Um método eficaz para tratar a fibrose renal
Mar 17, 2022
para mais informações:ali.ma@wecistanche.com
Parte Ⅰ:A proteína do retículo endoplasmático TXNDC5 promove a fibrose renal reforçando a sinalização de TGF nos fibroblastos renais
Yen-Ting Chen, Pei-Yu Jhao & et al.
Introdução
Fibrose renal, caracterizada por tubulointersticialfibrosee esclerose glomerular, é uma manifestação patológica comum da maioria, se não de todos, os tipos decrônicarimdoenças(DRC)(1). A progressão derenalfibroseem pacientes com DRC leva à perda gradual derimfunção, o que pode resultar em doença renal terminal (ESRD) que requer diálise ourimtransplante (2). Embora vários determinantes moleculares e vias tenham demonstrado contribuir para o processo defibrose renal, o fator de crescimento transformador beta (TGF- ) é geralmente considerado o principal regulador da fibrogênese renal (3). Na sequência de uma lesão norim, células epiteliais tubulares danificadas (TECs) são detidas na fase G2/M e secretam grandes quantidades de TGF-, desencadeando a ativação e transformação de fibroblastos renais adjacentes em miofibroblastos (4-6). Os miofibroblastos ativados, caracterizados pela expressão da actina do músculo liso (uma SMA), são altamente proliferativos e produzem proteínas de matrizes extracelulares (ECM) como colágeno fibrilar, elastina, fibronectina e CCN2 (comumente conhecido como fator de crescimento do tecido conjuntivo, CTGF)(7,8). Durante os estágios iniciais da lesão renal,fibrosefoi iniciada como uma resposta fisiológica adaptativa e autolimitada que auxilia no reparo tecidual e na manutenção da integridade estrutural(9). No entanto, após lesão renal crônica e repetida, a ativação e proliferação de miofibroblastos persistem, resultando em produção e acúmulo excessivo de MEC, levando à perda do parênquima renal funcional e, finalmente, à insuficiência renal (1O,11).
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Apesar dos avanços da medicina moderna, poucas terapias clínicas são comprovadamente eficazes contrafibrose renal. Inibidores da enzima conversora de angiotensina (IECAs) e bloqueadores dos receptores de angiotensina (BRAs), por exemplo, demonstraram reduzir a proteinúria, melhorarrenalfibrose, e retardar a progressão da DRC (12,13). A pentoxifilina, um inibidor inespecífico da fosfodiesterase, por outro lado, demonstrou inibir a expressão de ECM e CCN2 induzida por TGF- 1-, levando a atenuação tubulointersticialfibrose(14). O uso de IECAs e BRAs, no entanto, é limitado por seus efeitos hipotensores e potenciais efeitos adversos como hipercalemia. Além disso, nem os IECAs/BRAs nem o tratamento com pentoxifilina conseguiram interromper a progressão darenalfibrosee DRC(15,16). É, portanto, imperativo identificar novos mediadores ou vias que são críticas para a patogênese darenalfibrosedesenvolver terapêuticas eficazes contra a DRC (doenças renais crônicas).
Recentemente, identificamos o domínio de tiorredoxina contendo 5 (TXNDC5), uma proteína enriquecida com fibroblastos, residente no RE, com atividade enzimática de uma proteína dissulfeto isomerase (PDI), como um mediador crítico de doenças cardíacas.fibrose(17). Mostramos que o excesso de TXNDC5 promove o desenvolvimento defibroseatravés da ativação de fibroblastos cardíacos redox-dependente e produção de MEC. Deleção genética de Txndc5 melhorafibrosee disfunção contrátil induzida por agonista em camundongos (17). Com base no papel essencial observado de TXNDC5 na fibrogênese miocárdica, hipotetizamos que TXNDC5 também poderia contribuir criticamente para o desenvolvimento de tecidofibroseem órgãos não cardíacos, principalmentefibrose renal.
