O nível de exercício apropriado atenua a disbiose intestinal e o aumento do ácido valérico para melhorar a neuroplasticidade e a função cognitiva após a cirurgia em ratos, parte 4

Perfil da microbiota intestinal

Fezes frescas de camundongos foram coletadas para traçar o perfil da microbiota intestinal. Os ratos foram colocados individualmente em gaiola autoclavada para coleta de fezes e defecados livremente. As fezes foram coletadas imediatamente em tubos Eppendorf estéreis em gelo seco e depois armazenadas a -80 graus até processamento posterior. O DNA da bactéria foi extraído com um kit de isolamento de DNA do solo Power Lyzer Power de acordo com nossos protocolos anteriores [11].

Pesquisas recentes mostram que o microbioma intestinal tem um impacto muito importante na nossa memória. Precisamente, as bactérias da microbiota intestinal podem influenciar o sistema nervoso do cérebro humano, alterando assim a sua função de memória. Esta é uma descoberta surpreendente porque significa que podemos melhorar a nossa memória alterando o nosso microbioma intestinal.

Então, como alguém que está tentando melhorar a memória, o que você pode fazer para melhorar o seu microbioma intestinal? A resposta é simples: concentre-se em uma alimentação balanceada. Uma dieta equilibrada não só ajuda a regular o equilíbrio da microbiota intestinal, mas também melhora todos os aspectos do funcionamento do corpo.

Primeiro, precisamos nos concentrar em uma dieta diversificada e rica em fibras alimentares. Uma dieta rica em fibras pode ajudar a manter a diversidade do seu microbioma intestinal, um fator chave na promoção da boa saúde. Ao mesmo tempo, também precisamos de garantir que consumimos proteínas de elevada qualidade e gorduras saudáveis ​​em quantidade suficiente nas nossas refeições. Esses nutrientes podem promover a função da memória e a condução nervosa.

Além disso, o exercício regular e a redução do stress também podem promover o equilíbrio e a diversidade do microbioma intestinal. Quer se trate de respiração profunda, meditação ou prática de ioga, todas essas são formas eficazes de reduzir o estresse. O exercício pode melhorar a contratilidade intestinal, aumentar a vitalidade intestinal e promover a desintoxicação cíclica, ajudando assim a promover o equilíbrio e a diversidade da microbiota intestinal.

Em suma, não devemos concentrar-nos apenas na nossa dieta e saúde física, mas também na nossa microbiota intestinal. Mudar os nossos hábitos alimentares e reduzir o stress pode promover o equilíbrio e a diversidade da nossa microbiota intestinal, o que pode ajudar-nos a melhorar a memória e o funcionamento do sistema nervoso. Então, vamos juntos prestar atenção à nossa saúde intestinal e melhorar nossa memória e condicionamento físico!

Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e a Cistanche deserticola pode melhorar significativamente a memória porque a Cistanche deserticola é um material medicinal tradicional chinês que tem muitos efeitos únicos, um dos quais é melhorar a memória. A eficácia da Cistanche deserticola vem dos muitos ingredientes ativos que contém, incluindo ácido tânico, polissacarídeos, glicosídeos flavonóides, etc.

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Bibliotecas de sequenciamento da região hipervariável V3-V4 foram preparadas de acordo com as instruções do sistema Illumina MiSeq. Resumidamente, 12,5 ng de DNA foram utilizados como modelo de DNA para a primeira PCR de 16 S rRNA. Os iniciadores utilizados foram os seguintes: F: 5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′ e R: 5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′.
Os amplicons foram então limpos com esferas magnéticas AMPure XP e depois usados ​​para Index PCR usando o kit Nextera XTIndex. O kit de ensaio Qubit dsDNA HS e o TapeStation D1000ScreenTape de alta sensibilidade (Agilent, Blacksburg, VA, EUA) foram usados ​​para medir as concentrações de produtos de PCR e normalizar a quantidade para preparação da biblioteca.

