Efeitos anti-envelhecimento de Leontopodium Alpinum (Edelweiss) Extrato da cultura de Calo através de transcritor perfil da parte 2
May 06, 2022
Por favor, cliqueoscar.xiao@wecistanche.compara mais informações
2.9. Medição da Elasticidade da Pele
A elasticidade da pele foi analisada utilizando um Cutometer MPA 580 (Courage & Khazaka, Köln, Alemanha). Uma sonda com diâmetro de 2 mm foi montada neste equipamento para o teste. O modo 1 ou o modo de tensão de tempo foi utilizado como condição de medição. 2.0s e off-time 2.0s foram então aplicados à pressão negativa especificada da condição do modo 1 (450 bar), e as medidas foram tomadas três vezes consecutivas. Foram medidos três valores diferentes de parâmetros, R2 (elasticidade bruta), R5 (elasticidade líquida) e R7 (elasticidade biológica).
2.10. Medição da Densidade Dérmica e Espessura da Pele
A densidade dérmica e a espessura da pele na bochecha foram analisadas utilizando-se dermascan-C (Tecnologia Cortex, Hadsund, Dinamarca), uma máquina de imagem de alta resolução usando ondas supersônicas de 20 MHz, o que é muito útil na observação não invasiva das alterações nas camadas internas da pele. Em nosso estudo, a imagem de digitalização B foi usada.cistanche nzPrimeiro, definimos a velocidade das ondas supersônicas para 20 MHz, espalhamos a geleia de contato para o teste, colocamos a sonda em um ângulo reto para a pele, e pressionamos-na ligeiramente para medir a área da bochecha. A espessura da pele e a densidade dérmica foram calculadas pelo sistema de software Dermascan-C.
Cistanche poderia anti-envelhecimento
As imagens do rosto foram fotografadas com condições de fotografia idênticas, como a mesma luz, câmera digital de alta resolução e fotógrafo. Depois disso, o levantamento facial no canto da boca foi examinado usando a análise do Moire com base nas imagens do rosto. Selecionamos o canto da boca, onde a flacidez da pele é proeminente, como a área de teste. Utilizando as imagens, o ângulo (R) entre a linha horizontal e a linha de contorno desenhada no canto da boca foi calculado usando software de análise de imagem (ImagePro Plus, Rockville, MD, USA).
2.11.Teste estatístico
Realizamos um teste ANOVA unidirecional para comparação entre o controle e as amostras de teste. Os resultados foram apresentados com média e desvio padrão (Média ± SEM). Os p-valores p<0.05 (*),=""><0.01(*), and=""><0.001 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" statistical="" tests="" were="" declared="" statistically="" significant="" at="" the="" 0.05="" level.="" we="" used="" ibm="" spss="" statistics="" version="" 21.0="" (spss,="" chicago,="" il,="" usa)="" for="" the="" statistical="">
2.12. Preparação de Bibliotecas para RNA-Seq e Sequenciamento de Próxima Geração
Para análise de transcriptome, as células HaCaT a uma densidade de 1×10°células por poço foram incubadas em uma placa de seis poços por 24 h. Depois disso, as células queratinócitos humanas (tratamento) foram tratadas com uma concentração final de 1% de extrato lacce por 24h, enquanto a condição simulada (controle) foi tratada com água estéril. Para cada condição, foram colhidas três amostras biológicas diferentes. O RNA total foi extraído usando um Mini Kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Após a extração do total de RNAs de cada amostra, seis bibliotecas diferentes para RNA-Seq foram preparadas pelo TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit de acordo com as instruções do fabricante. As seis bibliotecas diferentes foram emparelhadas pelo sistema NovaSeq 6000 da Illumina (Macrogen, Seul, Coreia). Os dados de sequência bruta obtidos foram depositados no banco de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI) Sequence Read Archive (SRA) com os seguintes respectivos números de adesão: SRR9127735, SRR9127737, SRR9127738, SRR91277333 e SRR9127734.
