Um ensaio não randomizado que investiga o impacto do consumo de arroz integral na microbiota intestinal, na atenção e na memória de trabalho de curto prazo em crianças tailandesas em idade escolar, parte 2

2.4. Análise Quantitativa da Microbiota Fecal

Amostras fecais foram coletadas de crianças no início do estudo, nas semanas 4, 15, 56 e 61 e na semana 71, em recipientes esterilizados e foram imediatamente congeladas a -80 ◦C. A extração de DNA microbiano e a medição quantitativa da abundância absoluta da microbiota fecal foram realizadas conforme descrito anteriormente [29].

A relação entre medidas quantitativas e memória é um tema digno de estudo. Para muitos problemas na vida, os problemas de memória são muitas vezes os que incomodam as pessoas, como a incapacidade de lembrar coisas importantes, esquecer horários de compromissos, etc. Neste momento, os métodos de medição quantitativa podem nos ajudar a compreender a situação da memória e a fazer melhorias direcionadas. .

Os métodos de medição quantitativa podem quantificar a memória das pessoas através de meios científicos. Com base nisso, são propostos alguns métodos específicos e eficazes para treinar a memória. Na vida diária, também podemos usar métodos simples para treinar a memória, como memorizar palavras, poesia, etc. Todas essas são formas eficazes de desenvolver uma boa memória.

Ao mesmo tempo, também podemos melhorar a memória em todos os aspectos da vida. Por exemplo, se quisermos lembrar uma nova palavra do vocabulário, podemos lê-la várias vezes, escrevê-la várias vezes ou associá-la ao seu significado, para que a memória seja mais profunda.

Na era da explosão da informação, muitas vezes nos sentimos sobrecarregados pela informação. Muitas vezes precisamos lembrar de muitas coisas, mas não sabemos como lidar com essas informações. Neste momento, podemos usar métodos de medição quantitativos para determinar o estado da nossa memória e, em seguida, treinar e melhorar com base em situações específicas. Através de métodos de memória razoáveis, podemos efetivamente melhorar nossa memória e proporcionar mais comodidade para nossas vidas e trabalho.

Em suma, a relação entre medição quantitativa e memória é inseparável. Precisamos usar métodos científicos para descobrir nossas condições de memória e, então, realizar um treinamento eficaz com base em situações específicas. Acredito que enquanto treinarmos incansavelmente conseguiremos fortalecer a nossa memória e melhorar a nossa qualidade de vida. Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e a Cistanche deserticola pode melhorar significativamente a memória, pois a Cistanche deserticola também pode regular o equilíbrio dos neurotransmissores, como aumentar os níveis de acetilcolina e fatores de crescimento. Estas substâncias são muito importantes para a memória e a aprendizagem. Além disso, a carne também pode melhorar o fluxo sanguíneo e promover o fornecimento de oxigênio, o que pode garantir que o cérebro receba nutrientes e energia suficientes, melhorando assim a vitalidade e a resistência do cérebro.

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Resumidamente, o DNA genômico microbiano foi extraído de amostras fecais usando o kit innuPREP Stool DNA (Analytik Jena Biometra, Jena, Alemanha), e a concentração e pureza do DNA foram determinadas usando a placa Take 3Micro-Volume (Biotek, Winooski, VT, EUA).

A abundância absoluta de genes de rRNA da microbiota16s foi então quantificada através de qPCR usando Real-Time Thermal Cyclers CFX96 TouchTM (Bio-Rad, Singapura) com base nos primers específicos mostrados na Tabela S1.

As condições qPCR e as estimativas do número de cópias da microbiota foram realizadas seguindo o protocolo anterior [37]. O Log10 do número de cópias de 16S rRNA por grama de fezes úmidas é apresentado em nossos Dados Suplementares.

2.5. Análise Estatística

A distribuição dos dados foi examinada por meio do teste de Shapiro-Wilk e do teste de Levene (pacote de estatísticas versão 4.0.3). O pacote R ggplot2 foi usado para visualização de dados [38]. A correção do valor p de Benjamin-Hochberg (BH) foi aplicada para correção de testes múltiplos (valor q). A significância foi determinada em q <{8}}.05. Todas as análises estatísticas foram realizadas no software R versão 4.0.3 [39].

As diferenças nas abundâncias absolutas médias da microbiota intestinal entre os grupos de intervenção para cada ponto de tempo foram determinadas pelo teste t ou teste da soma de postos de Wilcoxon de acordo com a normalidade da distribuição dos dados.

As alterações na microbiota intestinal entre os momentos de cada fase (dentro dos indivíduos) foram avaliadas usando testes t pareados ou testes de classificação sinalizada de Wilcoxon após resultados significativos da ANOVA de medidas repetidas unidirecionais ou do teste de Friedman (p <{2}},05 ). As alterações nas abundâncias absolutas da microbiota intestinal entre as semanas foram expressas como alterações de dobra transformadas em log2 (Log2FCs).

As relações entre a abundância absoluta da microbiota intestinal e a idade das crianças em idade escolar foram determinadas usando o coeficiente de correlação de Pearson ou Spearman.

A associação entre a microbiota intestinal e a intervenção em cada momento, ajustando para variáveis ​​demográficas (idade, sexo, escore z do IMC, tipo de parto, registro de nascimento e etnia), foi avaliada por meio de análise de variância multivariada permutacional (PERMANOVA) usando a função Adonis . Para investigar o efeito da intervenção ao longo das semanas de cada fase, a PERMANOVA foi conduzida utilizando participantes como estratos e ajustando para covariáveis. A condição de homogeneidade baseada na distância euclidiana foi medida utilizando a função betadine.