No presente estudo, mostramos que TXNDC5 foi altamente regulado em ambos os rins fibróticos de humanos e camundongos, especificamente nos fibroblastos renais secretores de colágeno. A exclusão global de Txndc5 atenuou marcadamente a extensão darenalfibroseem vários modelos de camundongos de lesão renal. Mecanicamente, demonstramos que o TXNDC5 excessivo, induzido por TGF- 1 via via de estresse ER dependente de ATF6-, aumentarenalfibrosepromovendo a ativação/proliferação de fibroblastos renais e a produção de ECM através da estabilização pós-tradução e regulação positiva do receptor de TGF-tipo I (TGFBR1). É importante ressaltar que mostramos que induzir a deleção específica de fibroblastos de Txndc5 efetivamente melhorou o desenvolvimento e a progressão defibrose renalinduzida por vários tipos de lesões em camundongos, sugerindo que o direcionamento de TXNDC5 pode ser uma abordagem nova e poderosa para tratarrenalfibrosee preservarrimfunção.
Figura 1. TXNDC5 foi significativamente regulado positivamente em rins fibróticos de camundongos e espécimes renais de pacientes com DRC( doenças renais crônicas).
(A) coloração IHC (n=3) e (B) immunoblots (n=6) mostraram que a expressão proteica de TXNDC5 foi regulada positivamente em rins fibróticos de camundongos induzidos por UUO ou uIRI, em comparação com rins contralaterais (CL) . Barra de escala: 50 μm.
(C) RT-PCR quantitativo mostrou que o transcrito de Txndc5 foi regulado positivamente em rins fibróticos de camundongos induzidos por UUO e uIRI (n=4-7).
(D) Reanálises de dados de microarray em amostras de rim humano de pacientes com DRC (GSE66494) mostraram que TXNDC5, COL3A1 e FN1 foram significativamente regulados positivamente nos tecidos renais de pacientes com DRC (controle saudável n=8, CKD n {{ 6}}). Para A–C, os dados são representativos de 3 ou mais réplicas experimentais independentes.
Para todos os painéis, os dados são apresentados como média ± SEM. *P < {{0}}.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" por="" 2-teste="" t="" dos="" lados="" (a–c)="" ou="" man-="" teste="" de="" whitney="">
Resultados
TXNDC5 foi significativamente regulado positivamente em rins fibróticos de humanos e camundongos. Investigar o potencial envolvimento de TXNDC5 na patogênese dafibrose renal, primeiro determinamos seus níveis de expressão proteica nos tecidos fibróticos do rim de camundongos induzidos por obstrução ureteral unilateral (UUO), lesão de isquemia-reperfusão unilateral (uIRI) ou pela administração de ácido fólico (FA). Estudos de imuno-histoquímica revelaram aumentos acentuados na intensidade da coloração de TXNDC5 nas seções renais de todos os 3 modelos de camundongos derenalfibrose(Figura 1A e Figura 1A suplementar; material suplementar disponível online com este artigo; https://doi.org/10.1172/JCI143645DS1). A imunotransferência e a PCR de transcrição reversa quantitativa (RT-PCR) também mostraram uma regulação positiva significativa dos níveis de expressão da proteína (Figura 1B) e da transcrição (Figura 1C e Figura 1B suplementar) de TXNDC5 em rins de camundongos fibróticos. Consistente com esses resultados, a reanálise de dados de microarray obtidos de espécimes de biópsia renal de pacientes com DRC (GSE66494)(18) mostrou que os níveis de expressão de TXNDC5 (em 2,24 vezes, P<0.001), as="" well="" as="" of="" markers="" for="">fibrose renalcomo COL3A1 e FN, também foram significativamente aumentados nas amostras de rim de pacientes com DRC em comparação com os de controles saudáveis (Figura 1D e Figura 1C suplementar). Em conjunto, a suprarregulação observada da expressão de TXNDC5/Txndc5 em rins fibróticos humanos/camundongos e sua correlação positiva com genes de proteínas fibrogênicas da MEC sugerem um papel potencial de TXNDC5 na patogênese dafibrose renal.