2.13. Mapeamento, normalização e identificação de genes expressos diferencialmente
Mapeamos as leituras de sequência bruta de cada biblioteca para transcrições de referência humanas versão GRCh38 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/)usando o alinhador BBMap com parâmetros padrão (https://sourceforge.net/projects/bbmap/). Usando o bbmap. sh opção, calculamos fragmentos por quilobase milhões (FPKM) valores para cada transcrição. Os valores FPKM obtidos de cada condição foram submetidos ao DEBrowser para normalização e análise de genes expressos diferencialmente (DEGs)[19].cistanche tamanho do pênisOs valores FPKM inferiores a 1 foram excluídos. Utilizando o EdgeRcom o método TMMnormalization e o tipo mais exato, identificamos genes expressos diferencialmente de acordo com valores p ajustados inferiores a 0,001 e alterações de dobra convertidas log2 de mais de um.
2.14. Ontologia genética (GO)Análise de enriquecimento de termos
Para análise de enriquecimento de termo GO, foram identificados DEGs com base em valores p ajustados inferiores a 0,05 e alterações de dobra convertidas log2 de mais de 0,5. Como resultado, foram identificados 22 genes regulados e 13 para baixo. Cada conjunto genético foi submetido à análise de enriquecimento usando o programa GORILLA com parâmetros padrão (http:/cbl-gorilla.cs.Technion.ac.il/)[20]. Selecionamos duas listas não ranqueadas de genes como o modo de execução usando 11.290 genes expressos como o conjunto de fundo.
3. Resultados
3.1. Preparação do LACCE de Edeluweiss
O LACCE foi obtido como mostrado na Figura 1. Resumindo, as sementes edelweiss foram esterilizadas e germinadas pela primeira vez (Figura 1A). Calo foi induzido a partir das folhas de sementes germinadas (Figura 1B) e submetido à cultura celular suspensa (Figura 1C). As células de suspensão foram cultivadas em bioreatores para a produção em larga escala de LACCE (Figura 1D).pó de cistancheAs células cultivadas foram colhidas e liofilizadas para estudos posteriores (Figura 1E). LACCE foi preparado por extração de calor. As diferentes concentrações de LACCE foram utilizadas para análises in vitro (0,1%, 0,5%, in vivo(1%) e transcriptome (1%)
Figura 1. Procedimento experimental para obter extrato de cultura de alpinum alpinum letopodium (LACCE) a partir de edelweiss calus usando um bioreator. (A) As sementes de Edelweiss foram esterilizadas e germinadas. (B) Calus foi induzido do tecido da folha de edelweiss. (C) Callus induzido foi cultivado em suspensão. (D) As células obtidas foram cultivadas em um bioreator. (E) As células calos foram colhidas e liofilizadas em grande quantidade.
3.2. Avaliação In Vitro do LACCE como agente anti-envelhecimento
Realizamos um ensaio de 3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolium brometo (MTT) para observar a viabilidade celular após o tratamento com LACCE. Neste estudo, usamos células imortalizadas em vez de células primárias da pele humana pelas seguintes razões. As linhas celulares imortais têm muitos benefícios, incluindo ser fácil de trabalhar, barato e um suprimento ilimitado de material.extrato de salsa cistancheAlém disso, podemos pular muitos problemas éticos relacionados ao uso de tecidos humanos. Além disso, as linhas celulares imortalizadas são preferencialmente utilizadas para o estudo de processos biológicos básicos, como o RNA-Sequenciamento (RNA-Seq). Duas linhas celulares diferentes, HaCaT e Detroit551, foram tratadas com três concentrações diferentes de LACCE (0,1%,0,5% e 1%). A viabilidade celular de células HaCaT e Detroit551 após o tratamento com LACCE foi comparável à do controle (Figura 2). Em detalhes, a viabilidade celular das células HaCaT foi ligeiramente reduzida de 98,61% (0,1% LACCE) para 94,72%(1% LACCE) à medida que a concentração de LACCE foi aumentada (Figura 2A). Em contrapartida, a viabilidade celular das células de Detroit551 aumentou ligeiramente de 95,99% (0,1%LACCE)para 99,95% (1%LACCE) à medida que a concentração de LACCE foi aumentada (Figura 2B).