O sequenciamento foi operado em um instrumento Illumina MiSeq do kit de reagentes MiSeq v2 (500 ciclos). Os dados foram analisados ​​​​com o fluxo de trabalho Metagenomics v2.5.1.3 do software MiSeqReporter (Illumina, San Diego, CA, EUA). As leituras pareadas obtidas por sequenciamento de terminal duplo foram unidas em uma sequência através do software Pandaseq. As leituras longas com regiões altamente variáveis ​​foram obtidas.

As leituras cuja pontuação phred média na janela (5 pb de tamanho, 1 pb de comprimento de passo) foi menor que 20 foram aparadas. As leituras contendo "N" ambíguo ou com comprimento < 220 pb foram descartadas. sequências de alta qualidade sem quimeras foram organizadas de acordo com a abundância, de grande a pequena, e depois agrupadas com 97% de similaridade em Unidades Taxonômicas Operacionais (OTU). Cada OTU foi considerado como representando uma espécie. Para evitar o desvio de análise causado pelos diferentes tamanhos de dados de sequenciamento de amostras, o número de leituras para OTU foi inserido de acordo com o número de sequência mínimo correspondente à OTU quando a profundidade de sequenciamento era suficiente. A diversidade alfa foi analisada por nivelamento aleatório.

ARead foi extraído de cada OTU como uma sequência representativa. A sequência representativa foi comparada com a base de dados do projeto do banco de dados ribossômico. As espécies foram classificadas para cada OTU e tabelas de abundância de espécies foram obtidas para análise posterior. A seleção de OTU foi realizada usando Uclust na plataforma de software QIIME v1.9.1.

A diversidade alfa, incluindo o índice Chao1 e o índice de cobertura de bens, foi utilizada para a análise da diversidade de espécies em uma amostra. A análise de diversidade beta foi utilizada para comparar diferenças na diversidade de espécies entre amostras e caracterizada pela análise de coordenadas principais (PCoA) com base na distância de Bray-Curtis. As diferenças entre os grupos foram testadas por análise de similaridade (ANOSIM).

Perfil SCFA de plasma

As concentrações plasmáticas de SCFA foram quantificadas usando espectrometria de massa com cromatografia gasosa 7890-5977 (GC-MS, Agilent, Blacksburg, VA, EUA). Amostras de plasma foram coletadas de camundongos nos momentos descritos acima, armazenadas a -8{ {20}} graus rapidamente e depois descongelado à temperatura ambiente para processamento. Resumidamente, uma amostra de plasma de 100 ul foi misturada em vórtex com 900 uletanol (contendo 0,5% de HCl, V/V). O tratamento ultrassônico foi aplicado por 40 min e então as amostras foram centrifugadas a 14,000 RPM por 10 min. O sobrenadante das amostras foi medido por análise de GC-MS em um GC-MS Agilent 7890–5977 com ionização por impacto de elétrons e um Coluna capilar DB-FFAP (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm).

Quantificação de ácido valérico cortical

A quantidade de ácido valérico no córtex cerebral coletada 24 horas após a última injeção intraperitoneal de ácido valérico foi determinada por um método semelhante ao relatado anteriormente [51, 52]. Resumidamente, 0,1 g de córtex cerebral foi lavadohomogeneizado em 500 µl de acetonitrila aquosa. O sobrenadante foi extraído com 8 ml de tampão de extração (hexano: éter dietílico=1:1) e centrifugado a 1800 g por 5 min. Foram coletados 7,5 ml de sobrenadante, misturados com 93 µl de 20 mMKOH em metanol e secos a 40 graus sob nitrogênio gasoso. O resíduo seco foi reconstituído em 50 µl de 18-Crown-6 a 2,5% em acetonitrila e foi posteriormente derivatizado com 9-clorometil antraceno em acetonitrila com a adição de hidróxido de tetrametilamônio.

