Efeitos antialérgicos e antiinflamatórios da neferina em células RBL-2H3 Plus

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3. Discussão

A patogênese da dermatite atópica (DA) não é totalmente compreendida, mas a doença é mediada por uma resposta imune anormal da imunoglobulina E (IgE) na disfunção da barreira cutânea. Entre eles, os mastócitos (MC) podem causar doenças alérgicas mediadas por IgE, incluindo a DA. Quando os mastócitos são ativados, eles liberam suas partículas citoplasmáticas ligadas à membrana, levando à liberação de uma variedade de moléculas. Essas moléculas desempenham um papel importante na patogênese da DA e na defesa do hospedeiro [27]. Como a inibição da ativação ou degranulação dos mastócitos ajuda a regular várias reações de hipersensibilidade mediadas por IgE, os mastócitos são um dos alvos ideais para explorar drogas antialérgicas. Em nosso estudo, os mastócitos são degranulados em resposta ao composto 48/80 e ao ionóforo de cálcio A23187, e anti-DNP/IgE mais DNP/HSA. Descobrimos que a referência inibiu efetivamente o efeito de desgranulação dos mastócitos, mostrando sua reação antialérgica. Além disso, o aumento do cálcio intracelular e a ativação da MAPK foram inibidos por referência. Além disso, a infiltração de mastócitos na pele causada pelo DNCB e o comportamento de coçar causado pelo composto 48/80 também foram reduzidos. Portanto, o mecanismo da dermatite antiatópica da neferina tem um efeito multiplicador nos queratinócitos e mastócitos.

A patogenia da dermatite atópica (DA) não é compreendida por completo, mas a doença está mediada por uma resposta inmunitária normal da imunoglobulina E (IgE) na disfunção da barreira cutânea. Entre ellos, los mastocitos (MC) pode causar enfermedades alérgicas mediadas por IgE, incluida la EA. Quando os mastocitos são ativados, liberam partículas sus partículas unitárias, lo que lleva a la liberação de uma variada variação de ativação da membrana. Estas declarações juegan un papel importante en la patogénesis de EA y la defensa del hués [27]. Deve-se a inibição da ativação ou desgranulação dos mastócitos ajudar a regular as variações de reações de hipersensibilidade mediadas por IgE, os mastócitos são um dos objetivos ideais para explorar fármacos antialérgicos. Em nosso estúdio, os mastócitos se desgranularam em resposta ao computador 48/80 e ao ionóforo de cálcio A23187, e anti-DNP/IgE plus DNP/HSA. Encontramos a referência inibida efetivamente pelo efeito de desgranulação dos mastócitos, sua reação antialérgica. Além disso, o aumento do cálcio intracelular e a ativação do poder de MAPK são inibidos por referência. Além disso, também reduz a infiltração de mascitos na torta 8 para DNCB e comportamento de rasgo causador pelo compuesto 48/0. Por isso, o mecanismo da dermatite antiatópica da neferina tem um efeito multiplicador sobre os queratinocitos e os mastocitos.

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O citoplasma dos mastócitos encontrados nos tecidos é preenchido com partículas grandes e densas de mediadores inflamatórios pré-formados[28]. O processo de liberação desses mediadores dos grânulos de secreção nos mastócitos é chamado de degranulação. Uma vez que a inibição da degranulação de mastócitos pode regular várias reações de hipersensibilidade mediadas por IgE, os mastócitos são um dos alvos ideais para explorar drogas anti-alérgicas [29,30]. Nossos resultados mostram que a referência tem um efeito muito bom na degranulação de mastócitos, independentemente do uso de antígeno, estimulador de receptor ou ionóforo. Isso mostra que a referência é um potencial agente antialérgico (Figura 2).

