a capacidade de eliminar espécies reativas de oxigênio e prevenir a degradação do colágeno induzida por radicais livres, e também tem um bom efeito de reparo nos danos causados ​​pelos radicais livres da timina.

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Palavras-chave: abalone; ácido ascórbico; imune; anti-oxidação; apoptose

1. Introdução

O ácido ascórbico (AA), também conhecido como vitamina C, é conhecido por ser um micronutriente essencial que serve como cofator associado ao aumento da atividade de múltiplas enzimas humanas e contribui para a resposta imune e desenvolvimento do sistema nervoso em humanos [1,2 ]. Devido à limitada capacidade de preservação do AA no organismo, é necessária uma ingestão regular e adequada para prevenir a deficiência de AA. AA é necessária em quantidades vestigiais de fontes exógenas para crescimento médio, atividades fisiológicas, reprodução e saúde na maioria dos mamíferos [3-5]. Em relação às funções imunológicas, o AA contribui para manter a integridade da barreira imunológica e a cicatrização de feridas [1]. Pode aumentar a função dos fagócitos, como melhorar sua motilidade, quimiotaxia, fagocitose e morte microbiana [6-9]. Estudos anteriores relataram vários efeitos imunológicos de AA em células B, células T e células NK em mamíferos [10-12]. Enquanto isso, o AA também está associado à apoptose. Ele inibe a apoptose miocárdica impedindo Bax (BCL-2 proteína X associada) e aumenta a capacidade de Bcl-2 (regulador de apoptose bcl-2) de inibir a liberação de citocromo-C das mitocôndrias para o citoplasma e subsequentemente reduz a caspase-3, que inicia a apoptose [13]. Como antioxidante natural, o AA reduz as espécies reativas de oxigênio (ROS) e as espécies reativas de nitrogênio (RNS), dotando-as de elétrons e impedindo a oxidação de outros compostos [14-17]. AA também pode permitir que outras moléculas antioxidantes, como glutationa (GSH), -caroteno, urato e -tocoferol, se regenerem a partir de seus respectivos radicais livres [18,19].

Em contraste com os animais terrestres, existem relativamente poucos relatos sobre resposta imune e apoptose em animais aquáticos. Quantidades adequadas de AA na dieta podem otimizar o crescimento, a saúde e a resistência ao estresse em animais aquáticos [20]. A maioria dos estudos sobre AA em animais aquáticos concentra-se em estimar os requisitos mínimos de AA para crescimento máximo e formular uma dieta de menor custo. Os requisitos de AA variam entre espécies, tamanho, dieta e condições de cultivo. A quantidade recomendada de AA na dieta varia de 10 a 10,000 mg/kg [21]. A exigência mínima de AA na dieta para suportar a taxa máxima de crescimento (WG) foi de 53–186 mg/kg em tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), 1200 mg/kg no atum rabilho do Pacífico (Thunnus orientalis) e 5000–1000 mg/kg em camarão kuruma (Marsupenaeus japonicas) [22-24]. No entanto, o GP ou a taxa de crescimento específico (SGR) não foi significativamente afetado pela dieta AA em algumas espécies de peixes, como o esturjão siberiano (Acipenser baerii), a dourada (Pagrus major) e a enguia japonesa (Anguilla japonica) [25-27 ].

Foi demonstrado que a suplementação dietética de AA aumenta as funções imunológicas, como a fagocitose e a atividade da lisozima em muitas espécies de peixes [28-30]. O aumento da sobrevivência à exposição a patógenos (por exemplo, bactérias e parasitas) foi relatado em tilápia do Nilo, peixe-gato asiático (Clarias batrachus) e camarão branco do Pacífico (Litopenaeus vannamei) após a ingestão dietética de AA [31-34]. A deficiência de AA diminuiu a atividade da lisozima (LZM), o componente 3 do complemento (C3) e o conteúdo de C4 na carpa capim (Ctenopharyngodon idella) [35]. Também pode reduzir os níveis de peptídeos antimicrobianos, como -defensina e hepcidina, e citocinas antiinflamatórias, incluindo interleucina (IL) 4/13A, IL-10 e fator de crescimento transformador (TGF) 1/2; enquanto aumenta a regulação de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-1 e fator nuclear κB (NF-κB) na carpa capim [35]. Além disso, a deficiência de AA aumentou o fator de ativação da protease apoptótica-1, caspase-3 e caspase-7–9 para agravar a apoptose celular na carpa capim [35,36].

