O nível de exercício apropriado atenua a disbiose intestinal e o aumento do ácido valérico para melhorar a neuroplasticidade e a função cognitiva após a cirurgia em ratos - Parte 3

MATERIAIS E MÉTODOS

Os protocolos e procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade da Virgínia (Charlottesville, VA, EUA; número de protocolo: 3114).

A memória é uma das habilidades que muitas vezes precisamos usar em nossas vidas diárias. Pode tornar as pessoas mais inteligentes, mais sensíveis e mais propícias à carreira e aos relacionamentos interpessoais. Portanto, muitas pessoas desejam melhorar a memória. Existe uma relação entre protocolos experimentais e memória. Vamos explorar essa questão a seguir.

Primeiro, os protocolos experimentais podem ajudar as pessoas a melhorar a memória. No experimento, as pessoas precisam seguir certas etapas para concluir a operação experimental. Esta atividade passo a passo pode colocar o cérebro humano em um estado de alta atenção e concentração, promovendo assim o desempenho das funções cerebrais. Ao mesmo tempo, você precisa se lembrar de alguns dados experimentais e etapas experimentais durante o experimento, que também exercitarão a função de memória do cérebro. Praticando repetidamente dessa maneira, sua memória melhorará gradualmente.

Em segundo lugar, a experiência sensorial durante o processo de memória também está intimamente relacionada ao desenho do plano experimental. Em experimentos, os designers geralmente definem certas tarefas específicas durante o experimento, de modo que os participantes precisam repetir a mesma operação várias vezes, como memória e escrita de números, memória e reconhecimento de blocos de cores, etc. habilidades de atenção e memória, tornando mais fácil para as pessoas processar essas informações na memória de longo prazo.

Além disso, em experimentos, o uso de materiais de estímulo representativos (como imagens, sons, cheiros, etc.) também pode produzir bons resultados. Porque esses estímulos podem desencadear os processos de excitação e memória do cérebro, melhorando assim a capacidade de memória das pessoas. Ao mesmo tempo, esses estímulos também podem ser acoplados ao ambiente e às situações da vida, reduzindo assim a ocorrência de dissociação e tornando as informações mais fáceis de lembrar e mais coesas.

Resumindo, o plano experimental desempenha um papel crucial na melhoria da memória humana. Ao realizar experimentos, as pessoas podem exercitar suas habilidades cognitivas, melhorar seus níveis de memória e, ao mesmo tempo, promover a função cerebral. Portanto, devemos continuar a aprender novos métodos experimentais e a participar em mais experiências para melhorar os nossos níveis de memória e fazer maiores contribuições para as nossas carreiras, relacionamentos e saúde. Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e a Cistanche deserticola pode melhorar significativamente a memória, pois a Cistanche deserticola tem efeitos antioxidantes, antiinflamatórios e antienvelhecimento, que podem ajudar a reduzir a oxidação e as reações inflamatórias no cérebro, protegendo assim o saúde do sistema nervoso. Além disso, a Cistanche deserticola também pode promover o crescimento e a reparação das células nervosas, melhorando assim a conectividade e a função das redes neurais. Esses efeitos podem ajudar a melhorar a memória, a capacidade de aprendizagem e a velocidade de pensamento, e também podem prevenir o desenvolvimento de disfunções cognitivas e doenças neurodegenerativas.

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Todos os experimentos com animais foram realizados pelo Guia do Instituto Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (publicações NIH número 80-23) revisado em 2011. As fontes dos principais materiais foram listadas na Tabela de Recursos Chave nos Materiais Suplementares.

Animais e Design Experimental

Camundongos C57BL/6 J machos com oito semanas de idade, pesando 19 a 22 g, foram alojados em uma sala mantida sob condições ambientais constantes (temperatura de 22 a 24 graus, ciclo claro/escuro de 12 horas e 50 ± 10% de umidade) com livre acesso a alimentos. e água.

