Acteoside derivado de Cistanche melhora a osteoporose induzida por glicocorticoides ativando a via PI3K/AKT/mTOR

Resumo

Objetivo

Os glicocorticóides são amplamente utilizados na prática clínica; no entanto, eles podem causar efeitos colaterais, comoosteoporose. Acteoside(ACT) de Cistanche tem sido usado para combater uma variedade de doenças. O estudo foi conduzido para avaliar a eficácia da ACT na indução de glicocorticóidesosteoporose(GIOP) e seu potencial mecanismo.

Métodos
Dexametasona (Dex) foi injetada por via intramuscular para induzirosteoporoseem um modelo de rato, e ACT foi administrado por via oral. ACT foi suplementado in vivo em ratos estimulados por DexosteoblásticoCélulas MC3T3-E1. RT-qPCR foi realizado para avaliar os níveis de mRNA deformação óssea(Runx2, CoL1A1) e reabsorção óssea (OPG e RANKL). Um kit ELISA comercial foi aplicado para avaliar os níveis séricos de OC e CTX. Western blot foi realizado para avaliar os níveis de proteína na via de sinalização PI3K/AKT/mTOR. O ensaio CCK-8 e a citometria de fluxo foram realizados para avaliar a viabilidade e apoptose dos osteoblastos.

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Resultados
A ACT reduziu a deterioração da microestrutura óssea induzida por Dex, aumentou os níveis séricos de OC e diminuiu os níveis de CTX (P< 0.05). In the MC3T3-E1 cells, Dex inhibited cell viability and apoptose promovida; no entanto, esse efeito foi bastante atenuado pelo ACT (P< 0.05). Concurrently, ACT reversed the reduction in Runx2, osterix, CoL1A1, and OPG mRNA levels, ALP activity, and the promotion of RANKL by Dex. Additionally, ACT attenuated Dex-induced inhibition of p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and p-PI3K/PI3K protein levels by Dex (P < 0.05), while the PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitor LY294002 diminished the potential effect of ACT (P < 0.05).

Conclusão
ACT deCistanchepode exercer efeitos osteoprotetores ativando a via de sinalização PI3K/AKT/mTOR para aliviar a osteoporose induzida por Dex.

Palavras-chave:Acteoside Cistancheinduzido por glicocorticóidesosteoporose

Introdução
A osteoporose (OP) é ​​uma doença esquelética generalizada caracterizada por baixa massa óssea, destruição da microestrutura do tecido ósseo e desequilíbrio na homeostase óssea [1]. A OP causa mais de 8,9 milhões de fraturas por ano e as fraturas osteoporóticas ocorrem quase a cada 3 segundos, levando à incapacidade vitalícia ou à morte [2]. Os glicocorticóides (GCs) são comumente administrados para o tratamento de doenças inflamatórias não infecciosas (como asma e doença inflamatória intestinal), bem como condições autoimunes [3]. No entanto, o uso prolongado de GC predispõe a mais de 30% dos casos de OP e mais de 10% dos casos de osteonecrose [4]. Os GCs inibem diretamente a proliferação e diferenciação osteoblástica [5], diminuem a maturação e a atividade e induzem a apoptose de osteoblastos, o que, por sua vez, leva ao desenvolvimento de osteoporose induzida por glicocorticóides (GIOP) [6]. Além disso, evidências crescentes sugerem que a disfunção osteoblástica é a principal causa de perda óssea. Portanto, o aumento do número e da função dos osteoblastos parece ser a principal estratégia para prevenir a OP, especialmente a GIOP.

Os medicamentos fitoterápicos, principalmente aqueles baseados em compostos naturais, são praticados há milhares de anos para o tratamento de diversas doenças [7]. Cistanche é uma erva preciosa registrada na Farmacopeia Chinesa que cresce na área sul da Região Autônoma Uigur de Xinjiang e é conhecida como ginseng do deserto [8]. Provou-se que o Cistanche tem vários efeitos, como aprimoramento imunológico, proteção renal, antienvelhecimento, antioxidante, antiinflamatório e efeitos neuroprotetores [9].Acteoside(ACT) é um glicosídeo fenil etanólico em Cistanche, que possui atividades biológicas, como inibição da apoptose neuronal [10], alívio de danos hepáticos [11], anti-inflamatório [12], antioxidação [13] , prevenção de diabetes [14] e obesidade [15], bem como a degeneração da cartilagem articular [16]. Além disso, vários estudos relataram a farmacocinética da ACT e confirmaram que o efeito terapêutico existe mesmo que a utilização oral seja de apenas 0,12%. O ACT é considerado um pró-fármaco com metabólitos ativos in vivo [17].