Figura 2. TXNDC5 foi altamente regulado em fibroblastos renais, mas não em TECs, células endoteliais ou podócitos dos rins fibróticos.
(A e C) A coloração IF de TXNDC5 (vermelho) em seções de rins fibróticos induzida por UUO em camundongos Col1a1-GFPTg mostrou que TXNDC5 foi expresso principalmente em fibroblastos renais secretores de colágeno (verde), tanto no córtex renal quanto na medula (n=6). Os núcleos celulares foram corados com DAPI (azul). Barra de escala: 100 μm.
(B) Coloração IF de TXNDC5 (verde) na seção de rins fibróticos induzida por UUO em camundongos Cdh16-Cre, NPHS2-Cre e Tie2-Cre/ERT2 tdTomato. Os núcleos celulares foram corados com DAPI (azul). Barra de escala: 100 μm.
(D) Um gráfico de pizza para ilustrar a proporção de células TXNDC5 plus em diferentes tipos de células renais nos rins fibróticos induzidos por UUO.
Os dados são representativos de 3 ou mais réplicas experimentais independentes. Os dados em C são apresentados como média ± SEM.
TXNDC5 foi altamente enriquecido em fibroblastos renais secretores de colágeno nos rins fibróticos. Vários tipos de células renais têm sido implicados no processo de fibrogênese renal. Após lesões renais, os fibroblastos renais residentes (19) e perivasculares (20) se diferenciam em miofibroblastos ativos e resultam no acúmulo de MEC. TECs e células endoteliais também foram relatados para contribuir para o desenvolvimento defibrose renalatravés da transição epitelial e endotelial-mesenquimal, respectivamente (10,21).fibrose, várias linhas de camundongos repórteres que permitem a marcação de fluorescência de fibroblastos renais (Colla1-GFP', GFP impulsionado por Collal potenciador/promotor, ref.22), TECs(Cdh16-Cre ROSA26- tdTomato), células endoteliais (Tie2-Cre/ERT2 ROSA26-tdTomato) e podócitos (NPHS2-Cre ROSA26-tdTomato) foram submetidos a UUO, uIRI ou tratamento de FA para induzirfibrose renal. A coloração de imunofluorescência (IF) das seções renais desses animais revelou que TXNDC5 foi marcadamente suprarregulado e altamente co-localizado com fibroblastos renais secretores de colágeno GFP-positivos em rins de camundongos fibróticos induzidos por UUO (81 por cento) (Figura 2, A e C) , uIRI (76,8 por cento ) e tratamento com FA (73,4 por cento ) (Figura Suplementar 2, A e B). por cento) e células endoteliais (2,05 por cento) (Figura 2,B e D). A análise de citometria de fluxo de fibroblastos isolados de rins de camundongos submetidos a UUO revelou uma expansão marcada em fibroblastos renais TXNDC5*, bem como uma regulação positiva significativa de TXNDC5 nessas células, comparados com os de rins contralaterais de controle (Figura Suplementar 2C). O forte enriquecimento observado de TXNDC5 em fibroblastos renais em fibróticos sugere que TXNDC5 poderia contribuir parafibrose renalregulando a atividade/comportamento dessas células fibrogênicas secretoras de colágeno.
TXNDC5 foi essencial e suficiente para induzir a ativação, proliferação e produção de ECM de fibroblastos renais. Em seguida, determinamos o papel funcional de TXNDC5 em fibroblastos renais. Fibroblastos renais humanos primários (HKFs) estimulados com TGF- 1(10 ng/mL) mostraram uma forte regulação positiva na proteína (Figura 3A) e níveis de expressão de transcrição (Figura 3B) de TXNDC5, bem como do marcador de ativação de fibroblastos periostina e proteínas ECM (COL1Al, fibronectina e CCN2). A desativação de TXNDC5 com shRNA atenuou significativamente a regulação positiva de proteína/mRNA induzida por TGF{10}de periostina e várias proteínas de ECM em HKFs (Figura 3, A e B). Além disso, o tratamento com TGF1 aumentou a atividade proliferativa de HKFs, que foi anulada completamente pelo knockdown de TXNDC5 (Figura 3D). Esses resultados sugerem que TXNDC5 é essencial para a ativação, proliferação e produção de ECM de HKF induzida por TGF. A superexpressão de TXNDC5, por outro lado, resultou em marcada regulação positiva de periostina, COL1A1 e fibronectina (Figura 3C), bem como aumento da atividade proliferativa (Figura 3E) em HKFs. Coletivamente, esses resultados demonstram que TXNDC5, a jusante de TGF- 1, é essencial e suficiente para promover a ativação, proliferação e produção de ECM de fibroblastos renais.