Todos os grânulos pré-armazenados, mediadores recém-sintetizados e até grânulos e seus componentes podem ser usados ​​como indicadores de ativação de MC [31]. Além disso, o método padrão é a medição da concentração de Ca4t intracelular. A maioria dos secretagogos de MC (por exemplo, antígeno, composto 48/80) que têm sido geralmente usados ​​em laboratório causou um aumento na concentração intracelular de Ca2+. De fato, o aumento da concentração intracelular de Ca2+ também pode desencadear a degranulação de MC. Normalmente, o aumento do Ca4t intracelular é induzido pela ativação de MC com compostos, como tapsigargina (bloquear especificamente Sarco/Ca2 endoplasmático mais ATPase, SERCA) bombas e ionóforos (ou seja, ionomicina e A23187) [32,33]. Portanto, na ativação de MC dependente de Ca2t, a medição do influxo de Ca2t também é considerada um método para determinar as condições de ativação de MC. Na pesquisa de MC, Fura-2 é amplamente utilizado para a determinação de alterações intracelulares de Ca2 mais. Em nossos experimentos, descobrimos que a intensidade de fluorescência dos mastócitos ativados foi significativamente suprimida após ser tratada com referência (Figura 3). Relatórios anteriores indicaram que o aumento na concentração de Ca4t intracelular estava de acordo com a liberação de histamina [34]. Portanto, inferimos que a liberação de histamina também será inibida pelo tratamento de referência. Mais experimentos são necessários para verificar esta hipótese.

Os mastócitos têm saídas funcionais significativamente diferentes.dosagem de cistache redditEstes incluem degranulação, formação de precursores de ácido araquidônico, quimiotaxia e produção de citocinas, e são todos dependentes dos sinais de cálcio até certo ponto, independentemente dos estimulantes [32] O MC ativado libera citocinas, que são os principais mediadores de alergias e doenças inflamatórias [32] 35]. A produção de citocinas por mastócitos ativados é o resultado da indução da transcrição do gene da citocina nessas células. A estimulação de mastócitos leva à ativação de NF-kB e AP-1 e à produção de muitas citocinas [36].As vias de sinalização da cascata MAPK desempenham um papel essencial na regulação da expressão de citocinas. A ativação dessas vias através da ativação de PKCs por PI resulta na ativação de vários genes, incluindo genes de citocinas inflamatórias como IL-1 , IL-6 e TNF [37]. Nossos estudos recentes mostraram que a referência pode inibir as citocinas liberadas pela ativação de queratinócitos. Ao mesmo tempo, também descobrimos que a ativação da via de MAPK também será inibida pelo tratamento de referência [18]. Em nosso estudo atual, mostramos que a referência também pode reduzir a expressão de citocinas através da inibição da ativação de MAPK em mastócitos (Figuras 4 e 5). A ativação de NFkB também é reduzida devido à inibição da ativação de MAPK (Figura 6).

Cistanche pode anti-envelhecimento

Vários estudos relataram que uma variedade de citocinas em pacientes com DA está elevada, levando à disfunção da barreira cutânea, incluindo citocinas secretadas por queratinócitos e citocinas derivadas de Th2-[38,39]. Além disso, é relatado que essas citocinas secretadas também podem regular negativamente as expressões de proteínas de junção apertada (T]) e genes de diferenciação terminal, incluindo filagrina (FLG), loricrina (LOR) e involucrina (IVL) [39,40 ]A expressão de (pro)filagrina está diminuída na DA e está inversamente associada com MC triptase e IL-6[41]. IL-1 medeia a inflamação crônica em camundongos com barreira da pele prejudicada [35]. Em um estudo anterior, foi relatado que as expressões de FLG, IVL e LOR foram reguladas negativamente após a aplicação de DNCB na pele dorsal de camundongos NC/Nga[42,43]. No presente estudo, as expressões de FLG, IVL e LOR foram consideravelmente reduzidas na pele dorsal do grupo controle, o que indicou que a barreira epidérmica estava prejudicada. A administração de referência recuperou significativamente as expressões diminuídas de FLG, IVL e LOR após o tratamento de DNCB, enquanto a administração de referência aumentou ligeiramente as expressões de IVL e LOR em comparação com o grupo controle (Figura 8). Sabe-se que o composto 48/80 é um eficaz ativador dos mastócitos da pele. A resposta da pele estimulada pelo composto 48/80 pode induzir o comportamento de coçar ao liberar histamina dos mastócitos [44]. A histamina liberada pelos mastócitos ativados desempenha um papel importante no aumento da permeabilidade vascular causada pelo composto 48/80. Durante o prurido humano, a histamina liberada pelos mastócitos por meio de vários estímulos também é considerada. ser um importante mediador. Portanto, inibir a degranulação dos mastócitos é um passo importante na regulação da liberação de histamina durante o comportamento de coçar. Neste composto de estudo, 48/80 causou ativação efetiva dos mastócitos da pele. No entanto, o pré-tratamento com referência reduziu significativamente o nível de degranulação dos mastócitos (Figura 2).benefícios do extrato de cistacheEsses resultados indicam que o efeito comportamental anti-riscos de referência pode ser devido à redução da permeabilidade vascular pela regulação da degranulação de mastócitos (Figura 9).