Todos eles foram autorizados a se aclimatar por uma semana antes dos experimentos. Eles foram distribuídos aleatoriamente nos seguintes grupos no primeiro experimento: (1) grupo controle (não exposto à anestesia e cirurgia), (2) grupo exercício (exercitado a 35-40% da capacidade máxima, mas não exposto à anestesia e cirurgia) , (3) grupo cirurgia (exposição da artéria carótida esquerda por 15 min sob anestesia com isoflurano por 2 h) e (4) a (6) grupos Exe-l+Sur, Exe-m+Sur e Exe-h+Sur: exercitados a 35 –40%, 55–60% e 75–80% da capacidade máxima, respectivamente, e foram submetidos a anestesia e cirurgia.

Os animais foram utilizados para testes de aprendizagem e memória começando 4 dias após a cirurgia (n=20) ou seus cérebros foram coletados para ensaios bioquímicos às 6 horas, 24 horas, 48 ​​horas, 72 horas, 96 horas e 7 dias após a cirurgia (n=9 ou 14), para coloração imunofluorescente às 48h e 19 dias após a cirurgia (n=6) e para coloração de Golgi aos 19 dias após a cirurgia (n=8).

Sangue e fezes de camundongos dos primeiros 4 grupos foram colhidos para medição de SCFAs aos 7 dias após a cirurgia (n=7) e para análises de 16 S aos 3 e 7 dias após a cirurgia (n=8) ou em no final do protocolo de exercícios da 4-semana (n=8) ​​ou no horário correspondente nos primeiros 2 grupos (n=16). Os ratos para coleta de tecido eram diferentes coortes de ratos que foram usados ​​para testes de aprendizagem e memória. No segundo experimento, os ratos foram designados aleatoriamente para (1) o grupo Transcontrol+Sur e (2) o grupo Trans-exe+Sur.

Os ratos do primeiro grupo receberam 500 ul de solução fecal do grupo controle por sonda gástrica e 600 ul por enema uma vez ao dia durante 7 dias consecutivos após o tratamento com antibióticos para eliminar a microbiota intestinal nativa nos receptores. Os ratos do segundo grupo receberam 500 ul de solução fecal de ratos em exercício por gavagem gástrica e 600 ul por enema uma vez ao dia durante 7 dias consecutivos após o tratamento com antibióticos. As fezes dos receptores foram colhidas 14 dias após o transplante fecal para análise do 16 S. Os ratos foram então submetidos à cirurgia.

A aprendizagem e a memória foram avaliadas a partir de 4 dias após a cirurgia (n=15). O cérebro foi colhido para estudos bioquímicos como no primeiro experimento (n=10). No terceiro experimento, os ratos foram designados aleatoriamente para (1) o grupo Transcontrol e (2) o grupo Trans-control + Sur. Os camundongos de ambos os grupos receberam transplante de fezes de camundongos controle. O segundo grupo foi operado 14 dias após o transplante fecal. O hipocampo foi colhido 2 dias após a cirurgia para medir o GDNF (n=10). No quarto experimento, os camundongos foram aleatoriamente designados para (1) o grupo controle (camundongos ingênuos que não foram expostos a nenhuma condição experimental descrita neste estudo), (2) o grupo antibiótico que recebeu antibióticos por 7 dias, e (3) grupo Trans-controle que recebeu transplante de fezes de camundongos controle.

O aprendizado e a memória foram avaliados 19 dias após a conclusão do transplante fecal (26 dias após a conclusão do tratamento antibiótico no grupo antibiótico) (n=12). No quinto experimento, os ratos foram designados aleatoriamente para (1) o grupo controle, (2) o grupo Trans-controle que recebeu transplante de fezes de camundongos controle, e (3) o grupo Trans-cirurgia que recebeu transplante de fezes de camundongos cirúrgicos. 

