Acteoside, um componente do Stachys Sieboldii MIQ, pode ser um agente antinefrítico promissor: efeito do acteoside na nefrite anti-GBM do tipo crescente em ratos

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Kazumi Hayashi, Tadashi Nagamatsu, Mikio Ito, Tomohisa Hattoria e Yoshio Suzuki

Departamento de Farmacologia, Faculdade de Farmácia, Universidade Meijo, 150 Yagotoyama, Tenpaku-Ku, Nagoya 468, Japão

ABSTRATO

Efeitos deacteósido(ACT) em anti-GBM do tipo crescentenefriteem ratos foram investigados. Quando os ratos foram tratados comActeosídeoa partir do 1º dia após injeção intravenosa de soro anti-GBM,Acteosídeoinibiu a elevação da excreção de proteínas na urina. NoActeosídeo-ratos tratados, os teores de colesterol e creatinina e a produção de anticorpos contra r-globulina de coelho nos plasmas foram menores do que os dos ratos controle nefríticos. A observação histológica demonstrou que esse agente suprimiu a hipercelularidade e a incidência de formação de crescentes, adesão da parede capilar à cápsula de Bowman e necrose fibrinóide nos glomérulos. Além disso, os depósitos de rat-IgG e C3 no GBM foram significativamente menores noActeosídeotratado do que no grupo controle nefrítico. Quando o tratamento foi iniciado a partir do 20º dia após a injeção intravenosa de soro anti-GBM, pelo qual a doença havia sido estabelecida,Acteosídeoresultou em um efeito semelhantenefríticoratos como indicado acima. Esses resultados sugerem que o Acteoside pode ser um medicamento útil contra a glomerulonefrite rapidamente progressiva, caracterizada por lesões glomerulares graves com crescentes difusos.

Palavras-chave: Anti-GBM do tipo crescentenefrite,Acteosídeo, Rato-IgG, Rato-C3

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Chyorogi Stachys sieboldii MIQ (Labiatae) é prescrito para muitas doenças, e este tubérculo é usado como alimento por chineses, russos e japoneses. Investigações recentes demonstraram que o chyrogi tem ação anti-anoxia(1), ação inibitória sobre a atividade da hialuronidase (2) e ação imunossupressora (3).

Por outro lado, foi mencionado que a resposta imune participa do desenvolvimento da nefrite. Para colocar de forma mais concreta, a lesão glomerular é mediada pela deposição de imunocomplexos nos glomérulos, seguida pela reação imuno-inflamatória, incluindo a ativação do complemento e a liberação de outros mediadores inflamatórios. Em estudos recentes, muita atenção tem sido dada à contribuição da resposta imune mediada por células no desenvolvimento de glomerulonefrite (4, 5). Além disso, Neild et al. (6) relataram que a supressão da função das células T pela ciclosporina A (CyA) bloqueou o desenvolvimento subsequente de lesões glomerulares na nefrite aguda da doença. Relatamos que a mizoribina (7), azatioprina (7), CyA (8), metilprednisolona (9) e alguns componentes vegetais (10) têm ação imunossupressora e mostraram um efeito salutar na nefrite anti-GBM. Embora esses agentes imunossupressores exerçam ação antinefrítica, é difícil utilizá-los em ensaios clínicos devido aos seus efeitos colaterais (11). Portanto, espera-se o desenvolvimento de um novo agente imunossupressor para o tratamento da nefrite na fase clínica.

O objetivo do presente estudo foi elucidar aefeito anti-nefrítico do acteosídeo, um componente do chyorogi, na nefrite anti-GBM do tipo crescente em ratos.

MATERIAIS E MÉTODOS

Animais

Ratos machos da estirpe Sprague-Dawley, pesando aprox. 160 g (Nihon SLC, Hamamatsu), foram usados ​​para todas as experiências. Esses animais foram alojados em sala climatizada a 23 ± 1 C durante o período experimental.