Zhang et ai. demonstraram um potencial efeito protetor da ACT na perda óssea induzida por ovariectomia em ratos [18]. O ACT modula a via de sinalização IGF-1/PI3K/mTOR para prevenir a perda óssea em ratos diabéticos [19]. Foi relatado que a via PI3K/AKT/mTOR tem papéis reguladores críticos em várias doenças, incluindo GIOP [20]. A naringina alivia a GIOP regulando a via de sinalização PI3K/AKT/mTOR [21]. Além disso, esta via de sinalização regula a diferenciação osteoblástica [22], a formação óssea [23] e a consolidação de fraturas [24]. No entanto, o papel potencial do ACT no GIOP e se ele é regulado pela modulação da via de sinalização PI3K/AKT/mTOR é desconhecido.

O presente estudo teve como objetivo compreender os efeitos protetores da ACT em um modelo GIOP de rato e osteoblastos in vitro e elucidar os mecanismos moleculares subjacentes.

materiais e métodos
animais experimentais
Quarenta ratos machos Sprague-Dawley (SD) de 8-semanas de idade, pesando 280–340 g, foram obtidos do Shanghai Laboratory Animal Center (CAS, Shanghai, China). Os procedimentos de cuidado dos animais experimentais foram realizados seguindo o protocolo aprovado pelo Comitê de Ética Animal do Terceiro Hospital Afiliado da Qiqihar Medical University. E o estudo foi conduzido de acordo com as diretrizes ARRIVE. Os animais foram alojados em centros de animais livres de patógenos, 24 ± 2 graus, ciclos de 12 horas de luz e escuridão, 50 ± 5 por cento de umidade e com livre acesso a comida e água.

Construção do modelo GIOP
Após 7 dias de alimentação adaptativa, os ratos foram divididos aleatoriamente em grupos de controle e modelo usando o método de tabela de números aleatórios, Dexametasona (Dex, Sigma-Aldrich St. Louis, MO, EUA) 5 mg/kg duas vezes por semana durante 6 semanas foi injetado intramuscularmente para induzir OP em ratos no grupo modelo [25]. Ratos no grupo de controle (n = 10) foram injetados com uma quantidade igual de solução salina. Nenhuma mudança significativa no peso corporal foi observada nos ratos em ambos os grupos em 6 semanas. Posteriormente, os ratos no grupo modelo foram subdivididos em grupo modelo, grupo ACT de baixa dose (Modelo mais ACT-L) e grupo ACT de alta dose (Modelo mais ACT-H). ACT (HPLC 98 por cento) foi obtido da Baoji Herbest Bio-tech., Ltd. (Baoji, China) e tratado com uma suspensão aquosa de solvente. Uma dose de 50 mg/kg/d e 100 mg/kg/d ACT foi administrada por via oral a ratos nos grupos de dose baixa e alta (8 ratos por grupo), respectivamente, e foi continuado por 8 semanas. Entre eles, o tamanho da amostra foi calculado com base em um estudo anterior [26]. Considerando um nível de significância bilateral de 0,05 [intervalo de confiança de 95 por cento (= 0,05)], poder de 80 por cento e um tamanho de efeito de 0,5, a análise de poder estimou um tamanho de amostra necessário de 6 animais por grupo assumindo um nível de efeito relevante de 30% de osteoporose. Além disso, com uma taxa de abandono de 20 por cento, 8 animais por grupo (total de 32 ratos) foram considerados ideais.