O transplante fecal foi realizado conforme descrito no segundo experimento. As fezes dos receptores foram colhidas 14 dias após o transplante fecal para análise de 16 S (n=10). O aprendizado e a memória foram avaliados 4 dias após a coleta da amostra fecal (n=17). No sexto experimento, os ratos foram aleatoriamente designados para (1) grupo de cirurgia mais solução salina normal que recebeu 200 µl de solução salina normal (NS) por injeção intraperitoneal uma vez. uma semana durante 4 semanas e depois cirurgia, (2) exercício mais solução salina normal mais cirurgia grupo que recebeu 200 µl de NS por injeção intraperitoneal uma vez por semana durante a 4-semana exercício com 35–40% da capacidade máxima e depois cirurgia, (3) ) grupo de exercício mais ácido valérico mais cirurgia que recebeu ácido valérico (200 mg/kg em 200 µl) por injeção intraperitoneal uma vez por semana durante a 4-semana, exercício com 35–40% da capacidade máxima e depois cirurgia.

A injeção foi aplicada na manhã do primeiro dia de exercício da semana. Uma injeção adicional foi realizada no dia da cirurgia. Os resultados comportamentais (n=13) e bioquímicos (n=10) foram avaliados como no segundo experimento. No sétimo experimento, macho C57BL/com 13-semanas de idade (pesando 23–27 g) 6 camundongos J foram aleatoriamente designados para (1) grupo controle, (2) grupo NS que recebeu 4 µl de NS por injeções intracerebroventriculares uma vez ao dia por 4 dias consecutivos e (3) grupo ácido valérico que recebeu 4 mg/kg em 4 µl por via intracerebroventricular. injeção uma vez ao dia durante 4 dias consecutivos. Os cerebroventrículos esquerdo e direito foram injetados em horários alternados. O aprendizado e a memória foram avaliados 4 dias após a injeção (n=15).

No oitavo experimento, os camundongos foram aleatoriamente designados para (1) grupo de cirurgia mais dimetilsulfóxido (DMSO) que recebeu DMSO por injeção intracerebroventricular uma vez ao dia por 4 dias consecutivos começando no dia da cirurgia, (2) grupo de cirurgia mais antagonista de C3ar que recebeu antagonista de C3ar (SB290157 ) por injeção intracerebroventricular uma vez ao dia durante 4 dias começando no dia da cirurgia, (3) exercício mais DMSO mais grupo de cirurgia que recebeu DMSO por injeção intracerebroventricular uma vez ao dia durante 4 dias consecutivos começando no dia da cirurgia após a 4-semana de exercício aos 35 –40% da capacidade máxima e (4) grupo de exercício mais agonista C3ar mais cirurgia que recebeu um agonista C3 por injeção intracerebroventricular uma vez ao dia durante 4 dias consecutivos começando no dia da cirurgia após a 4-semana de exercício com 35–40% da capacidade máxima . Os testes comportamentais foram iniciados 4 dias após a cirurgia conforme mencionado acima (n=15).

No nono experimento, os camundongos foram aleatoriamente designados para (1) o grupo controle, (2) o grupo cirúrgico, (3) o grupo cirurgia mais GDNF que recebeu GDNF por injeção intracerebroventricular quando foram submetidos à cirurgia e (4) cirurgia mais GDNF inativado por calor. grupo que recebeu GDNF inativado por calor por injeção intracerebroventricular quando foi submetido à cirurgia. Os hipocampos foram colhidos 48 h após a cirurgia para estudo ELISA (n=12). Após uma semana de aclimatação, camundongos velhos (18-camundongos C57BL/6 J machos com meses de idade) pesando 30-36 g foram usados ​​em três estudos. No primeiro experimento, camundongos velhos foram aleatoriamente designados para (1) o grupo de controle, (2) o grupo de exercício no qual os camundongos fizeram exercícios por 4-semana com 35-40% da capacidade máxima, (3) o grupo de cirurgia e (4) o grupo Exe + Sur no qual os ratos fizeram um exercício de 4- semanas com 35-40% da capacidade máxima antes da cirurgia. Os animais foram utilizados para testes de aprendizagem e memória começando 4 dias após a cirurgia (n=12) ou seus cérebros foram colhidos para ensaios bioquímicos 48 horas após a cirurgia (n=10 ou 12), para coloração imunofluorescente às 48 horas e 19 dias após a cirurgia (n=6), e para coloração de Golgi aos 19 dias após a cirurgia (n=8).

