Avanços na Identificação Molecular de Cistanche

Resumo:CistanchesHerba, um material medicinal raro e valioso na China, tem alto valor medicinal e valor ecológico. Em meio ao avanço das técnicas de biologia molecular, uma variedade de técnicas de identificação molecular baseadas em DNA foi gradualmente aprimorada e grandes avanços foram feitos na pesquisa sobreCistanchesErva. Este artigo revisa as técnicas de identificação molecular baseadas em DNA paraCistanchee discute as limitações e perspectivas de aplicação, que se espera que sirva de referência para identificação precisa e avaliação da qualidade da Erva Cistanches, proteção e utilização racional dos recursos e variedade de melhoramento.

Palavras-chave:Cistanche; identificação molecular; técnica de marcadores moleculares; a identificação e qualidade; conservação de recursos

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Cistanche é o caule carnudo com folhas secas de Cistanche deserticola YC Ma ecistanche tubulosa(Schenk) Wight, uma planta do gêneroCistanchena família Cistanche. Jiangyun, Cunyun, Cistanche e Chagangaoya (língua mongol) são conhecidos como "ginseng do deserto" [2]. Nos últimos anos, como os recursos de Cistanche selvagem estão à beira do esgotamento e a demanda doméstica está aumentando dia a dia, um grande número de produtos falsificados de Cistanche fluiu para o mercado de ervas medicinais chinesas, causando grandes flutuações nos preços de mercado. , e a qualidade dos materiais medicinais não pode ser garantida, o que põe em sério risco a segurança da medicação clínica. sexo [3]. Portanto, a preservação, pesquisa e desenvolvimento racional e utilização dos recursos de germoplasma vegetal Cistanche são iminentes, e a identificação precisa dos recursos de germoplasma vegetal Cistanche é especialmente importante.

tão importante. A edição de 2020 da "Pharmacopeia da República Popular da China" (doravante denominada "Farmacopeia Chinesa") registra apenas que os caules carnudos e escamosos secos de Cistanche deserticola são usados ​​como medicamentos genuínos. Do ponto de vista da situação, além das plantas Cistanche e Cistanche tubehua registradas na edição 2020 da "Farmacopeia Chinesa", também existem Cistanche sinensis G. Beck, C. salsa (CA Mey.) G. Beck, Lanzhou Cistanche C. lanzhouensis ZY Zhang, etc. [4], há também um grande número de fenômenos de doping falsificados. Com o desenvolvimento e melhoria contínua da tecnologia de biologia molecular, a tecnologia de identificação molecular tem as vantagens de menor consumo de amostra, alta velocidade e alta precisão, e tem sido amplamente utilizada na identificação de espécies de animais e plantas. O desenvolvimento da pesquisa de mineração de recursos também é relativamente rápido [5]. Atualmente, tem havido algum progresso na identificação de materiais medicinais Cistanche por tecnologia de identificação molecular. De acordo com a classificação da tecnologia de marcadores moleculares necessária para identificação molecular [6], este artigo revisa a identificação de germoplasma de Cistanche deserticola e outros aspectos, e discute a existência de identificação de germoplasma de Cistanche deserticola. Analisar os problemas e propor soluções correspondentes, com o objetivo de servir de referência para a proteção, utilização racional e cultivo de novas variedades de plantas Cistanche.

1 Aplicação da tecnologia DNA barcoding na identificação de plantas Cistanche

1.1 Tecnologia de código de barras de DNA

Em 2003, o professor Paul Hebert, da Universidade de Guelph, no Canadá, introduziu a tecnologia de código de barras no mundo biológico e propôs pela primeira vez o conceito de "código de barras de DNA" [7]. A tecnologia de código de barras de DNA é um método eficaz para identificar a medicina tradicional chinesa e matérias-primas de base múltipla. Para o respectivo DNA, os fragmentos candidatos foram amplificados pela reação em cadeia da polimerase (PCR) do iniciador geral, os produtos de amplificação por PCR foram purificados, sequenciados e analisados, a sequência de código de barras de DNA alvo foi pesquisada e um sistema de reconhecimento de código de barras de DNA foi construído [8 ]. Em conclusão, a identificação de código de barras de DNA é um método de identificação biomolecular que utiliza um ou alguns fragmentos de DNA padrão relativamente curtos para identificação de espécies [9].

Nos últimos anos, através da combinação de tecnologia de sequenciamento de alto rendimento e tecnologia de identificação de código de barras de DNA, foi desenvolvida uma nova tecnologia que pode detectar sequências de código de barras de várias espécies em amostras mistas ao mesmo tempo——DNA metabarcode, o princípio básico do qual é aplicar sequenciamento de alto rendimento A tecnologia obtém a sequência amplificada do código de barras misto e identifica a composição das espécies na amostra mista por meio de análise bioinformática[10].

1.2 Seleção de sequências de código de barras de DNA

As sequências de código de barras que podem ser usadas na tecnologia de DNA barcoding incluem coenzima mitocondrial Ⅰ (CO Ⅰ) DNA, sequências 12S rRNA, 16S rRNA e ribossomal 18S rDNA para identificação de espécies animais[11]; 16S rDNA ribossomal para identificação bacteriana[12]], fragmentos específicos do gene do espaçador transcrito interno ribossômico (ITS) e sequências CO I para identificação fúngica[13]; devido à lenta taxa de evolução dos genomas mitocondriais nas plantas, os fragmentos de código de barras são selecionados principalmente no genoma do cloroplasto. trnH-psbA, psbK-psbI e

Gene nucleado ITS[14]. Em 2006, o grupo de pesquisa de Chen Shilin testou a capacidade de discriminação do ITS2 em mais de 6.600 amostras de plantas e descobriu que a eficiência de identificação do ITS2 no nível da espécie chegava a 92,7%, indicando que a sequência do ITS2 pode identificar códigos de barras de DNA padrão de plantas medicinais e espécies próximas. O ITS2 foi usado como um novo tipo de código de barras de DNA universal para plantas medicinais [15] e foi reconhecido por especialistas internacionais [16].