É geralmente estabelecido que os pacientes com DA sofrem de disfunção da barreira cutânea, inflamação da pele ou ambos, por isso é difícil encontrar métodos de tratamento apropriados. Portanto, a terapia combinada é geralmente recomendada. Nossa pesquisa recente provou que nunca tem função imunomoduladora e capacidade de reparo de barreira. Portanto, uma importante característica de referência no tratamento da DA no futuro é a manutenção da função da pele e melhora da hidratação da pele e reparo da barreira. A referência também pode reduzir o comportamento de coçar induzido por alérgenos e irritantes. Além disso, a marcha atópica é uma doença relacionada ao fenômeno que ocorre e progride passo a passo. A dermatite atópica é frequentemente observada na infância. A alergia alimentar geralmente ocorre após 1-2anos de idade. A rinite alérgica geralmente pode começar antes e depois da escola. Os sintomas da asma aparecem em momentos diferentes, mas a maioria ocorre após a rinite alérgica. Após a infância, a dermatite atópica e certas alergias alimentares podem melhorar ou desaparecer. A rinite alérgica e a asma não são fáceis de curar[45,46]. Portanto, são fenômenos comórbidos em doenças. Produtos naturais incluindo referências têm potencial terapêutico de comorbidade, e sua eficácia em doenças relacionadas vale a pena estudar no futuro.

4. Materiais e Métodos

4.1. Células de Leucemia Basofílica de Rato

As células de leucemia basofílica de rato (RBL-2H3) foram um presente de TLHwang, Chang Gung University, Taoyuan, Taiwan. As células RBL-2H3 são mastócitos da mucosa que são usados ​​para estudar a degranulação induzida por antígeno ou ionóforo de cálcio, Ca4t intracelular e transdução de sinal [29]. As células foram cultivadas em EMEM contendo 10 por cento de FBS, com penicilina e estreptomicina a 37 graus, 5 por cento de CO2. O meio de Dulbecco modificado de Iscove (IM) e o soro fetal bovino (FBS) foram adquiridos da Thermo Fisher Scientific (GIBCOTM, Nova York, NY, EUA).

4.2. Ensaio MTT

O ensaio 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2brometo de H-tetrazólio (MTT) é usado para medir a atividade metabólica das células. As células RBL-2H3 foram semeadas em uma 24-placa de cultura de poço a 5 × 10 mais/poço. Após 24 h de tratamento medicamentoso, 30 μL de MTI por poço foram adicionados e colocados em uma incubadora de células de 37 graus por 2-4 h, então os cristais de formazan roxo foram dissolvidos com DMSO. Um leitor de ELISA foi usado para medir a intensidade de absorbância em um comprimento de onda de 550 nm como um teste de viabilidade celular.