Sangue e fezes de camundongos dos 4 grupos foram colhidos para medição de AGCC aos 7 dias após a cirurgia (n=7) e para análises de 16 S aos 3 e 7 dias após a cirurgia (n=8) ou no final de 4-semana de protocolo de exercícios ou no horário correspondente nos 2 primeiros grupos (n=16). Os ratos para coleta de tecidos eram coortes diferentes que foram usados ​​para testes de aprendizado e memória. No segundo experimento, camundongos velhos foram aleatoriamente designados para (1) o grupo Trans-Old Control+Sur e (2) o grupo Trans-Old Exe+Sur. Esses camundongos foram submetidos à cirurgia 14 dias após o transplante fecal, conforme descrito no segundo experimento com camundongos adultos jovens. Aprendizagem e memória foram avaliadas a partir de 4 dias após a cirurgia (n =10).

No terceiro experimento, camundongos velhos foram aleatoriamente designados para (1) grupo cirurgia mais NS; (2) grupo exercício mais SN mais cirurgia; e (3) exercício mais ácido valérico mais grupo de cirurgia. Esses camundongos receberam condicionamento físico e ácido valérico conforme descrito no sexto experimento com camundongos adultos jovens. Os resultados comportamentais foram testados a partir de 4 dias após a cirurgia (n=11). Os tamanhos amostrais (n) descritos acima representaram o número de animais que foram randomizados em cada grupo/condição. Esses números de animais foram a soma de pelo menos 3 repetições de cada experimento. Os animais foram distribuídos aleatoriamente em grupos com base em tabelas de randomização geradas por computador em cada experimento.

Determinação da capacidade máxima de exercício e treinamento físico

Antes da cirurgia, camundongos com {{0}}semanas e 18-meses de idade foram expostos a exercícios aeróbicos em esteira com 4-semanas após a determinação da capacidade máxima de exercício de camundongos individuais. Esta determinação foi realizada de maneira semelhante às descritas anteriormente [47, 48]. Resumidamente, os camundongos foram aclimatados à esteira no primeiro dia com configurações iniciais de grade de choque em 25 V, 0,3 mA e 2 Hz e velocidade e inclinação em zero por 10 min. A velocidade da esteira foi então aumentada para 10 cm/s com inclinação ajustada para 50 por 10 min. Em seguida, a velocidade e a inclinação da esteira foram aumentadas para 15 cm/areia 100 por 5 min.

The speed was then increased by 5 cm/s every 5 min to an average maximal speed of 70 cm/s in young mice and 60 cm/s in old mice (around 65–75 cm/s and 55–65 cm/s, respectively), as they reached the criteria for exercise-induced exhaustion. These criteria were: (1) 10 consecutive seconds on the electric grid; (2) spending >50% do tempo na rede; e/ou (3) falta de motivação para estímulo manual. O rato foi removido imediatamente da respectiva pista assim que um ou mais destes critérios foram atendidos. No dia seguinte, os ratos correram na mesma esteira a metade da velocidade média máxima (35 cm/s em ratos jovens ou 30 cm/s em ratos velhos) e 100 de inclinação até atingirem novamente um dos critérios de exaustão, e a duração do o exercício contínuo foi registrado como a capacidade máxima de exercício de cada camundongo. Após esses dois protocolos, os ratos foram alojados separadamente por 30 minutos para evitar comportamento agressivo perceptível após o exercício.

After resting for 2 days, mice assigned to exercise training groups were subjected to a 4-week protocol of forced treadmill running at 35–40%, 55–60%, or 75–80% of the maximal capacity, respectively, for 5 days a week. Mice that were shocked for >5% of the total daily exercise time in 2 consecutive days or >3% do tempo total em 3 dias consecutivos seriam excluídos.