Drogas

A estrutura química do acteosídeo (ACT) (Tsumura Co., Ltd., Tóquio) é mostrada na Fig. 1. Este componente foi extraído da parte aérea do chyorogi (Stachys sieboldii MIQ). A pureza de ACT foi verificada por HPLC (Coluna: TSK gel ODS-80TM (4.0 id x 250 mm); Fase móvel: 20 por cento CH3CN/H2O, contendo 10 AcOH; Taxa de fluxo: 0,7 ml/min; Temp.: temperatura ambiente; Detecção: UV 254 nm) em Tsumura Co., Ltd. O ACT empregado nestas experiências tinha uma pureza superior a 9970. O ACT foi dissolvido em água destilada. Dipiridamol (Dip) (Boehringer Ingelheim, Alemanha) e azatioprina (Aza) (Sigma, St. Louis, MO, EUA) também foram usados; Essas drogas foram suspensas em goma arábica 1070.

Indução de nefrite anti-GBM do tipo crescente

A nefrite anti-GBM do tipo crescente foi induzida imunizando os ratos que receberam uma dose nefritogênica de soro de coelho anti-GBM (anti-GBM) com r-globulina de coelho (rG) de acordo com uma ligeira modificação do método relatado anteriormente ( 12). Neste experimento, os ratos pesavam aprox. 160 g foram administrados 0,6 ml/animal de soro anti-GBM na veia da cauda.

O efeito das drogas teste foi estimado administrando-as a partir do 1º dia após a injeção do soro anti-GBM (fase heteróloga) ou do 20º dia após a injeção do soro anti-GBM (fases autólogas). Nos experimentos, amostras de urina de 24-h foram coletadas e os ratos foram então divididos em 5 ou 6 grupos de 8 ratos, de modo que o teor médio de proteína na urina de 24-h em cada grupo estivesse em um nível semelhante.

Avaliação do efeito antinefrítico das drogas de teste

No experimento de tratamento medicamentoso da fase heteróloga, quatro grupos receberam oralmente 3, 10 ou 30 mg/kg/dia de ACT ou 100 mg/kg/dia de Dip, respectivamente, em um volume de 1 ml por 100 g do peso corporal, diariamente a partir do 1º dia ou no dia após a injeção intravenosa de soro anti-GBM até o 40º dia. Nos experimentos de tratamento medicamentoso da fase autóloga, três ou quatro grupos receberam oralmente 3, 10 ou 30 mg/kg/dia de ACT (A) ou 30 mg/kg/dia de ACT, 100 mg/kg/dia de Dip ou 50 mg/kg/dia de Aza (B), respectivamente, em um volume de 1 ml por 100 g de peso corporal, diariamente a partir do 20º dia após injeção iv de soro anti-GBM até o 40º (A) ou o 45º (Aniversário. O grupo restante recebeu oralmente o veículo (água destilada) em vez de drogas de teste e serviu como controle nefrítico. Além disso, um grupo não tratado (normal) foi usado para comparação com os grupos nefríticos.

Coleta de urina e sangue

As {{0}}h amostras de urina foram obtidas mantendo cada animal em uma gaiola metabólica individual por 24 horas. No início da coleta de urina, cada animal recebeu 8 ml de água destilada por via oral sem alimentação. A urina foi então centrifugada a 3,000 rpm por 15 min a 41C e o sobrenadante foi usado para a determinação de proteína. No último dia do experimento, 2.0 ml de sangue foram retirados da veia renal de cada rato anestesiado com uma seringa descartável e colocados em um tubo contendo 0,125 ml de heparina. O sangue foi centrifugado a 5,{12}} rpm para obtenção de plasma para determinação de alguns parâmetros.

Determinações dos teores de proteína urinária e colesterol plasmático e creatinina

A excreção urinária de proteínas foi determinada pelo método de Kingsbury et al. (13) e expresso em mg/urina 24h. O teor de colesterol foi determinado com um kit de ensaio comercial (Determine TC-5; Kyouwa Medix Co., Ltd, Tóquio) (14) e expresso como mg/dl de plasma. O teor de creatinina foi determinado usando um kit de determinação de creatinina (CRE-EN; Kainos, Inc., Tóquio) e expresso em mg/dl plasma/100 g de peso corporal.

Medição do título de anticorpos plasmáticos contra -G

O título de anticorpos plasmáticos contra rG foi determinado por hemaglutinação indireta usando hemácias de carneiro sensibilizadas (15).

Medição do nível de complemento plasmático de CH50

O nível de complemento plasmático de CH50 foi determinado pelo método de Mayer (16).