O abalone é uma das espécies comerciais mais importantes da ordem de moluscos Archaeogastropoda. É um importante animal modelo para o estudo da biologia ecológica e do desenvolvimento de gastrópodes (Mollusca) [37,38]. Entre as espécies cultivadas de abalone, o abalone do Pacífico (H. discus hannai Ino) é a espécie cultivada preferida na China. Mai relatou que a suplementação dietética de AA de 0 a 8000 mg/kg não afetou significativamente o SGR ou a taxa de sobrevivência (SR) de abalone juvenil [39]. Wu e outros. relataram que o AA dietético influenciou a expressão de genes relacionados a respostas antioxidantes na glândula digestiva de abalone para melhorar sua resistência ao estresse [40]. Além disso, o surto de doenças pode causar enormes perdas econômicas para a indústria do abalone [41,42]. Os moluscos carecem de imunidade adaptativa e dependem da imunidade inata [43]. Portanto, o presente estudo teve como objetivo investigar os papéis dos AA na regulação da imunidade, anti-oxidação e apoptose em abalone H. discus hannai e fornecerá instrução científica para a regulação saudável da formulação dietética em abalone.

2. Materiais e métodos

2.1. Declaração ética

Todos os procedimentos de cuidado e manuseio de animais realizados no presente estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Ocean University of China (Aprovação No. SPXY2020012).

2.2. Dieta Experimental

A dieta basal (AA{{{{10}}}}) foi formulada a partir de ingredientes purificados para conter aproximadamente 30 por cento de proteína dietética e 3,5 por cento de lipídios dietéticos (Tabela 1). Caseína (livre de vitaminas) e gelatina foram usadas como fontes de proteína, e óleo de soja e óleo de peixe menhaden (1:1) foram usados ​​como fontes lipídicas, o que pode ser suficiente para manter o crescimento ideal para H. discus hannai [44-46 ]. Níveis graduados de AA (0, 50, 100, 200, 500, 1000 e 5000 mg/kg) foram adicionados à dieta basal para formular as sete dietas experimentais. O AA foi adicionado às dietas na forma de L-ascorbil-2-monofosfato. Essas dietas foram designadas como AA0, AA50, AA100, AA200, AA500, AA1000 e AA5000, respectivamente. Os teores de AA analisados ​​na dieta foram 0,00, 47,31, 78,25, 189,05, 451,73, 919,99 e 4821,17 mg/kg, respectivamente. O método de cromatografia líquida de alta eficiência foi usado para analisar o conteúdo dietético de AA [40]. A proteína bruta dietética, lipídio bruto e cinzas foram medidos de acordo com os métodos padrão da Associação de Químicos Analíticos [47].

2.3. Teste de lixiviação

A lixiviação de AA dietético foi apresentada como a eficiência de retenção (RE). As dietas experimentais com três repetições foram imersas em água do mar a 23,23,0 ± 0,5 ◦C. As dietas imersas foram retiradas em tempo determinado (1, 3, 6 e 12 h, respectivamente) e foram liofilizadas para análise do teor de AA.

RE ( por cento )=(AA retido na dieta após a imersão)/(AA contido na dieta antes da imersão) × 100.