Figura 3. Knockdown da ativação de HKF induzida por TGF- 1 atenuada por TXNDC5 e produção de ECM; a superexpressão de TXNDC5 foi suficiente para desencadear a ativação de HKF e a produção de ECM.
(A) Proteína e (B) níveis de expressão de transcrição do marcador de ativação de fibroblastos (periostina) e proteínas ECM (COL1A1, fibronectina e CCN2) foram aumentados no controle (Scramble) HKFs após TGF- 1 (10 ng/mL) tratamento. Knockdown de TXNDC5 atenuou a regulação positiva desses marcadores fibrogênicos induzida por TGF- 1 em HKFs (n=5–10).
(C) A superexpressão de TXNDC5 foi suficiente para induzir a regulação positiva do marcador de ativação de fibroblastos (Periostina) e proteínas ECM (COL1A1, fibronectina) em HKFs (n=3-10).
(D) O tratamento de TGF- 1 (10 ng/mL) aumentou a atividade de proliferação celular de HKFs, que foi revogada pelo knockdown de TXNDC5.
(E) A superexpressão de TXNDC5 aumentou a atividade de proliferação celular de HKFs. Em D e E, n=10. Os dados são representativos de 3 ou mais réplicas experimentais independentes.
Para todos os painéis, os dados são apresentados como média ± SEM. A significância estatística das diferenças para 2 grupos foi determinada por um teste t 2-lateral e entre 3 ou mais grupos foi determinada usando 1-way ANOVA, seguido por testes post hoc de Sidak. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>
Deleção global de Txndc5 protegida contra rim b. Para determinar a exigência de TXNDC5 no desenvolvimento defibrose renalin vivo, WT e Tndc5-/camundongos foram submetidos ao tratamento com UUO, uIRI e FA. Picrosirius red e coloração tricrômica de Masson nas seções renais mostraram extensarenalfibroseem camundongos WT após UUO (Figura 4A), uIRI (Figura 5A) e a administração de FA (Figura 3A complementar). A exclusão global de Txndc5 reduziu significativamente a extensão darenalfibroseem todos os 3 modelos de lesão renal (Figura 4A, Figura 5A e Figura 3A suplementar).
Figura 4. Deleção de Txndc5 atenuada fibrose renal induzida por UUO.
(A) Coloração Picrosirius red (2 painéis superiores) e coloração tricrômica de Masson (2 painéis inferiores) de seções de rim de camundongos WT e Txndc5-7 10 dias após UUO. Gráficos de barras dos resultados quantitativos das áreas de coloração de Picrosirius red e tricrômico de Masson são mostrados à direita (n=5-10).Barra de escala∶ 100 μm.
(B) Imagens SHG das seções renais de WT e Txndc5-/camundongos 10 dias após UUO. Os resultados quantitativos de áreas SHG-positivas mostraram acúmulo aumentado de colágeno fibrilar (verde) em WT, mas não em rins de camundongos Txndc5 após lesão.
Para cada uma das seções de rim fotografadas para SHG, a imagem TPEF foi obtida para mostrar o perfil do tecido digitalizado (cor vermelha nos painéis inferiores)(n=3). Barra de escala: 50 um. (C)Immunoblots mostraram níveis de expressão proteica do marcador de ativação de fibroblastos (Periostina) e ECM (COL1A1) no extrato de rim inteiro de WT e Txndc5-/camundongos 10 dias após UUO (n= 3-6). Os dados são representativos de 3 ou mais réplicas experimentais independentes.