Figura 2. Avaliação in vitro do LACCE como um agente anti-envelhecimento, incluindo citotoxicidade e atividade antioxidante. Viabilidade celular para três concentrações diferentes (0,1%, 0,5% e 1%) de LACCE em células HaCaT(A) e Células Detroib551 (B) pelo ensaio MTT. A barra cinza indica células tratadas com água destilada. (C) As células HaCaT foram tratadas com peróxido de hidrogênio. A viabilidade celular para três concentrações diferentes de LACCE foi medida pelo ensaio 3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolium brometo (MTT). N-acetilcisteína (NAC) foi usada como controle positivo. (D) A atividade antioxidante de diferentes concentrações de LACCE foi medida pelo ensaio DPPH. A vitamina C (Vit. C) foi utilizada como controle positivo.*e** indicam significância estatística com valores p inferiores a 0,05 e 0,01, respectivamente.haste cistanche(E) A morfologia celular em cada amostra tratada com peróxido de hidrogênio foi visualizada com coloração azul de metileno.
Além disso, conduzimos um ensaio MTT induzido por peróxido de hidrogênio (H2O2). Em geral, o peróxido de hidrogênio causou forte citotoxicidade (42,52% da viabilidade celular) em comparação com o controle negativo, enquanto a adição de Cisteína N-acetil (NAC), um antioxidante na célula, inibiu a citotoxicidade causada pelo peróxido de hidrogênio (60,24% da viabilidade celular). Com o aumento da concentração de LACCE, a viabilidade celular passou de 45,54% (0,1%LACCE) para 60,37% (1% LACCE) em resposta ao peróxido de hidrogênio (Figura 2C). Em particular, a taxa de inibição reativa da espécie de oxigênio (ROS) para o extrato de 1% LACCE foi comparável à do NAC. Além disso, a morfologia celular também foi observada após a coloração com azul metileno, mostrando um aumento na viabilidade celular do LACCE (Figura 2E).
Em seguida, realizamos um ensaio antioxidante usando um ensaio radical de limpeza radical 2,2-Difenil-1-picrylhydrazyl (DPPH). A atividade de limpeza radical do DPPH passou de 2,85% (0,1% LACCE) para 20,47%(1% LACCE) à medida que a concentração do extrato lacce foi aumentada. Em comparação com a vitamina C (14,05%), ambas as concentrações de 0,1% e 0,5% de LACCE apresentaram menor atividade de limpeza radical, enquanto a concentração de 1% do extrato lacce apresentou maior atividade de limpeza radical.
3.3.In Avaliação Vitro do Extrato lacce como um agente anti-inflamatório
Para examinar o efeito anti-inflamatório do LACCE, a expressão de dois genes marcadores inflamatórios codificando COX-2 e synthase de óxido nítrico indutível (iNOS), respectivamente, foram quantificados com RT-PCR em tempo real (Figura 3A, B). Em geral, a irradiação UVB regulava a expressão do gene COX-2 codificando uma proteína que induz inflamação (Figura 3A). Em comparação com o controle negativo, a adição de LACCE à célula HaCaT suprimiu significativamente a expressão do gene COX-2. No entanto, não houve diferenças significativas entre as diferentes concentrações de LACCE. Em comparação com o controle positivo contendo dexmemethasona (Dex), o LACCE (0,1% a 1%) apresentou um efeito anti-inflamatório muito semelhante. A expressão do gene iNOS foi inibida pelo controle positivo contendo Dex e LACCE (Figure3B). À medida que a concentração do extrato de LACCE foi aumentada, a expressão do gene iNOS foi gradualmente reduzida.
Figura 3. Avaliação in vitro do LACCE como agentes anti-inflamatórios, hidratantes e antirrugas por RT-PCR em tempo real. A expressão relativa de COX2(A) e iNOS (B), dois genes marcadores inflamatórios, em diferentes concentrações de LACCE em resposta a amostras tratadas com UVB, foi medida por RT-PCR em tempo real. A dexetasona (Dex) foi usada como controle positivo. Barras cinza e azul indicam células HaCaT sem e com tratamento UVB, respectivamente. (C) Expressão relativa do AOP3, um marcador positivo para efeito hidratante, em diferentes concentrações de LACCE. (D) Expressão relativa do MMP-2, um marcador de crescimento celular, em diferentes concentrações de LACCE em resposta ao UVB. A expressão dos genes individuais foi normalizada para a expressão genética GAPDH.* e* indicam significância estatística com valores p inferiores a 0,05 e 0,01, respectivamente.
Este artigo é extraído dos Genes 2020, 11, 230; doi:10.3390/genes11020230 www.mdpi.com/journal/genes