Finalmente, 30 µl de solução de derivatização foram carregados na coluna Acclaim C18 (3 µm, 4,6 × 100 mm, Thermo Scientific) e separados em cromatografia líquida de alta eficiência Ultimate 3000 (HPLC, Thermo Scientific) equipada com detector UV-visível. O pico do ácido valérico derivatizado foi detectado em um comprimento de onda de 254 nm.2-O ácido etilbutírico (2-EA) foi adicionado como controle de referência interno. A área do pico do ácido valérico foi medida como mAU*min e sua área de pico de cada amostra foi normalizada com a de 2-EA na amostra. Os resultados finais foram apresentados como proporções entre o grupo ácido valérico e o grupo NS.

Colheita de tecido cerebral

Os camundongos foram pesados ​​e anestesiados com isoflurano às 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 7 dias após a cirurgia e perfundidos com NS de 4 graus para coleta de tecido cerebral. Estes hipocampos foram utilizados para análise ELISA ou ensaio de RNA. Todo o cérebro em Bregma −3 a −6 mm foi utilizado para coloração imunofluorescente. Todos os procedimentos de dissecção foram realizados em gelo.

Preparação da biblioteca de mRNA e sequenciamento Illumina Hiseq

The hippocampi harvested at 24 h after surgery from the control group, surgery group, and Exe+Sur group in the first experiment were placed in liquid nitrogen for 1 h and then stored in a −80 °C freezer quickly for no >1 semana. Purificação de RNA, transcrição reversa, construção de biblioteca e sequenciamento foram realizados no WuXi NextCODE em Xangai de acordo com as instruções do fabricante (Illumina).

As bibliotecas de sequenciamento focadas em mRNA do RNA total foram preparadas usando o kit de preparação de amostras de RNA Illumina TruSeq®. O ARNm de PolyA foi purificado a partir de ARN total utilizando esferas magnéticas oligo-dTattached e depois fragmentado por tampão de fragmentação. Tomando estes fragmentos curtos como modelos, a primeira cadeia de ADNc foi sintetizada utilizando transcriptase reversa e iniciadores aleatórios, seguido pela síntese de segunda cadeia de ADNc. Em seguida, o cDNA sintetizado foi submetido a reparo final, fosforilação e adição de base 'A' de acordo com o protocolo de construção de biblioteca da Illumina.

Adaptadores de sequenciamento Illumina foram adicionados aos fragmentos de cDNA. Após a amplificação por PCR para enriquecimento de DNA, os AMPure XPBeads (Beckman) foram usados ​​para limpar os fragmentos alvo de 200–300 pb. Após a construção da biblioteca, o fluorômetro Qubit 3.0 dsDNA HS Assay (Thermo Fisher Scientific) foi usado para quantificar as concentrações das bibliotecas de sequenciamento resultantes, enquanto a distribuição de tamanho foi analisada usando Agilent BioAnalyzer 2100 (Agilent). O sequenciamento foi realizado usando um sistema Illumina seguindo protocolos fornecidos pela Illumina para sequenciamento de extremidade emparelhada 2 × 150 no WuXi NextCODE em Xangai, China.

Expressão de mRNA do hipocampo por reação em cadeia da polimerase quantitativa (Q-PCR)

O hipocampo colhido 24 horas após a cirurgia do grupo controle, grupo exercício, grupo cirurgia, grupo Exe+Sur, grupo Trans-Control+Sur, grupo Trans-Exe+Sur, grupo Exe+Sur+NS e Exe+Sur+ O grupo Val foi colocado em nitrogênio líquido por 1 hora e depois armazenado em freezer a -80 graus por no máximo 3 dias. Extração de RNA, transcrição reversa de RNA para cDNA e q-PCR foram realizadas como descrito anteriormente (49, 53). Resumidamente, o RNA foi extraído pelo kit RNeasy Micro. A transcrição reversa foi finalizada usando 5X All-in-One MasterMix. Finalmente, um sistema CFX connect em tempo real (Bio-Rad) foi utilizado para quantificação quantitativa. Primers para qPCR foram: C3ar1-F:TGGGCTGGTGCTGTGGGTAG e C3ar1-R: GATGGCGAAGGCGGTTCTCAC. A expressão gênica relativa para C3ar1 foi calculada usando o ciclo de limiar comparativo ΔΔCt e o gene housekeeping -actina para normalização da expressão gênica. Os níveis de mRNA para genes alvo são expressos como aumentos de vezes em relação ao grupo relevante, respectivamente.