Para todos os painéis, os dados são apresentados como média± SEM. A significância estatística das diferenças entre 3 ou mais grupos foi determinada usando 1-way ANOVA, seguido por testes post hoc de Sidak.**P<><>
Para quantificar o colágeno fibrilar patogênico (tipo I e II) especificamente e evitar a superestimação de áreas fibróticas com métodos tradicionais de coloração, microscopia de geração de segundo harmônico (SHG), um novo sistema de imagem de tecido óptico que permite a visualização de fibras fibrilares, mas não não fibrilares, colágeno em órgãos fibróticos(23,24), foi empregado para avaliar a extensão dafibroseem WT e Tndc5 mais rins de camundongos após lesão. Consistente com os resultados acima mencionados, a microscopia SHG mostrou aumentos marcados na deposição de colágeno fibrilar nos rins WT após o tratamento com UUO (Figura 4B), uIRI (Figura 5B) e FA (Figura Suplementar 3B), cuja extensão foi significativamente reduzida em Txndc{{ 4}}/ camundongos (Figura 4B, Figura 5B e Figura Suplementar 3B).
Consistente com a resposta fibrótica pós-lesão atenuada em rins de camundongos Txndc5 observadas por estudos de imagem, a deleção de Tendc5 também atenuou a regulação positiva de genes de proteínas ECM, incluindo Collar, Eln, Fnl e Ccn2 nos rins de camundongos após lesão (Figura Suplementar 3, CE). Imunotransferências de lisados de tecido renal inteiro também mostraram nível reduzido de proteína de ECM (COLIA1) e marcador de ativação de fibroblastos (periostina) em Txndc5-/camundongos em comparação com camundongos WT após UUO e uIRI (Figura 4C e Figura 5C).
Figura 5. Deleção de Txndc5 melhorou a fibrose renal induzida por ulRI.
(A) Coloração Picrosirius red (2 painéis superiores) e coloração tricrômica de Masson (2 painéis inferiores) de seções de rim de camundongos WT e Txndc5-7 28 dias após ulRI.Gráficos de barras dos resultados quantitativos de Picrosirius red e tricrômio de Masson as áreas de coloração são mostradas à direita (n=6). Barra de escala∶ 100 μm.
(B) imagens SHG das seções de rim de WT e Txndc5-camundongos 28 dias após ulRI. Os resultados quantitativos de áreas SHG-positivas mostraram acúmulo aumentado de colágeno fibrilar (verde) em WT, mas não em rins de camundongos Txndc5 após lesão. Para cada uma das seções de rim fotografadas para SHG, a imagem TPEF foi obtida para mostrar o perfil do tecido digitalizado (cor vermelha nos painéis inferiores).
(C) Immunoblots mostraram níveis de expressão proteica do marcador de ativação de fibroblastos (Periostina) e ECM (COL1A1) no extrato de rim inteiro de WT e Txndc5/camundongos 28 dias após ulRI (n=5-9). Os dados são representativos de 3 ou mais réplicas experimentais independentes.
Para todos os painéis, os dados são apresentados como média ± SEM. A significância estatística das diferenças entre 3 ou mais grupos foi determinada usando 1-way ANOVA, seguido por testes post hoc de Sidak.*P<><><>
Para excluir a possibilidade de que TXNDC5 expresso em outros tipos de células renais, como TECs, podócitos e células endoteliais, ainda possa contribuir para o desenvolvimento derenalfibrose, geramos camundongos nocaute condicional Txndc5 específicos para TECs (Cdh16-cre*Txcndc5i, ou Txndc5Epeko), podócitos (NPHS2-cre*Txndc5/n, ou Tendc5Podxko) e células endoteliais(Tie{{ 7}}cre/ERT2*Tendc5/, ou Txndc5Endo.eko). Em experimentos usando camundongos Txndc5Pieko e Txndc5 Poio-cko, Txndc5Wmicefoi usado como controle; em experimentos em camundongos Txndc5EMio-eko, a deleção de Txndc5 foi induzida usando tamoxifeno conforme descrito na Figura 9A, onde camundongos Tie2-Cre/ERT2 tratados com tamoxifeno foram usados como controles. A deleção direcionada de Txndc5 em TECs, podócitos ou células endoteliais, no entanto, não afetou a extensão dafibrose renalinduzida por UUO ou FA (Figura Suplementar 6, BE). Esses resultados sugerem que o TXNDC5 expresso em TECs, podócitos e células endoteliais contribui pouco ou nada para a patogênese da doença.rimfibrose.