2.4. Teste de alimentação

Juvenis de abalone foram obtidos de uma empresa de pesca em Fuzhou (Fujian, China) e foram aclimatados às condições de laboratório por duas semanas, com a dieta basal, em um sistema de recirculação de água com tanques (10{{1{{21 }}}} × 50 × 40 cm). Depois disso, abalones de tamanho semelhante (peso inicial: 12,01 ± 0,001 g, comprimento inicial da concha: 48,44 ± 0,069 mm) foram distribuídos aleatoriamente em 21 tanques (45 abalones por tanque). A cada três tanques foi considerado um tratamento. Todos os tanques foram mantidos em penumbra com cortinas plásticas pretas. Os abalones foram alimentados à mão uma vez ao dia às 17:00. As fezes e dietas não consumidas foram removidas às 8:00 todas as manhãs. Durante o teste de alimentação de 100-dia, a temperatura da água foi de 23,0 ± 0,5 ◦C, a salinidade foi de 30–33‰, o pH foi de 7,4–7,9 e o oxigênio dissolvido foi maior ou igual a 7,0 mg/L.

2.5. Teste de desafio Vibrio Parahaemolyticus

Após o ensaio de alimentação, quinze abalones de cada tanque foram utilizados para o teste de desafio com V. parahaemolyticus patogênico. Abalones foram desafiados com 100 µL de V. parahaemolyticus (1,2 × 106 cfu/mL) por injeção muscular in vivo. A glândula digestiva foi coletada em 0, 6, 12, 24, 48 e 72 h, respectivamente, e armazenada a -80 ◦C para análise qPCR.

2.6. Coleta de amostras

No final do ensaio de alimentação, os abalones foram mantidos em jejum durante três dias antes de serem contados e pesados. Todos os abalones foram anestesiados com 5 por cento de álcool etílico antes da amostragem. A hemolinfa foi coletada de quatro abalones em cada tanque para analisar a contagem total de hemócitos (THC), explosão respiratória (RB) e atividade fagocítica (PA). Para analisar a atividade da enzima na hemolinfa livre de células (CFH), a hemolinfa foi coletada de outros dez abalones em cada tanque e centrifugada (3000× g a 4 ◦C) por 10 min; o CFH foi armazenado a -80 ◦C até o uso. A glândula digestiva, brânquia, músculo e manto foram amostrados de dez abalones coletados com hemolinfa por tanque e armazenados a -80 ◦C até o uso.

2.7. Teor de Ácido Ascórbico

O conteúdo de AA no CFH, músculo, manto, brânquia e glândula digestiva foi detectado usando um kit de ensaio de ascorbato redutor de ferro (BioVision, Milpitas, CA, EUA). O CFH pode ser usado diretamente para medir o conteúdo de AA de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de 0,1 g de músculo, manto, brânquia e glândula digestiva foram homogeneizadas em 1 mL de água destilada pré-resfriada. O teor de AA foi medido por absorbância a 593 nm.

2.8. Parâmetros imunológicos na hemolinfa

A hemolinfa foi completamente misturada usando um volume igual de anticoagulante pré-resfriado (100 mmol/L EDTA Na2, 450 mmol/L NaCl, 10 mmol/L KCl, 10 mmol/L HEPES, pH 7,3, 850 mOs mol/kg) para diluir a hemolinfa.

O THC foi contado usando um hemocitômetro sob o microscópio (CX31, OLYMPUS, Tóquio, Japão).

A redução do nitroblue tetrazolium (NBT) nos hemócitos, que pode ser representada pela atividade do RB, foi medida de acordo com os métodos de Anderson et al., com algumas modificações [48]. Resumidamente, a hemolinfa foi ajustada para 5 × 106 células/mL usando anticoagulante e foi centrifugada a 3.000 × g a 4 ◦C por 10 min. O precipitado celular foi corado com 100 µL de 1 µg/mL de PMA (acetato de miristato de forbol, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EUA) dissolvido em DMSO (dimetil sulfóxido, Solarbio, Pequim, China) e incubado a 37 ◦C por 30 minutos. Após a incubação, 100 µL de NBT a 0,3 por cento dissolvido por Hank's Balanced Salt Solution (Solarbio, Pequim, China) foram adicionados às células e incubados a 37 ◦C por 30 min antes da centrifugação (560 × g a 4 ◦C por 10 min) . O sobrenadante foi removido com cuidado e a reação foi encerrada usando 200 µL de metanol por 10 min. Depois disso, a célula foi lavada três vezes com 70% (v/v) de metanol antes de ser seca ao ar. O cristal azul de formazan foi dissolvido usando 120 µL de 2 M KOH e 140 µL de DMSO. A densidade óptica (DO) foi lida em um espectrofotômetro a 630 nm contra um branco de KOH/DMSO.