Os grupos sem exercício no mesmo conjunto de experimentos que os grupos com exercício foram colocados diariamente em uma esteira imóvel por cerca de 30 a 40 minutos. Eles receberam 10 choques durante um total de 5 segundos, a quantidade média de choques que os ratos de um grupo de exercícios receberam por dia, durante sua permanência em uma esteira imóvel. Se um conjunto de experimentos não tivesse um grupo de exercícios, nenhum camundongo no conjunto de experimentos receberia choques.

Tratamento antibiótico

Para facilitar a colonização da microbiota transplantada, os camundongos receptores receberam tratamento antibiótico uma vez ao dia durante 7 dias consecutivos para eliminar sua microbiota intestinal original, conforme descrito por nós e outros [11, 36]. Em resumo, após purgação com sulfato de magnésio a 10% (200 ul/10 g, duas vezes com intervalos de 3 h) por gavagem gástrica no primeiro dia, camundongos C57BL/6 J receberam amoxicilina/ácido clavulânico (200 mg/kg), metronidazol ( 200 mg/kg) e cefazolina (2 g/kg) por sonda gástrica e enema (em 300 ul para sonda gástrica e 400 ul NS para enema) pela manhã uma vez ao dia durante 7 dias consecutivos, e amoxicilina/ácido clavulânico (20 mg/kg ), metronidazol (20 mg/kg) e cefazolina (300 mg/kg) em 200 ul de NS diariamente por injeção intraperitoneal durante os mesmos 7 dias (das 16h às 17h). Para evitar a contaminação cruzada bacteriana, o manuseio dos camundongos e as trocas diárias de gaiolas e garrafas de água foram realizados por técnicos vestindo um avental limpo e luvas em um capuz ventilado. As fezes desses camundongos foram colhidas 24 horas após o último tratamento para análises de 16 S para determinar o efeito.

Transplante fecal

Pellets fecais frescos coletados dentro de 30 minutos após a evacuação de camundongos controle, camundongos imediatamente após a conclusão do exercício de 4- semana, ou camundongos 2 a 8 dias após a cirurgia foram diluídos com 100 mg/ml de solução salina estéril. –10 doadores com cada condição experimental foram misturados e ressuspensos em solução salina. Resumidamente, a matéria fecal foi misturada em vórtice durante 5 min e depois passada através de um filtro de células de nylon de 70 μm para remover alimentos não digeridos e materiais particulados. Os camundongos receptores receberam 500 ul de solução fecal correspondente por gavagem gástrica pela manhã e 600 ul por enema à tarde a partir de 24 horas após a última dose de antibióticos por 7 dias consecutivos. Os camundongos transplantados foram mantidos por 2 semanas após o transplante fecal antes de serem submetidos à coleta fecal para análises de 16 S e cirurgia.

Anestesia e cirurgia

A cirurgia foi deixada com exposição da artéria carótida conforme descrito anteriormente [6]. Resumidamente, os camundongos foram anestesiados com isoflurano a 2% e mantiveram respirações espontâneas com uma máscara facial fornecida com 100% de oxigênio durante o procedimento. A temperatura retal foi monitorada e mantida em 37 graus com auxílio de manta térmica. Uma incisão na linha média do pescoço de 2- cm e dissecção de tecidos moles com exposição de artéria comum de 1- cm de comprimento foram realizadas sem qualquer dano ao nervo vago após o camundongo ter sido anestesiado com isoflurano por pelo menos 20 min. A ferida foi então irrigada e fechada com sutura cirúrgica 4-0. O procedimento cirúrgico foi realizado em condições estéreis e durou cerca de 15 min em camundongos jovens e 12 min em camundongos velhos. A duração total da anestesia geral foi de 2 horas. Após a cirurgia, todos os animais receberam injeção subcutânea de 3 mg/kg de bupivacaína. Nenhuma resposta ao pinçamento do dedo do pé foi observada durante a anestesia.

