3.3. Estudos in vitro

3.3.1. Avaliação da citotoxicidade em queratinócitos humanos

De acordo com estudos relevantes,cistancheé uma erva comum conhecida como "a erva milagrosa que prolonga a vida". Seu componente principal écistanósido, que tem vários efeitos, comoantioxidante, anti-inflamatório,epromoção da função imunológica. O mecanismo entre cistanche eClareamento da pelereside no efeito antioxidante deglicosídeos cistanche. A melanina na pele humana é produzida pela oxidação da tirosina catalisada portirosinase, e a reação de oxidação requer a participação de oxigênio, de modo que os radicais livres de oxigênio no corpo se tornam um fator importante que afeta a produção de melanina. Cistanche contém cistanósido, que é um antioxidante e pode reduzir a geração de radicais livres no corpo, assiminibindo a produção de melanina.

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O ensaio MTT foi usado para testar se PPEE, PPEE-SLNs e KDPAG poderiam afetar a viabilidade celular usando queratinócitos humanos. Diferentes concentrações de PPEE, PPEE-SLNs, extrato-livre-SLNs e KDPAG em 0.{{10}}625– 1mg/mL foram incubados durante 24 h com uma linha celular de queratinócitos humanos (Figura 2). Ao longo de 24 h, não foi observada redução significativa na viabilidade celular de queratinócitos humanos na faixa de concentração de 0.0625–0,5 mg/mL (p < 0,05). No entanto, após o tratamento com 1 mg/mL de PPEE, PPEE-SLNS, Extract-free-SLNs e KDPAG durante 24 h, observou-se uma redução significativa na viabilidade celular de queratinócitos humanos, 93 por cento, 90 por cento, 95 por cento e 89% das células sobreviveram, respectivamente. Assim, concentrações de PPEE, PPEE-SLNs e KDPAG iguais ou inferiores a 0,5 mg/mL foram utilizadas para estudos posteriores.

A atividade antioxidante foi avaliada pelos sistemas DPPH, ABTS e pelo teste de branqueamento do -caroteno. Em todas as amostras testadas, foi encontrada uma forma dependente da concentração. No ensaio DPPH, KDPAG mostrou a maior atividade de eliminação, seguido por PPEE-SLNs e depois PPEE. Os valores de IC50 foram 6,35 ± 3,4{{30}} µg/mL, 8,79 ± 2,70 µg/mL e 10,5 ± 1,81 µg/mL, respectivamente, em comparação com a vitamina C utilizado como padrão com IC50 de 2 ± 0,01 µg/mL. Essa tendência também foi observada contra os radicais ABTS com valor de 3,91 ± 1,43 µg/mL, 4,29 ± 1,12 µg/mL e 6,10 ± 0,62 µg/mL, respectivamente, em comparação com o padrão Vit. C com IC50 de 0,96 ± 0,02 µg/mL confirmando os resultados do ensaio DPPH. Tal atividade sequestradora de extratos de folhas de PP e suas frações já foi apontada para ambos os ensaios, porém com valores superiores aos obtidos [14,49]. Esses achados sugerem que a atividade dos antioxidantes é afetada pelas condições ambientais, partes da planta, estágio de maturidade, método de colheita e solventes usados ​​para extração. Esses resultados são consistentes com a literatura, pois o extrato de folha de PP mostrou ter uma capacidade antioxidante melhor do que a semente, casca, polpa e extratos de frutas em ambos os ensaios [14,20,50]. Além disso, o alto teor de flavonoides relatado nas folhas de PP, em particular os flavonóis, foi considerado responsável pela atividade antioxidante [20].

PPEE, PPEE-SLNs e KDPAG mostraram atividade anti-elastase, anti-colagenase e anti-tirosinase com alta porcentagem de inibição a 300 µg/mL e valores de IC50 relativamente baixos (Tabela 3) em comparação com seus respectivos controles positivos.