Determinação de citocinas e GDNF no hipocampo

IL{{0}} , IL-6, C3 e GDNF no hipocampo foram detectados usando kits ELISA. Para testar IL-1, IL,-6 e GDNF, os tecidos cerebrais foram homogeneizados em gelo no tampão RIPA contendo Tris-HCl 25 mM com pH 7,6, 150 mMNaCl, 1% de desoxicolato de sódio, 0,1% SDS e um coquetel inibidor de protease contendo 10 mg/ml de aprotinina, 5 mg/ml de pepstatina, 5 mg/ml de leupeptina e fluoreto de fenilmetano sulfonil 1 mM.

Para o teste C3, os tecidos cerebrais foram homogeneizados em gelo no tampão PTR (fornecido no kit). O sobrenadante foi coletado para detecção por ELISA após o homogeneizado ter sido centrifugado a 13,{2}} g por 20 min a 4 graus e a concentração de proteína foi determinada pelo ensaio de proteína BCA (Bio-Rad, Hemel Hempstead, Herts, UK). IL-1, IL6, C3 e GDNF no sobrenadante do cérebro foram detectados de acordo com as instruções do fabricante para ELISA, e a quantidade deles em cada amostra no cérebro foi normalizada pelo seu conteúdo total de proteína e foi expressa como pg/ mg de proteína.

Western blotting

Western blotting foi realizado conforme descrito anteriormente [49]. Resumidamente, as concentrações proteicas das amostras foram determinadas utilizando o ensaio de proteína BCA. Vinte microgramas de cada amostra foram submetidos à análise de Westernblotting usando os seguintes anticorpos primários: proteína policlonal de coelho anti-densidade pós-sináptica 95 (PSD95) na diluição de 1:1000, anti-sinapsina 1 policlonal de coelho na diluição de 1:1000 e anti-coelho- - anticorpo tubulina na diluição de 1:1000. As imagens foram digitalizadas por um scanner Image Master II (GE Healthcare, Milwaukee, WI, EUA) e analisadas usando o software ImageQuant TL v2003.03 (GE Healthcare). Os sinais de banda das proteínas interessadas foram normalizados para os da tubulina correspondente e expressos como frações da amostra de controle dos mesmos géis.

Coloração imunofluorescente

A marcação imunofluorescente e a quantificação da coloração foram realizadas conforme descrito anteriormente [6, 54]. Resumidamente, o cérebro foi fixado em paraformaldeído a 4% a 4 graus por 24 horas e depois incubado em sacarose a 30% durante a noite a 4 graus antes de ser congelado em composto de temperatura de corte ideal. Seções coronais de 20- µm de espessura foram cortadas sequencialmente de Bregma −3 a −6 mm usando um criostato e montado em lâminas de microscópio.

Após serem lavadas em solução salina tamponada com Tris (TBS), as seções foram bloqueadas em 10% de soro de burro mais 1% de albumina de soro bovino (BSA) em TBS contendo 0,3% de triton-X100 por 2 h em temperatura ambiente e depois incubadas a 4 graus durante a noite com os seguintes anticorpos primários: anticorpo monoclonal de coelho anti-C3 (1:50), anticorpo monoclonal de cabra anti-GFAP (1:200), anticorpo monoclonal de rato anti-C3ar (1:50) e anticorpo monoclonal de coelho anti-Iba{{ 21}} anticorpo (1:200).

As seções foram enxaguadas em TBS com 0,1% de Triton-x 100. O anticorpo IgG anti-coelho de burro conjugado com Alexa Fluor 594 (1:200), anticorpo IgG anti-cabra de burro conjugado com Alexa Fluor 488 (1:200) , anticorpo IgG anti-rato de burro conjugado com AlexaFluor 594 (1:200) ou anticorpo IgG anti-coelho de burro conjugado com AlexaFluor 647 (1:200) foram incubados com as secções durante 1 h à temperatura ambiente no escuro.