Em 2013, o Comitê Nacional de Farmacopeia discutiu e aprovou a inclusão das diretrizes para a identificação molecular de códigos de barras de DNA para materiais medicinais chineses na edição suplementar da "Farmacopeia Chinesa". O ITS2 é o principal sistema de identificação de código de barras de DNA para materiais medicinais vegetais [17].

Atualmente, muitos estudiosos realizam pesquisas de identificação molecular em plantas Cistanche. De acordo com a pesquisa de Chen Shilin et al. [18], ITS2 é adequado como uma sequência de código de barras padrão para identificação de plantas medicinais. Sun Zhiying et al [19] descobriram que a sequência ITS2 pode ser usada como base para identificar efetivamente o fitoterápico chinês Cistanche deserticola e seus produtos falsificados em códigos de barras de DNA. Wang Xiaoyue et al[20] usaram códigos de barras ITS2 para identificar 4 produtos ofuscados comuns de Cynomorium, Cistanche, Liedang e Cistanche, e estabeleceram com sucesso o "cartão de identidade molecular" dos produtos ofuscados de Cistanche. O método de identificação de plantas medicinais por meio de sequências ITS2 é relativamente maduro e apresenta as vantagens de rapidez, precisão e eficiência. Portanto, usar a sequência ITS2 para identificar plantas Cistanche tornou-se o método mais comumente usado.

1.3 Fluxo de trabalho do DNA barcoding

O fluxo de trabalho do DNA barcoding é semelhante à operação de pesquisa filogenética molecular, e as principais etapas são mostradas na Figura 1. Gu Xiuyan [21] obteve a sequência de base do ITS e analisou as diferenças entre as espécies e descobriu que Cistanche está intimamente relacionado à solução salina de Cistanche, e Cistanche em Lanzhou está intimamente relacionado com Cistanche, que também fornece uma base para o desenvolvimento de novas fontes de drogas de Cistanche. base. Li Zhenhua et al[22] realizaram pesquisas de identificação molecular de DNA em Cynomorium, Cistanche e Huanghua Liedang, e realizaram uma identificação rápida e precisa de Cistanche e Cynomorium, Cistanche e Huanghualiedang falsificados por PCR específico do local.

Em suma, já existe um processo relativamente completo de identificação de espécies vegetais por meio de códigos de barras de DNA. Identificar plantas Cistanche analisando sequências de DNA e estabelecendo um banco de dados relacionado pode fornecer mais base para a identificação e classificação de plantas Cistanche no futuro.

1.4 Análise de dados de DNA barcoding

Processar e analisar os dados obtidos é uma tarefa muito importante[18]. Após a conclusão do sequenciamento, a comparação de sequências e a correção manual são realizadas para remover sequências de baixa qualidade e regiões de primers. O software comumente usado inclui Chromas, CExpress[23], etc.; A análise da distância genética da sequência final é geralmente realizada pelo software MEGA [24] para analisar a distância genética entre amostras de diferentes espécies de plantas, e o modelo K2P [25-26] é usado para calcular a distância intraespecífica entre espécies ; em seguida, construa a árvore filogenética de junção de vizinhos (NJ), usando o site on-line iTol [27] para melhorar e embelezar a árvore de desenvolvimento (https://itol.embl.de/) e verifique a taxa de suporte de cada ramo de acordo com o bootstrap (1000 repetições).

O método BLAST é um algoritmo de busca baseado no BLAST. É necessário estabelecer ou baixar um banco de dados de sequência de referência para identificação de espécies no banco de dados GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) para posterior análise de fragmentos de genes e trabalhos de identificação de espécies [28]. Xu Danyun et al [29] usou 3 pares de iniciadores universais de código de barras de DNA para identificar 22 espécies de plantas Lauraceae e identificou com sucesso 20 espécies de plantas. Adolfo et al[30] identificaram com sucesso 3 espécies de plantas Pueraria usando códigos de barras ITS2 e matK. Os estudos acima demonstram que, por meio da obtenção e análise das sequências de DNA de plantas medicinais, as espécies vegetais podem ser identificadas de forma rápida e eficiente.

2 Aplicação de outras técnicas de marcadores moleculares na identificação de plantas Cistanche

Para os organismos, suas características acima do nível molecular são determinadas por características moleculares. Em comparação com a análise morfológica [31] e a análise cromossômica [32], os marcadores moleculares podem revelar a verdadeira face da diversidade genética biológica. Sarwat et al [33] usaram polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado (AFLP), tecnologia de locus de microssatélites polimórficos amplificados seletivamente (SAMPL), amplificação de intersequência simples de repetições (ISSR), DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD) e outras técnicas de marcadores moleculares detectaram a diversidade genética de amostras de Tribulus terrestris coletadas em diferentes lugares da Índia, e os resultados mostraram que essas quatro técnicas de marcadores moleculares podem obter diferentes impressões digitais de DNA exclusivas para cada região geográfica. A União Internacional para a Proteção dos Direitos de Variedades Vegetais (UPOV) também usa a identificação de marcadores moleculares de DNA como um meio auxiliar para testes de DUS (distinção, uniformidade e estabilidade) de variedades de culturas [34]. Atualmente, tecnologias de marcadores moleculares como AFLP, RAPD e ISSR são relativamente maduras e amplamente utilizadas na identificação de plantas Cistanche (Tabela 1).

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