3.4. Avaliação de PPEE-SLNs e creme PPEE-SLNs

As formulações de PPEE-SLNs preparadas apresentaram tamanhos de partícula de 170 nm a 176 nm; isso indica que a adição de surfactante a sistemas de nanopartículas lipídicas sólidas faz com que o filme interfacial se condense e se estabilize. As formulações mostram baixos valores de índice de polidispersão (0.23{{10}}–0,450) indicando homogeneidade da distribuição do tamanho de partícula com ZP entre −21,8 e −22,0 garantindo produtos de alta estabilidade (Figura 3a, b). Os 70-77 por cento registrados de eficácia de encapsulamento de PPEE-SLNs são devidos ao tipo de lipídio (monoestearato de glicerol) que é capaz de fechar os poros da superfície nos grânulos. As micrografias TEM & SEM revelaram a formação de nanopartículas de distribuição de tamanho de partícula estreita, nanovesículas lisas, esféricas e homogêneas (Figura 3c,d). Em FTIR, o PPEE exibe picos característicos em 3352 cm-1 correspondendo ao alongamento NH da amina secundária aromática, 2974,23 cm-1 correspondendo ao alongamento CH aromático, 1735,93 cm-1 correspondendo ao alongamento C=O e 1257,59 cm- 1 correspondendo ao alongamento da amina alifática CN conforme mostrado na (Figura 4). Os espectros FTIR de PPEE e mistura física lipídica exibem os mesmos picos característicos devido à amina secundária aromática NH se estendendo a 3348,42 cm-1, C=O se estendendo a 1735,93 cm-1 e CN amina alifática se estendendo a 1257,59 cm −1. Assim, fica evidente que todos os picos característicos que estavam presentes nos espectros de PPEE replicaram quase na mesma região nos espectros da mistura física PPEE-SLNs indicando que não há interação significativa entre as drogas e os lipídeos. Os cremes PPEE-SLNs (2 por cento e 5 por cento ) eram amarelados com aparência lisa, superfície lisa e um pH adequado variando de 5–5,8 ± 0,15, o que confirma a compatibilidade das formulações com secreções cutâneas, não irritante para a pele humana, não presença de vermelhidão ou edema, facilmente lavável com água e boa espalhabilidade variando de 10–13 g cm/s, com viscosidade na faixa de 500 ± 6,24 a 600 ± 7,52 CPS a 10 rpm, sem evidência de separação de fases e boa consistência durante o período de estudo. A quantidade total de bactérias e fungos foi inferior a 100 UFC/mL e na faixa de aceitação para produtos de cuidados com a pele. O creme a 2 por cento mostrou uma liberação inicial de explosão de PPEE-SLNs de cerca de 15,21 ± 1,44 por cento durante a primeira 1 h; em seguida, os PPEE-SLNs aprisionados no creme foram liberados gradativamente; 60,32 ± 2,54 por cento foram liberados após 12 e 62 ± 1,44 por cento quase após 24 h, respectivamente. Por outro lado, o creme de 5 por cento mostrou uma liberação inicial de explosão de PPEE-SLNs de cerca de 20,21 ± 2,70 por cento durante a primeira 1 h; em seguida, os PPEE-SLNs aprisionados no creme foram liberados gradualmente, 77,12 ± 2,88 por cento foram liberados após 12 e 80 ± 2,91 por cento quase após 24 h, respectivamente. Ambas as fórmulas de creme mostraram liberação prolongada de PPEE ao longo de 24 h (Figura 5). Além disso, nosso estudo de pesquisa apresentou que as formulações de creme (2 por cento e 5 por cento) são estáveis ​​por dois meses.

3.5. Estudos in vivo

Após vinte dias de tratamento com o creme, foram avaliados os escores anti-rugas. O efeito antirrugas do creme PPEE-SLNs foi dose-dependente, e o efeito observado no grupo creme PPEE-SLNs 5 por cento (G5) foi comparável ao resultado no grupo controle positivo (G3), que foi tratado com um produto de mercado (Figura 6) e mostrou pontuações anti-rugas significativamente melhores em comparação com o creme anti-rugas padrão. As fotografias são apresentadas na Figura 7. Os grupos (G3–G5) apresentaram superfícies de pele muito lisas e melhoradas. Não houve alterações cutâneas nos animais do G1. Já o G2 apresentou rugas espessas e profundas.

As fibras elásticas foram significativamente diminuídas pela irradiação UV em comparação com as do grupo normal. As imagens da pele de camundongos não tratados e tratados foram observadas ao microscópio (Figura 8). O G1 apresentou espessura normal da pele tanto da derme quanto da epiderme e continha fibroblastos, além de espessura normal das fibras elásticas sem fragmentação. Em comparação com G1, a pele dos camundongos irradiados com UV (G2) mostrou um aumento significativo no espessamento da epiderme e da derme, bem como uma diminuição na formação de fibroblastos e fibras elásticas pela irradiação UV. A aplicação tópica de 5 por cento (G5) e 2 por cento (G4) de creme PPEE SLNs foi comparável à do G3 que recebeu o produto comercial. Todos os G4 e G5 diminuíram significativamente a espessura da derme e epiderme e aumentaram o conteúdo de fibroblastos, pois seu número determina o conteúdo de fibras de colágeno, ajudando assim a reparar a pele danificada e reduzindo o efeito do envelhecimento na pele (Figura 9a,b) . Além disso, ambos os grupos mostraram efeitos preventivos contra a degradação das fibras elásticas pela irradiação UV, então podemos concluir que o tratamento com qualquer dose de creme PPEE-SLNs mostrou um efeito protetor contra a irradiação UV.

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