4.3. Medição do nível de Ca2 mais intracelular

[Ca2t] I foi medido com fura-2 conforme descrito anteriormente[47].RBL-2células H3 foram ressuspensas em IMDM contendo 5 uM Fura 2-AM e 1,2 mM CaClz a 37 graus para 30 minutos. Após o carregamento de Fura{11}}, os queratinócitos foram peletizados e ressuspensos em DMEM fresco. Uma alíquota (2 mL) foi transferida para uma cuvete agitada contendo 1,2 mM de CaClz.Fura-2-A fluorescência de Ca foi testada nos comprimentos de onda de excitação de 340 e 380 nm (comprimento de onda de emissão, 505 nm) em um PerkinElmer LS{{19 }} espectrofluorímetro (PerkinElmer Life and Analytical Sciences). Os dados foram registrados em intervalos de 5s[47].

4.4. Reação em Cadeia de Polímero Quantitativo (qPCR)

As células RBL{{0}}H3 foram plantadas em um prato de cultura de 3,5 cm. Depois que as células cresceram até 90 por cento cheias, as células foram cultivadas em um estado estático por 24 h. Após o pré-tratamento das células com referência por 20 min, elas foram estimuladas com TNF-a/IFN-y por 1 ou 24h, respectivamente. As células foram raspadas, centrifugadas (16,000×g,10 min,4 graus) e o sobrenadante foi extraído. O RNA foi purificado usando um kit de isolamento de RNA total (GeneDirex@, Vegas, NV, EUA). De acordo com o procedimento operacional do script cDNA Synthesis Kit (BIO-RAD), os reagentes foram adicionados em ordem e operados de acordo com as condições indicadas para converter RNA em cDNA. Além disso, foi utilizado PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (Applied BiosystemsTM). Um total de 7,5 uL de ddH20,2 uL de cDNA, 0,25 μL de primers direto e reverso e 10 uL de SYBR GREEN foram adicionados e misturados uniformemente. As sequências dos primers são mostradas nas Tabelas 1 e 2. Em seguida, o RNA foi quantificado usando o ABI StepOnePlusTM Real-time PCR System.

4.5. Ensaio de Western Blot

Western blotting é usado para analisar as alterações de várias proteínas nas células. As células RBL{{0}}H3 foram semeadas em um prato de cultura de 3,5 cm. Depois que as células cresceram até 90 por cento cheias e foram submetidas à fome por 24 h, elas foram pré-tratadas com referência por 20 min e, em seguida, estimuladas com TNF-a ou IFN-y por 30 min ou 1 h, respectivamente. Após a raspagem, foram pulverizados por ultrassom e centrifugados (13.200 rpm,10 min,4 graus). Após centrifugação, o sobrenadante foi retirado e a proteína foi quantificada com um kit de ensaio de proteína Pierce (Pierce, Rockford, IL, EUA). Foi submetido a eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida a 10 por cento e depois eletroporado com membrana de PVDF. Após a conclusão da transferência, a membrana de PVDF foi colocada em solução de TBS-T (solução salina tamponada com Tris/0,05 por cento tween 20) contendo 5 por cento de leite em pó desnatado e agitada por 1 h para evitar ligação não específica. Então, TBS-T foi usado para lavar 3 vezes, 10 min cada vez. Em seguida, os anticorpos primários (diluição 1:1000) foram adicionados e colocados a 4 graus durante a noite e foram então lavados 3 vezes com TBS-T a cada 10 min. Após a adição de anticorpos secundários (diluídos 1:1000) por 1 h, a membrana de PVDF foi lavada 3 vezes com TBS-T por 10 min de cada vez. Finalmente, o revelador foi adicionado e a membrana foi colocada em um sistema de extração de luminescência química (BIOSTEP Celvin") para disparo.