As seções foram lavadas em TBS, incubadas com Hoechst 33342(1:1000) para coloração nuclear, enxaguadas e montadas com meio de montagem Vectashield (H-1000; Vector Labs, Burlingame, CA). Imagens de imunocoloração foram adquiridas por z-stack com sistema de microscopia LSM710 (ZEISS), e um controle negativo omitindo a incubação com o anticorpo primário foi incluído em todos os experimentos.

A quantificação foi realizada conforme descrito anteriormente [6, 54]. Resumidamente, toda a região do giro denteado (DG) que foi coberta por 2 a 3 campos não sobrepostos de cada uma das seis seções sequenciais do hipocampo de um camundongo foi fotografada. O número de pixels por imagem com intensidade acima de um nível limite predeterminado foi considerado como uma área corada positivamente para um marcador interessado e quantificado usando o Image-pro plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, EUA) e apresentado como um percentual de área positiva na área total. Foi então calculada a média de seis medições por rato para reflectir o nível de coloração positiva. Todas as análises quantitativas foram realizadas de forma cega.

Administração de BrdU e coloração imunofluorescente

Sete dias após a cirurgia, os camundongos receberam 7 injeções intraperitoneais consecutivas de 80 mg/kg de 5′-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) ao meio-dia, uma vez ao dia, conforme descrito anteriormente [14]. Os ratos foram sacrificados 5 dias depois para colher o hipocampo. O hipocampo foi fixado em paraformaldeído a 4% 0. Solução salina tamponada com fosfato 1 M a 4 graus por 24 horas e embebido em parafina. Seções cerebrais coronais de cinco mícrons de espessura foram cortadas sequencialmente de Bregma -2 a -4 mm. A recuperação antigênica foi realizada incubando seções com tampão citrato de sódio contendo citrato de sódio 10 mM, Tween 20 0,05% (pH 6,0) a 95–100 graus por 20 min.

A desnaturação do DNA foi feita incubando com HCl 1 N em gelo por 3 min, HCl 2 N em temperatura ambiente por 3 min e a 37 graus por 6 min. As secções foram bloqueadas com soro de burro a 5% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,5% de triton-X 100 durante 2 h à temperatura ambiente. As secções foram então incubadas durante a noite a 4 graus com os seguintes anticorpos primários: anticorpo monoclonal de rato anti-BrdU (1:100) e anticorpo monoclonal de cabra anti-GFAP (1:200). As seções foram incubadas com anticorpo IgG anti-rato de burro conjugado com Alexa Fluor 594 (1: 200) ou anticorpo IgG anti-cabra de burro conjugado com Alexa Fluor 488 (1: 200) por 1 h à temperatura ambiente em uma sala escura. Após serem lavadas em PBS, as seções foram contrastadas com Hoechst 33342 (1:1000), enxaguadas e montadas com meio de montagem Vectashield (Vector Labs).

As imagens foram adquiridas com microscópio de fluorescência com câmera de dispositivo de carga acoplada (High MagOlympus BX51) e sistema de microscopia confocal LSM710 (ZEISS). Um controle negativo omitindo a incubação com o anticorpo primário foi incluído em todos os experimentos. Para cada cérebro de camundongo, seis seções sequenciais do hipocampo foram utilizadas para contagem de células. Foi contado o número de todas as células coradas positivamente para um marcador de interesse ou a combinação de dois marcadores na zona subgranular do DG de cada seção. As análises quantitativas foram realizadas de maneira cega.

Mancha de Golgi

A coloração de Golgi foi realizada utilizando o kit FD Rapid GolgiStainTM. Dezenove dias após a cirurgia, os cérebros de 6 camundongos de cada grupo foram imersos na solução impregnante (soluções A e B: 1:1) por 2 semanas e depois transferidos para a solução C por 3 dias. Seções cerebrais coronais com espessura de 100 μm e cerca de -2,7 mm do bregma foram cortadas em um vibratome (Microslicer® 10110, Ted Pella, Inc. Califórnia, EUA).