Avaliação dos parâmetros histopatológicos

Para o estudo microscópico de luz, os rins foram isolados de ratos anestesiados com pentobarbital, depois desidratados e fixados imergindo os tecidos passo a passo em várias tradições de álcool etílico de baixa a alta. Os tecidos foram então incluídos em parafina e seccionados em fatias de 2 a 3 cm de espessura. Nos estudos de nefrite anti-GBM do tipo crescente, os cortes foram corados com hematoxilina e eosina e tricrômio de Masson. O número de núcleos (hipercelularidade), formação de crescentes, adesão da cápsula de Bowman à parede capilar (adesão) e necrose fibrinóide nos glomérulos foram observados ao microscópio de luz. Para avaliar esses parâmetros, foi selecionado um corte equatorial por meio de métodos de amostragem aleatória. Cinquenta glomérulos/cortes transversais foram observados, e a taxa de aparecimento de crescentes, adesão e necrose fibrinóide foi expressa como as porcentagens de glomérulos (incidência) com essas alterações morfológicas conforme descrito anteriormente (17). A avaliação foi realizada por uma pessoa diferente que não conhecia a identidade de cada amostra. Para avaliar a hipercelularidade, um corte transversal equatorial foi selecionado por um método de amostragem aleatória. O número de núcleos (incluindo núcleos de células glomerulares e leucócitos exsudativos) foi contado e expresso como o número médio por seção transversal glomerular em 10 glomérulos/seção.

Imuno-histoquímica

Em tecidos para coloração imunoenzimática de IgG de rato, as seções de parafina foram cortadas conforme descrito acima e as seções foram tratadas com 0,1 por cento de protease em 0.05 M Tris- Tampão HCl por 7 min e depois lavado em 0,01 M de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4. As seções foram então incubadas com anticorpo monoclonal de camundongo IgG anti-rato (mAb) (Cappel, West Clester, PA, EUA) a uma diluição de 1:100 por 90 min. As seções foram lavadas novamente com PBS, tratadas com peróxido de hidrogênio a 0,3 por cento em metanol por 20 min para bloquear a peroxidase endógena e incubadas com IgG anti-camundongo purificada por afinidade biotinilada e peroxidase de rábano avidinado com tetracloridrato de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) (Vecta mancha ABC Kit; Instituição de vetores, Burlingame, CA, EUA). Todas as etapas foram realizadas em temperatura ambiente.

Os tecidos para coloração imunoenzimática do antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA), que é um marcador de proliferação celular, foram fixados em formalina a 10% em PBS, e os tecidos embebidos em parafina foram corados pelo mesmo procedimento que para IgG de rato, exceto para o uso de um mAb (19A2; Coulter Immunology, Hialeah, FL, EUA) ao PCNA.

Quantificação de IgG de rato, C3 e PCNA em seções de tecido

A área total de IgG de rato imunorreativa e C3 no glomérulo foi medida em 30 glomérulos por seção usando um analisador de imagem (Toyobo Image analyzer V1; Toyobo Co., Ltd., Tokyo) e apresentada como mm2/seção glomerular (GCS ). As células positivas para PCNA no glomérulo foram contadas com o analisador de imagem e os resultados foram expressos como o número de células/GCS

análise estatística

Os dados representam a média ± DP, e os resultados foram avaliados estatisticamente por ANOVA. Quando esses resultados foram paramétricos, foram avaliados estatisticamente pelo teste de Duncan. Quando os resultados não foram paramétricos, foram avaliados estatisticamente pelo teste de Kruskal-Wallis. A porcentagem inibitória foi calculada da seguinte forma:

Porcentagem inibitória ( por cento )=(Controle -Teste medicamento) x 100 / (Controle -Normal)

RESULTADOS

Efeito do Acteoside na nefrite anti-GBM do tipo crescente

Excreção de proteína urinária (Figs. 2 e 3): Quando o tratamento com ACT foi iniciado a partir do dia seguinte à injeção de soro anti-GBM (fase heteróloga), a primeira supressão significativa da proteína urinária foi observada no 5º dia com 30 mg /kg, po; no 20º dia a 3 e 10 mg/kg, po; e no 40º dia com Dip a 100 mg/kg, po

Quando o ACT foi administrado a partir do 20º dia após a injeção de soro antiGBM (fase autóloga), o ACT a 10 e 30 mg/dia inibiu a elevação da excreção de proteína na urina no 30º dia. Por outro lado, Aza a 50 mg/kg foi mais fraco que ACT a 30 mg/kg, embora não significativamente, e Dip não teve efeito.