4.6.Dinitroclorobenzeno(2,4-Dinitrocloroben2eno, DNCB)Inflamação da pele semelhante à dermatite atópica induzida em camundongos

Primeiramente, os camundongos foram divididos em quatro grupos: grupo controle, grupo DNCB (grupo negativo), referência (3 mg/kg e 10 mg/kg) com grupo DNCB e dexametasona (0,2 mg/kg) com Grupo DNCB (grupo positivo). A dexametasona é um hormônio corticosteróide que pode reduzir o inchaço e as reações alérgicas. Neste experimento in vivo, tanto a referência quanto a dexametasona foram dissolvidas em DMSO, enquanto o DNCB foi dissolvido em 75% de etanol por choque ultrassônico. O primeiro foi administrado por injeção intraperitoneal e, para o segundo, 100 µL foram aplicados na pele do dorso e 20 µL na orelha direita. Três dias antes do experimento, os camundongos foram anestesiados e os pelos das costas foram removidos, e um pequeno ímã de medição (SCT-MAG-TF) foi embutido na parte de trás das patas traseiras do camundongo.cistanche genghis khanApós três dias de repouso, foi confirmado que os camundongos estavam em boas condições físicas e que a pele na área de depilação dorsal estava normal, e o experimento foi iniciado. Durante o experimento, foram tiradas fotografias para registrar as mudanças na aparência da pele. O primeiro estágio ({{0}} dias) foi o período de dermatite atópica alérgica. Depois de medir os valores básicos de camundongos no grupo DNCB, a referência (3 e 10 mg/kg) e grupo experimental DNCB, e o grupo experimental dexametasona 0,2mg/kg e DNCB, 1 por cento de DNCB foi aplicado uniformemente na pele do dorso e orelha direita. No quinto dia, os medicamentos de referência e a dexametasona foram injetados por via intraperitoneal. A segunda etapa (dia 5 ao dia 14) foi a reindução da dermatite atópica.extensão de vida de cistacheNos 3 grupos experimentais, 0,5 por cento de DNCB foi espalhado uniformemente na pele do dorso e na orelha direita dos camundongos. No dia seguinte, os valores fisiológicos da pele e as fotos foram tiradas e registradas. Após a eutanásia dos camundongos com excesso de dióxido de carbono (CO2) no 15º dia, o tecido da pele dorsal foi removido para posterior análise experimental.

4.7.Composto 48/80-Comportamento de arranhões induzido em camundongos BALB/c

O cabelo da pele na parte de trás do camundongo foi cortado e 20 μL de solução de composto 48/80 por via intracutânea foi injetado. Os camundongos de controle receberam injeções de solução salina. Imediatamente após a injeção, o animal foi colocado em uma gaiola de observação (diâmetro 11 cm, MicroAct, Neuroscience, Tóquio, Japão), e o comportamento de coçar do camundongo foi detectado e avaliado de forma automática e objetiva. O comportamento de arranhões foi medido por 60 min. O MicroAct usa os seguintes parâmetros de análise para detectar ondas correspondentes ao comportamento de coçar contínuo dos camundongos: threshold,0,05 V; intervalo do evento, 0,05 s; duração mínima, 0,25 s; frequência máxima, 30 Hz; frequência mínima, 5Hz. 4.8. Análise Estatística

O software Sigma-Plot (Versão 10.0) foi usado para a análise estatística.cistache nzOs dados são expressos como média ± SEM, com (*) e(#) como notas. A significância estatística dos dados foi analisada por valores t-test.p de Student não pareados e bicaudais menores que 0.05 e 0,01 foram considerados significativos.

5. Conclusões

Neste estudo, determinamos que a referência inibe efetivamente a degranulação de mastócitos e reduz a expressão de citocinas pró-inflamatórias, que podem reduzir os sintomas semelhantes à dermatite atópica, restaurar a barreira da pele e reduzir a coceira na pele. Comprovamos ainda que a referência pode não apenas atuar nos queratinócitos da pele, mas também afetar a ativação dos mastócitos. Tem mais potencial para aplicação em doenças alérgicas e inflamatórias da pele.

Este artigo é extraído de Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 10994. https://doi.org/10.3390/ijms222010994 https://www.mdpi.com/journal/ijms