Conforme descrito anteriormente [55, 56], mais de 1 0 neurônios bem individualizados na região DG do hipocampo foram selecionados aleatoriamente de cada camundongo, e imagens de varredura óptica sequencial de múltiplas camadas foram obtidas em um intervalo de 2,0 μma ao longo do eixo z (3DHISTECH, Pannoramic MIDI, Hungria) com 20×objetiva. Os arquivos de digitalização de múltiplas camadas foram sobrepostos para se tornarem um arquivo de digitalização claro que pode ser visualizado com o Caseviewer (3DHISTECH, Hungria) em um computador. O número total de ramos e o comprimento dendrítico foram medidos pelo software Fiji (Fiji-win64, NIH, EUA). A complexidade das árvores dendríticas totais (interseções) foi estimada pela análise de Sholl. Para medição da densidade da coluna, foram selecionados 5 neurônios de cada animal.

Cinco campos microscópicos selecionados aleatoriamente nos dendritos apicais ou basais foram fotografados a partir dos arquivos de digitalização. Os números das lombadas em segmentos de 40 μm foram contados por um observador cego para a atribuição de grupos. Os resultados foram expressos como o número de espinhos/segmentos de 10 μm. Os dados dos números dos ramos dendríticos, comprimento e interseções, bem como a densidade da coluna vertebral de um camundongo, foram calculados para refletir o nível do camundongo.

Análise estatística

O cálculo do tamanho da amostra para cada experimento não foi realizado. A determinação do tamanho da amostra baseou-se principalmente em nossa experiência: amostras maiores foram usadas para experimentos que testam aprendizagem e memória do que aquelas para estudos bioquímicos. Todos os dados coletados foram incluídos nas análises. Os dados faltantes incluíram os animais que preencheram critérios de exclusão pré-determinados para treinamento físico e animais que morreram antes do período de observação pretendido. O número de animais que contribuíram com dados para análise para cada condição experimental é indicado nas legendas das figuras.

Os resultados são apresentados como médias ± DP (dados de distribuição normal) ou mediana ± intervalo interquartil (dados não de distribuição normal) com a apresentação de dados individuais dos animais no gráfico de barras e médias ± DP nos gráficos de linha. Os dados das sessões de treinamento do BarnesMaze foram analisados ​​por análise de variância repetida bidirecional (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey.

Os dados da microbiota intestinal foram analisados ​​conforme descrito na seção Perfil da microbiota intestinal. Os demais dados foram analisados ​​por ANOVA unidirecional seguida pelo teste de Tukey se os dados estivessem normalmente distribuídos, por ANOVA unidirecional por classificação seguida pelo teste de Tukey ou Método Student-Newman-Keuls se os dados não estivessem normalmente distribuídos, por ANOVA bidirecional , por teste t ou teste de soma de classificação. Uma diferença significativa foi definida como P < 0 0,05 com base em testes de hipóteses bicaudais.

Não foram realizados ajustes para comparações múltiplas. Todas as análises estatísticas foram realizadas com SigmaStat (Systat Software, Inc., Point Richmond, CA, EUA).

REFERÊNCIAS

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2. Monk TG, Weldon BC, Garvan CW, Dede DE, van der Aa MT, Heilman KM, et al.Preditores de disfunção cognitiva após cirurgia não cardíaca de grande porte. Anestesiologia. 2008;108:18–30.

3. Newman MF, Kirchner JL, Phillips-Bute B, Gaver V, Grocott H, Jones RH, et al. Avaliação longitudinal da função neurocognitiva após cirurgia de revascularização do miocárdio. N. Engl J Med. 2001;344:395–402.

4. Hall M, Schwartzman A, Zhang J, Liu X. Dados de cirurgia ambulatorial de hospitais e centros de cirurgia ambulatorial: 2010. Relatório Nacional de Estatísticas de Saúde 2017.

5. Li Y, Chen D, Wang H, Wang Z, Song F, Li H, et al. Efeitos anestésicos intravenosos versus voláteis na cognição pós-operatória em pacientes idosos submetidos à cirurgia abdominal laparoscópica. Anestesiologia. 2021;134:381–94.

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