Teores plasmáticos de colesterol e creatinina (Tabela 1): Os teores plasmáticos de colesterol e creatinina foram determinados no 40º ou 45º dia. Os teores de colesterol no plasma nos ratos de controlo nefríticos foram marcadamente elevados. Em contraste, a elevação do teor de colesterol foi reduzida com ACT (30 mg/kg) da fase heteróloga em 60 por cento do nível de controle e com ACT (30 mg/kg) da fase autóloga em 62'o do controle nível. O conteúdo de creatinina plasmática nos ratos nefríticos também estava elevado. Por outro lado, no ACT (30 mg/kg) de ambos os ratos tratados com fase, o conteúdo de creatinina plasmática foi semelhante ao dos ratos normais.

Título de anticorpo plasmático contra rG: Ratos nefríticos mostraram produção de anticorpos marcadamente acelerada. A produção acelerada de anticorpos foi suprimida em 72 por cento do nível de controle pelo tratamento com ACT (10 e 30 mg/kg) da fase heteróloga (Tabela 2), ACT (30 mg/kg) da fase autóloga e Aza para 70 e 51 por cento do nível de controle, respectivamente (dados não mostrados), e não foi afetado por Dip.

Observação histológica (Tabela 3, Figs. 4 e 5): O exame microscópico de luz dos glomérulos nefríticos revelou lesões caracterizadas por formação de crescentes graves, adesão, necrose fibrinóide e proliferação de células mesangiais. A observação histológica demonstrou que o ACT (da fase heteróloga e autóloga) inibiu a hipercelularidade e a incidência de formação de crescente, adesão e necrose fibrinóide nos glomérulos por volta do 40º ou 45º dia. As lesões de ratos nefríticos tratados com Dip e Aza também foram menores do que as dos ratos nefríticos de controle. No entanto, quando ratos nefríticos foram tratados com Dip da fase autóloga, as alterações histológicas foram pouco afetadas pelo Dip (dados não mostrados).

A proliferação de células glomerulares, ou seja, o aumento de células PCNA-positivas nos glomérulos, foi observada emratos nefríticos. Em contraste, no 30º dia, uma redução de 52%ção na proliferação celular foi observada, e isso foi associado wcom uma redução significativa nas células glomerulareslunalidade em relação ao controle (Tabela 3).

Deposição de reagente imune (Tabela 2 e Fig. 6): Foi possível observar depósitos de IgG e C3 de rato no GBM nos ratos nefríticos controle; no entanto, eles não foram encontrados em ratos normais. ACT (30 mg/kg) da fase heteróloga reduziu a deposição de IgG de rato no GBM em 72 por cento do nível de controle. Além disso, o ACT (3, 10 e 30 mg/kg) da fase heteróloga reduziu a deposição de C3 de rato no GBM em 60 a 69 por cento no 40º dia. Mesmo quando o ACT foi administrado a partir da fase autóloga, a inibição da deposição de IgG de rato e C3 foi semelhante aos resultados acima. O mergulho não afetou a deposição de IgG de rato e C3. Aza, no entanto, reduziu a deposição de IgG de rato e C3 no GBM em 67 e 68 por cento, respectivamente (dados não mostrados).

Efeito do ACT na atividade do complemento e nos depósitos de C3 no GBM na nefrite anti-GBM do tipo original (Fig. 7)

A nefrite anti-GBM do tipo original foi induzida em ratos por injeção de 0,6 ml de soro anti-GBM nas veias da cauda, ​​conforme descrito anteriormente (18). Ratos nefríticos foram pré-tratados e pós-tratados com ACT a 30 mg/kg, po e fator de veneno de cobra (CVF) (Sigma) a 10 figos/rato, ip, três vezes, a cada 8 horas. Os tratamentos ACT e CVF reduziram a excreção urinária de proteínas com uma porcentagem inibitória de aprox. 35 graus e 71 por cento, respectivamente. O CH50 em ratos controle nefríticos foi marcadamente menor do que nos ratos normais 24 horas após a indução da nefrite. O ACT inibiu a diminuição de CH50 e aumentou a deposição de C3 no GBM em ratos controle nefríticos. CVF aboliu a deposição de CH50 e C3. Além disso, no experimento in vitro, o ACT inibiu a ativação do complemento em 37%. Quando o ACT foi administrado a ratos normais, o ACT reduziu a ativação do complemento no experimento ex vivo (dados não mostrados).