A PA da hemolinfa foi determinada seguindo os métodos previamente descritos de Xue et al. [49]. Resumidamente, 50 µL de hemolinfa diluída foram colocados em uma lâmina de vidro e incubados a 25 ◦C por 20 min para promover a adesão. Em seguida, 50 µL de levedura (Saccharomyces cerevisiae) com 1 × 106 células/mL foram adicionados à monocamada de hemócitos antes da incubação (25 ◦C por 30 min). A lâmina foi cuidadosamente lavada duas vezes com tampão fosfato salino esterilizado (PBS) e fixada com metanol por 5 min. Em seguida, a lâmina foi corada com solução de Giemsa por 20 min. As células foram contadas sob uma lente de imersão em óleo. A taxa fagocítica indicou atividade fagocítica.

2.9. Parâmetros bioquímicos em CFH

As atividades de enzimas antioxidantes (como SOD, catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPX)), capacidade antioxidante total (T-AOC) e conteúdo de malondialdeído (MDA) e GSH em CFH foram determinados usando o kits de ensaios comerciais (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Catálogo: T-AOC, A015-2-1; SOD, A001-3-2; CAT, A007- 1-1; GSH, A006-2-1; GPX , A005-1-2; MDA, A003-1-2). O T-AOC foi baseado na geração de radicais verdes ABTS (2, 20 -azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)) quando o ABTS foi oxidado. O SOD, GSH e GPX foram medidos por absorbâncias em 450 nm, 405 nm e 421 nm, respectivamente, usando um espectrofotômetro ultravioleta (Ultrospec 2100 pro, Biochrom, Holliston, MA, EUA). O CAT e MDA foram determinados usando os métodos de molibdato de amônio e TBA (ácido tiobarbitúrico) [50,51].

A atividade LZM e o conteúdo de C3 e C4 no CFH foram medidos usando kits de ensaio comerciais (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China. Catálogo: LZM, A050-1-1; C3, E032-1-1; C4 , E033-1-1). O LZM foi medido por transmitância a 530 nm. O C3 e C4 foram determinados a 340 nm.

2.10. Extração de RNA total e PCR quantitativo em tempo real

O RNA total da glândula digestiva e brânquia foi extraído usando um kit de isolamento de RNA total de tecido (Vazyme, Nanjing, China) e reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) seguindo as instruções do fabricante. A concentração e a pureza do RNA total extraído foram determinadas usando um Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado usando um kit de transcrição reversa (PrimeScript® RT reagente Kit with gDNA Eraser, Takara, Japão).

Todos os primers foram projetados usando Primer Premier 6.0 (Tabela Suplementar S1) e sintetizados por Sangon Biotech (Shanghai, China). A reação de amplificação foi realizada em um volume total de 25 µL, contendo 0.5 µL de primers direto e reverso, 12,5 µL de 2 × SYBR Green Realtime Master Mix (Vazyme), 1 µL de cDNA e 10,5 µL de ddH2O esterilizado. As seguintes condições de termociclagem foram usadas para determinar os perfis de expressão de cada gene: 95 ◦C por 30 s; 40 ciclos de 95 ◦C por 10 s e 60 ◦C por 30 s; com incubações subsequentes a 95 ◦C por 15 s, 60 ◦C por 1 min e 95 ◦C por 1 s para detectar a fluorescência. Os níveis de expressão do gene alvo foram normalizados para a combinação dos dois genes de referência mais estáveis ​​(-actina e gapdh), que foram validados usando geNorm e NormFinder [52,53]. As expressões gênicas relativas foram calculadas usando o método 2−∆∆CT [54].