Injeções intracerebroventriculares

Conforme descrito acima, alguns grupos de camundongos receberam injeção intracerebroventricular. Resumidamente, estes ratinhos foram colocados numa estrutura de cabeça estereotáxica em posição prona. O local da injeção foi localizado em: 1,00 mm mediolateral, -0,3 mm ântero-posterior de Bregma e -2,5 mm de profundidade dorsoventral. Os ratos no grupo de cirurgia mais GDNF receberam uma injeção intracerebroventricular de 1{{ 20}} ug / kg de GDNF de camundongo recombinante em 3 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS), conforme descrito em estudos anteriores [6, 26], e camundongos em cirurgia mais grupo GDNF inativado por calor receberam uma injeção de desnaturado por calor (5 minat 1000C ) Solução GDNF. Camundongos em cirurgia mais o grupo antagonista de C3ar receberam 10 ug/kg de SB290157 em 3 ul de PBS contendo 5% de DMSO às 0 h, 24 h, 48 h e 72 h após a cirurgia. Os ratos no grupo de exercício mais agonista C3ar e cirurgia receberam 1 ug/kg de agonista C3ar em 3 ul de PBS contendo 5% de DMSO ao mesmo tempo que para SB290157. Os ratos de um grupo de ácido valérico do sexto experimento receberam 4 mg/kg de ácido valérico em 4 µl por 4 dias consecutivos.

Teste comportamental

A aprendizagem e a memória foram avaliadas pelo reconhecimento de novos objetos e pelo teste do labirinto de Barnes. Todos os testes comportamentais foram realizados das 10h{1}} às 17h00em uma sala com isolamento acústico. Os ratos utilizados nos testes de aprendizagem e memória não foram utilizados em nenhum estudo bioquímico para evitar os efeitos desses testes.

Novo teste de reconhecimento de objeto

Como nós e outros descrevemos antes [20, 49, 50], os ratos foram colocados em uma câmara de campo aberto por 5 minutos para habituação, 4 dias após a cirurgia. O teste foi realizado da seguinte maneira. Dois dos mesmos objetos foram colocados em ângulos adjacentes à câmara no dia de aprendizagem. Os ratos foram colocados na câmara com as costas voltadas para os objetos e foram autorizados a explorar a câmara livremente por 5 min. O animal foi eliminado se o tempo total de exploração em dois objetos fosse<5 s. One of the objects was replaced by a novel object 30 seconds or 24 hours later. The mouse was put into the chamber with their backs turned toward the objects and allowed to explore for 5 min. Animal behavior was recorded by ANY-maze behavioral tracking software (Stoelting Co., IL). Exploratory time of new (T2) and old (T1) objects within 5 min was recorded and the memorization ability of the mouse was quantified by discrimination index: DI = T2 / (T1 + T2). The DIs at 30 s and 24 hours after the training reflected the instant and long-term memory, respectively. The field was always provided with even light, and the objects and fields were cleaned with 70% ethanol after each test.

Labirinto de Barnes

Sete dias após a cirurgia, os animais foram submetidos ao labirinto de Barnes para testar seu aprendizado espacial e memória, conforme descrito anteriormente [6, 49]. O labirinto de Barnes é uma plataforma circular com 20 orifícios igualmente espaçados (SDInstruments, San Diego, CA). Um dos buracos estava conectado a uma câmara escura chamada caixa-alvo. O teste começou colocando os animais no meio do labirinto de Barnes. Ruído aversivo (85 dB) e luz brilhante (200W) emitida na plataforma foram usados ​​para encorajar os ratos a encontrar esta caixa. Após treinamento por 4 dias, sua memória de referência foi testada no dia 5 e no dia 12. Nenhum teste foi realizado durante o período. do dia 5 ao dia 12. A latência para entrar na caixa alvo durante cada tentativa foi registrada por um sistema de rastreamento de vídeo ANYMaze (SD Instruments).

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