DISCUSSÃO

A glomerulonefrite rapidamente progressiva e as doenças renais na síndrome de Goodpasture são doenças malignas que recaem em insuficiência renal 2 ou 3 meses após o desenvolvimento da doença (19). As características dessa nefrite envolviam hipercelularidade, infiltração acentuada de neutrófilos e monócitos e formação de crescentes nos glomérulos. A terapia de coquetel com agentes imunossupressores, antiplaquetários e esteróides tem sido aplicada principalmente nesta doença. Por outro lado, embora a CyA seja um imunossupressor superior que exerce um efeito benéfico na nefrite experimental (6, 8), foi relatado que a CyA causa disfunção renal e causa alteração histológica irreversível nos glomérulos (11). A metilprednisolona possui muitos efeitos colaterais. Além disso, o fenômeno de rebote e a síndrome de abstinência após um longo tratamento com este medicamento são dois dos problemas. Portanto, um novo agente imunossupressor para o tratamento da nefrite que tenha menos efeitos colaterais deve ser desenvolvido.

A nefrite anti-GBM do tipo crescente é um modelo experimental que apresenta alterações histológicas e patológicas semelhantes às da glomerulonefrite rapidamente progressiva e da doença renal da síndrome de Goodpasture (20). O desenvolvimento e progressão desta nefrite consistem em 2 fases que são mediadas por respostas imunes. A reação precoce, a chamada fase heteróloga, deve-se à deposição do anticorpo anti-GBM, seguida pelo acúmulo de granulócitos polimorfonucleares dependente do complemento (21, 22). A fase tardia (fase autóloga) desenvolve-se pela ligação de anticorpos autólogos depositados ao longo do GBM e o influxo de monócitos/macrófagos para os glomérulos após esta reação (22, 23). Essa nefrite é caracterizada por proteína urinária bifásica e hipercelularidade que envolve a formação de crescente e necrose fibrinóide. Acredita-se que a formação do crescente seja mediada por macrófagos migrados e células epiteliais proliferadas (22, 24).

Relatamos anteriormente que mizoribina e Aza, um agente imunossupressor (7), inibiram a elevação de anticorpos plasmáticos contra IgG de coelho e Pachyman, o principal componente de Poria cocos (18), diminuíram o grau de deposição de C3 no GBM, e ambos foram marcadamente eficaz contra a nefrite anti-GBM.

Os tratamentos com ACT suprimiram o desenvolvimento de glomerulonefrite anti-GBM conforme avaliado pela redução da proteinúria e do colesterol plasmático, prevenção do comprometimento da função renal e prevenção de alterações histológicas progressivas, incluindo o desenvolvimento de crescentes glomerulares e hipercelularidade. No 40º dia, ACT a 30 mg/kg sozinho reduziu significativamente a quantidade de deposição de IgG de rato no GBM mediada pela supressão da produção de anticorpos neste modelo nefrítico. Por outro lado, a quantidade de depósitos C3 no GBM foi diminuída pelo ACT em 3, 10 ou 30 mg/kg. Além disso, o ACT inibiu significativamente a ativação do complemento em experimentos in vitro e ex vivo. A redução de CH50 em ratos controle nefríticos foi inibida por ACT. Os dados acima sugerem que o ACT inibe a lesão renal suprimindo a ativação do complemento, porque o complexo de ataque à membrana do complemento (MAC) está envolvido na patogênese da lesão glomerular (25), e o MAC sublítico tem potenciais mediadores inflamatórios que podem estar associados a dano glomerular, proliferação de células mesangiais e difusões de matriz extracelular, como espécies reativas de oxigênio (26), protease (27), prostaglandinas (28) e interleucinas -1 como citocinas (29), bem como colágeno (30).

Acredita-se que a ativação do complemento esteja intimamente relacionada à infiltração de leucócitos. Em estudos recentes, foi relatado que C5a provocou adesão de monócitos e neutrófilos a células mesangiais e células endoteliais, respectivamente (31, 32). Portanto, em outro estudo, vamos investigar o efeito do ACT no acúmulo de leucócitos nos glomérulos.

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