Amostras de soro de rato
Após 8 semanas, os ratos foram anestesiados com hidrato de cloral a 10 por cento (400 mg/kg, por via intraperitoneal, Solarbio, Beijing China), o sangue foi coletado da aorta abdominal, coagulado à temperatura ambiente e centrifugado a 3500 rpm/min por 10 min. O soro foi armazenado em tubos de centrífuga de 1,5 mL até o uso posterior.

Avaliação da densidade mineral óssea
A densidade mineral óssea (BMD) foi usada por um densitômetro ósseo de pequeno animal DAX (Ranzhe Instrument Equipment Co., Shanghai, China). Resumidamente, os ratos foram colocados na posição supina e os membros posteriores foram posicionados para fora. O fêmur direito dos ratos foi escaneado de acordo com as instruções do fabricante e os valores de DMO foram registrados [27].

Análise da morfologia óssea
Ao final do experimento, os ratos foram sacrificados por injeção intraperitoneal de excesso de hidrato de cloral e os fêmures foram fixados em etanol 70 por cento. Posteriormente, as varreduras foram realizadas em um sistema VivaCT 40μCT conforme descrito no estudo anterior e o volume ósseo/volume total (BV/TV), número trabecular ósseo (Tb.N), espessura trabecular óssea (Tb.Tn) e separação trabecular óssea (Tb.Sp) foram avaliados [28]. Para a eutanásia, os ratos SD foram anestesiados após a análise da morfologia óssea por injeção intraperitoneal de hidrato de cloral a 10 por cento (350 mg/kg).

Ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA)
Kits ELISA comerciais foram usados ​​para a detecção dos níveis de osteocalcina (OC, E-EL-R0243c, Elabscience) e telopeptídeo C-terminal (CTX, E-EL-R1405c, Elabscience) no soro de ratos. Resumidamente, os reagentes foram removidos a 18-25 graus para equilibrar e preparar a solução para lavagem e trabalho padrão. Placas de enzimas As placas foram preparadas com poços padrão, em branco e de amostra. Cerca de 100 μL de solução diluente de amostra foram adicionados aos poços, incubados por 90 min a 37 graus , e substituídos por um anticorpo biotinilado por 60 min a 37 graus . Após a lavagem, a solução de trabalho de ligação da enzima foi adicionada e incubada por 30 min. A solução de substrato (90 μL) foi adicionada e incubada por 15 min ao abrigo da luz. Quando o gradiente azul apareceu nos poços padrão, 50 μL da solução de terminação foram adicionados e a alteração no OD450 foi analisada.

PCR quantitativo em tempo real com transcrição reversa (RT-qPCR)
O reagente TRlzol LS foi adicionado ao soro de ratos e células MC3T3-E1 tratadas com ACT, e o RNA total foi extraído por incubação à temperatura ambiente seguida pela adição de clorofórmio. A concentração e a pureza do RNA foram confirmadas medindo a absorbância A260/280 em um espectrofotômetro Nanodrop ND-1000. O kit SuperScript II Reverse Transcriptase foi usado para a transcrição reversa de RNA para cDNA. Posteriormente, o cDNA foi aplicado como modelo, um primer foi adicionado e o kit SYBR-Green PCR master mix foi misturado e suplementado com ddH2O a 20 μL, e a reação de amplificação por PCR foi realizada usando o Applied biosystems AMI7500 Fast Real-time PCR (ABI, CA, EUA). O GAPDH foi usado como referência interna para normalização, e os níveis de expressão relativos foram calculados usando o método 2−ΔΔCt e realizados em triplicata. A sequência do primer para fator de transcrição relacionado a Runt 2 (Runx2), colágeno tipo I 1 (CoL1A1), ativador do receptor do ligante do fator nuclear κB (RANKL), osterix e osteoprotegerina (OPG) são apresentados na Tabela 1.