2.11. Western Blot

A proteína total da glândula digestiva e brânquia foi extraída usando o método RIPA (Solarbio) [55] com coquetéis de inibidores de protease e fosfatase (Roche, Basel, Suíça). De acordo com o manual, a proteína nuclear da glândula digestiva e da brânquia foi extraída usando um Kit de extração de proteína nuclear e citoplasmática (Beyotime, Xangai, China). A concentração de proteína foi medida usando o BCA Protein Quantification Kit (Vazyme, Nanjing, China) e todas as amostras de proteína foram diluídas para uma concentração equivalente de 1,5 µg/µL usando um reagente RIPA. Amostras de proteína da glândula digestiva e brânquia foram separadas usando SDS-PAGE e posteriormente transferidas para uma membrana de PVDF 0,45 µm. O PVDF foi bloqueado usando 5 por cento de leite em pó desnatado (Beyotime, Xangai, China) em preparação para TBST em temperatura ambiente por 1 h. A membrana foi lavada três vezes com TBST antes da incubação usando anticorpo primário durante a noite a 4 ◦C a 60 rpm. Em seguida, a membrana incubada foi lavada três vezes com TBST e incubada com anticorpo secundário de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano (Beyotime, Xangai, China) por 1 hora em temperatura ambiente. A membrana PVDF foi visualizada usando um kit de quimioluminescência ECL (Vazyme, Nanjing, China). O GAPDH (1:500, AB-P-R001, Goodhere Biotechnology, Hangzhou, China) e Lamin B (1:500, WL01775, Wanleibio, Shenyang, China) foram usados ​​como proteínas de referência. Os anticorpos alvo primários foram a resposta primária de diferenciação mielóide 88 (MyD88, 1:500, WL02494, Wanleibio, Shenyang, China), c-Jun N-terminal quinase (JNK, 1:500, WL01295, Wanleibio, Shenyang, China), maduro -IL-1 (1:500, WL00891, Wanleibio, Shenyang, China), NF-κB p65 (1:500, WL01980, Wanleibio, Shenyang, China), ECH tipo kelch associando proteína 1 (Keap1, 1 :1000, WL03285, Wanleibio, Shenyang, China) e caspase3 clivada (1:500, WL02117, Wanleibio, Shenyang, China). A quantificação de Western blot foi calculada usando ImageJ (versão 1.53, Wayne Rasband e colaboradores, National Institute of Health, Bethesda, MD, EUA).

2.12. Cálculos e Análise Estatística

O software SPSS 24 (IBM, Armonk, NY, EUA) foi utilizado para análises estatísticas. ANOVA de uma via foi aplicada com o teste de intervalo múltiplo de Tukey para detectar diferenças estatísticas entre esses grupos no nível de significância de 0,05. Todos os dados foram expressos como média ± EP (erro padrão).

O SR, WGR (taxa de ganho de peso) e DISL (incremento diário no comprimento da casca) foram calculados da seguinte forma:

SR ( percent )=(número de abalones sobreviventes/número de abalones iniciais) × 100;

WGR ( porcentagem )=[(peso final (g) − peso inicial (g))/peso inicial (g)] × 100;

DISL (µm/dia)=[comprimento final da casca (mm) − comprimento inicial da casca (mm)]/dias × 1000.