A deleção de Txndc5 em fibroblastos renais protege contra a apoptose de TEC em resposta a lesão renal. No processo derenalfibrose, os TECs lesionados perdem a função mitocondrial e a polaridade apicobasal, seguidos de apoptose e morte celular(30). seções 10 dias após UUO. O número de TECs apoptóticos aumentou significativamente nos rins fibróticos induzidos por UUO de camundongos WT, enquanto a deleção de Txndc5 atenuou a extensão da TECapoptose. Foi relatado que fibroblastos renais ativados podem induzir apoptose de TEC por meio de efeitos parácrinos (31). Como Tendc5 é pouco expresso em TECs, é provável que a apoptose reduzida de TEC observada em camundongos Txndc5-7 após UUO não tenha sido um efeito autônomo de célula, mas sim secundário à redução intersticialfibrosee, portanto, menos sinais proapoptóticos dos fibroblastos renais circundantes. Consistente com esta hipótese, a deleção específica de fibroblastos de Txndc5 (Tendc5kO) atenuou a apoptose de TEC em uma extensão semelhante à observada em Txndc5-/camundongos 10 dias após UUO (Suplementar). Em contraste com a redução observada em TECapoptose, o número de macrófagos F4/80-positivos e células endoteliais CD31-positivas foram comparáveis em rins de camundongos WT e Txndc5-, com ou sem UUO, sugerindo que a deleção de Txndc5 não afeta a infiltração de macrófagos ou densidade capilar peritubular nos rins de camundongos. Em conjunto, esses dados sugerem que os efeitos renoprotetores da deleção de Txndc5 resultam da redução do interstício tubularfibrosee apoptose de TEC, sem afetar a densidade capilar renal ou macrófagos.
A deleção induzida de Tendc5 em fibroblastos renais diminuiu a progressão defibrose renal. Para determinar se o direcionamento de Txndc5 no rim pode ser benéfico emrenalfibrose, a deleção de Txndc5 em fibroblastos renais foi induzida em camundongos Txndc5eko 10 dias após UUO, um ponto no tempo em que extensarenalfibrosepode ser observado. Nesses experimentos, camundongos Colla2-Cre tratados com tamoxifeno foram usados como controles. Como mostrado, os camundongos Colla2-Cre e Tcndc5eko tiveram uma extensão semelhante derenalfibrose10 dias após UUO antes do tratamento com tamoxifeno. Onze dias após a injeção de tamoxifeno, no entanto, a extensão da fibrose renal continuou a progredir nos camundongos controle (a área fibrótica aumentou de 5,1% para 10,6%), enquanto a progressão darimfibrosefoi quase interrompido (área fibrótica mudou de 5,3% para 6,9%) em camundongos Txndc5eko. Immunoblotting também mostrou upregulation marcadamente atenuado de CCN2, periostina e TGFBR1 em camundongos Txndc5eko em comparação com camundongos controle entre D10 e D21 após UUO. Esses resultados demonstram que a deleção intervencionista de Txndc5 em fibroblastos renais diminui significativamente a progressão defibrose renal, sugerindo que o direcionamento in vivo de TXNDC5 pode ser uma nova e poderosa abordagem terapêutica para melhorarrimfibrosee retardar a progressão da DRC.