Análise de Western-blot
O lisado RIPA contendo 1 por cento de inibidor de protease foi adicionado às células e a proteína total de cada grupo foi coletada após a lise das células por agitação por 5 min a 4 graus. O kit de ensaio BCA foi empregado para quantificar a concentração de proteínas em cada grupo. Em seguida, as amostras de proteína foram misturadas com tampão de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 10% em igual volume e fervidas em banho-maria a 95 graus por 5 minutos para desnaturação da proteína. Um gel vertical de SDS-poliacrilamida a 12 por cento foi preparado e, após a solidificação do gel, 30 ug de proteína foram amostrados para separação por eletroforese em gel de 120 mA e 90 min. A proteína foi então transferida para a membrana de PVDF a 90 V por 120 min. Depois de selar com albumina de soro bovino a 5 por cento, a membrana de PVDF foi cortada com base no peso molecular do marcador e da banda de proteína alvo e incubada com o anticorpo primário correspondente durante a noite a 4 graus. Anticorpos policlonais de coelho contra p-AKT, p-mTOR e p-PI3K foram diluídos na proporção de 1:1000 (Proteintech, Wuhan, China). TBST foi lavado por 30 min e incubado com o correspondente anticorpo secundário marcado com peroxidase de rábano à temperatura ambiente por 1 h. O blot foi visualizado usando reagentes de quimioluminescência aprimorada. A densidade das bandas de proteína foi quantificada usando Image J. GAPDH foi empregado como um controle para calcular os níveis relativos de proteína.

Cultura celular e agrupamento
Pré-osteoblastos de camundongos MC3T3-E1 foram adquiridos da Chinese Tissue Culture Collections (CTCC, China) e cultivados em -MEM contendo 10% de soro fetal bovino e 100 U/mL de penicilina e 100 mg/mL de estreptomicina em um incubadora umidificada a 37 graus e 5% de CO2. Para a cultura de diferenciação óssea, o meio de indução osteogênica foi feito misturando 10 mM- -glicerofosfato e 50 mg/mL de ácido ascórbico (Sigma-Aldrich) com -MEM e adicionado às células MC3T3-E1 para induzir sua diferenciação. O meio foi trocado após 3 dias. Culturas por 14 dias foram usadas para viabilidade da fosfatase alcalina (ALP). Além disso, as células foram pré-tratadas com o inibidor de PI3K LY294002 (10 μM) por 30 min, seguido de tratamento com Dex e ACT.

Ensaio de viabilidade celular
O ensaio Cell Counting Kit-8 (CCK-8) foi realizado para avaliar a viabilidade de osteoblastos tratados com ACT. As células MC3T3-E1 foram inoculadas em placas de 96 poços a 5 × 103 células/poço. Uma quantidade de 1 μM de Dex foi considerada com base em estudos anteriores [29] e co-incubada com concentrações gradientes de ACT (10−8, 10−7, 10−6 e 10−5 M). O meio de cultura nas placas de 96-poços foi substituído após a adição de um meio de mistura e reagente CCK-8 na proporção de 10:1. Após incubação continuada por 1 h a 37 graus, a mudança no OD450 foi avaliada.

Detecção do número de apoptose osteoblástica
As células MC3T3-E1 submetidas a diferentes tratamentos foram digeridas com tripsina livre de EDTA e coletadas por centrifugação. Após a lavagem com um tampão de ligação 1 ×, 5 μL de Anexina V-FITC foram adicionados e incubados à temperatura ambiente por 5 min, suplementados com 5 μL de PI e passados ​​por uma rede de nylon 200-mesh. As amostras foram analisadas usando o sistema de citometria de fluxo FACScan.

ensaio de atividade ALP
As células MC3T3-E1 foram inoculadas em placas de 24-poços e ACT e Dex foram adicionados após o reboco. O meio de cultura celular foi substituído por um meio de diferenciação osteogênica para cultura. Depois de usar a lise de células por solução de lise celular (P0012J, Beyotime Biotechnology), o sobrenadante foi coletado por centrifugação e a curva padrão foi traçada. Um kit ALP (P0132S, Beyotime Biotechnology) foi usado para avaliar a atividade ALP e o OD450 foi calculado.

Análise estatística
Depois de realizar três experimentos independentes em triplicata, os dados foram analisados ​​usando o software GraphPad Prism 6.0 e expressos como média ± desvio padrão. ANOVA foi empregada para comparar as diferenças estatísticas entre vários grupos. P-valor < 0.05 foi considerado estatisticamente diferente.