3. Resultados

3.1. Eficiência de Retenção de Ácido Ascórbico na Dieta

O RE de AA dietético em diferentes intervalos imersos em água do mar é mostrado na Figura Suplementar S1. Em geral, a RE de AA na dieta diminuiu com a duração da imersão na água do mar. Durante o experimento de alimentação, a dieta permaneceu na água do mar por aproximadamente 12 horas. Portanto, o ensaio de lixiviação durou 12 horas em água do mar nas mesmas condições de alimentação. Após 3 h de imersão, a RE de AA nas dietas variou de 95,25 por cento a 97,43 por cento. A RE de AA foi mantida em mais de 95% nas 6 h de imersão. Após imersão por 12 h, a RE de AA em AA50, AA100, AA200, AA500, AA1000 e AA5000 foi de 89,78 por cento, 90,88 por cento, 89,38 por cento, 91,03 por cento, 87,44 por cento e 86,78 por cento, respectivamente

3.2. Desempenho de crescimento e distribuição de ácido ascórbico em tecidos

The SR and growth performance of abalone-fed gradient levels of AA supplementation are shown in Table 2. The SR (%), WGR (%), and DISL (µm/day) were not significantly affected by dietary AA levels (p>0.05). O SR variou entre 80,74 por cento e 88,15 por cento, e o WGR e DISL variaram de 29,32 por cento a 31,52 por cento e 17,92 a 20,01 µm/dia, respectivamente.

The AA distribution in tissues, including CFH, muscle, mantle, gill, and digestive gland, is shown in Figure 1. No significant differences in AA content in CFH and mantle of abalone after dietary AA were observed (p>0.05). O conteúdo de AA no CFH e no manto variou de 2,89 µg/mL a 4,52 µg/mL e 81,63 µg/g a 103,08 µg/g, respectivamente. O conteúdo de AA do músculo, brânquias e glândula digestiva aumentou significativamente (p<0.05) and reached their peak at the AA5000 group. The AA content in the muscle, gill, and digestive gland was 64.88–128.20 µg/g, 308.98–382.19 µg/g, and 130.08–206.09 µg/g, respectively.

3.3. Parâmetros imunes de hemolinfa

O THC, RB e PA da hemolinfa são apresentados na Tabela 3. O THC aumentou significativamente com o aumento de AA na dieta, variando de 1,07 × 107–1,65 × 107 células/mL, e atingiu seu pico no grupo AA1000.

O RB no hemócito de abalone aumentou significativamente e atingiu seu nível mais alto no grupo AA10{{10}}{{2{22}}}} (0 .35 OD630/107 células·mL−1 ). À medida que a suplementação dietética de AA aumentou de 189,05 mg/kg para 919,99 mg/kg, o RB aumentou significativamente de 0,20 OD630/107 células·mL−1 para 0,35 OD630/107 células·mL−1 (p < 0,05). O AA dietético pode afetar o PA em hemócitos de abalone (p < 0,05). A PA do abalone no grupo AA1000 e AA5000 foi significativamente maior do que nos grupos AA0, AA50 e AA100 e atingiu seu máximo (48,92%) no grupo AA5000.

Os parâmetros relacionados ao sistema imunológico no CFH do abalone, incluindo conteúdo de LZM, C3 e C4, são apresentados na Tabela 4. A atividade de LZM foi significativamente elevada (p < 0.{{10} }5) e atingiu os níveis mais elevados no grupo AA1000, onde sua atividade foi de 56,25 U/mL. Os dados não revelaram efeitos significativos para o conteúdo de C3 entre todos os tratamentos (p > 0,05); no entanto, o conteúdo de C3 permaneceu aumentando com a suplementação de AA dietético. O conteúdo de C4 não foi significativamente afetado pelos AA dietéticos (p > 0,05).

3.4. Parâmetros Anti-Oxidativos em CFH

As atividades da enzima antioxidante no CFH de abalone contendo SOD, CAT e GPX, bem como a capacidade T-AOC e o conteúdo de MDA e GSH são mostrados na Tabela 5. AA dietético influenciou significativamente as atividades de SOD, CAT, e GPX, e o T-AOC e conteúdos de GSH e MDA. As atividades de SOD, CAT e GPX, e o conteúdo de T-AOC e GSH foram significativamente regulados positivamente (p <0.05), enquanto o conteúdo de MDA foi significativamente regulado negativamente em abalone (p < 0,05 ). Nenhuma diferença significativa nesses parâmetros antioxidantes no CFH de abalone foi observada entre os grupos AA1000 e AA5000.

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