A permutação foi realizada em 999 no pacote R vegan(2.6-2) [40]. Determinamos ainda o impacto da intervenção na microbiota intestinal usando análise de redundância (RDA) enquanto ajustamos para covariáveis.

Os tratamentos foram utilizados como variáveis ​​explicativas restritas, e as abundâncias absolutas da microbiota intestinal foram utilizadas como variáveis ​​de resposta. A significância das restrições foi avaliada usando um teste de permutação do tipo ANOVA (permutação=999). Uma seleção stepwise das variáveis ​​explicativas foi realizada utilizando a função step baseada nos critérios AIC.

Os resultados cognitivos entre os grupos de intervenção para cada semana foram comparados usando o teste t de duas amostras de Welch ou o teste de soma de postos de Wilcoxon. Uma diferença no desempenho cognitivo ao longo das semanas de cada fase (dentro dos indivíduos) foi determinada usando o teste de classificação sinalizada de Wilcoxon após resultados significativos do teste de Friedman (p < 0,05).

Usamos a RDA para determinar o efeito da intervenção no desempenho cognitivo de crianças em idade escolar, ajustando para idade e sexo. O efeito dos pontos temporais na abundância da microbiota intestinal também foi avaliado através da RDA utilizando os participantes como estratos.

A condição RDA prosseguiu conforme descrito acima. Para determinar a relação entre desempenho cognitivo e microbiota intestinal, utilizamos o coeficiente de correlação de Spearman.

A análise de fatores múltiplos (AMF) foi realizada para explorar as variações na microbiota intestinal que poderiam ser explicadas pelas variáveis ​​de intervenção e do hospedeiro (idade e sexo) usando o FactoMine R versão 2.4 [41] e visualizando com o Factoextra versão 1.0. 7 [42].

3. Resultados

3.1. Características das crianças em idade escolar

Após controle de qualidade dos dados (Figura 1), analisamos as 85 e 57 crianças restantes nas Fases I e II, respectivamente. As crianças no início do estudo tinham em média 7,02 e 10,52 anos de idade para os grupos WR e SLR, respectivamente.

As características basais dos grupos controle e intervenção foram significativamente diferentes para idade (p < {{0}}.0001), peso (p < 0,0001), altura (p < 0,0001), IMC z- pontuação (p=0,03) e tipo de alimentação (p=0,02) (Tabela S2).
Um padrão semelhante também foi observado ao longo dos momentos do estudo, exceto para o IMC, que não foi significativamente diferente entre os grupos na semana 71 (Tabelas S3 a S7).

3.2. Efeito da intervenção do arroz Sinlek na microbiota intestinal de crianças em idade escolar

Considerando cada um dos momentos, não houve diferenças significativas na abundância absoluta da microbiota intestinal entre os grupos controle (WR) e intervenção Sinlek (SLR) na primeira fase da intervenção (Fase I; linha de base, Semana 4 e Semana 15 ).

Comparações multivariadas usando PERMANOVA (por margem) também mostraram que a intervenção na Fase I não teve efeito significativo nas alterações na microbiota intestinal após ajuste para variáveis ​​demográficas (Arquivo Suplementar S1).

Determinamos ainda uma associação entre a abundância da microbiota intestinal e a idade e descobrimos que o Lactobacillus estava negativamente correlacionado com a idade no início do estudo (correlação de Pearson; R {{0}} −0.24, p {{ 3}}.026) e Semana 4 (correlação de Pearson; R=−0,3, p=0,002) (Figura 2b,d). Para a segunda fase de intervenção (Fase II), as mudanças nas abundâncias microbianas, no entanto, foram marcadas nas semanas 61 e 71. As abundâncias de bactérias totais (q=0.032) e Firmicutes (q=0.032 ) aumentaram significativamente, enquanto o nível de proteínas gama (q <0,0001) diminuiu significativamente após a intervenção SLR na semana 61 (Figura 2e-g).

Essas bactérias também foram significativamente associadas à idade, onde a abundância de bactérias totais (correlação de Pearson; R {{0}} −0.32, p=0.0 15) e Firmicutes (correlação de Pearson; R=−0,32, p=0 0,014, Figura 2h) diminuíram com o aumento da idade, enquanto a abundância absoluta de proteínas gama foi positivamente correlacionada com a idade (correlação de Pearson; R { {11}},62, p < 0,0001, Figura 2i).

Na semana 71, o nível de Bacteroidetes foi significativamente reduzido no grupo SLR (q < 0.0001) (Figura 2j), e sua abundância foi positivamente correlacionada com a idade (correlação de classificação de Spearman; R { {4}},57, p < 0,0001, Figura 2l).

Considerando as mudanças na abundância da microbiota intestinal ao longo das semanas (dentro dos indivíduos) dos grupos de controle e intervenção, observamos padrões semelhantes nos dois grupos de participantes. As gamaproteobactérias pareceram flutuar altamente após a intervenção: sua abundância diminuiu significativamente na Semana 4 e na Semana 61 (Figuras 3a, b, S1c e S2c, Arquivo Suplementar S2).

Os níveis destas bactérias pareceram recuperar, no entanto, no final de cada fase (Semana 15 e Semana 71). Além disso, a abundância de Bacteroidetes para o grupo SLR foi menor na semana 71 em comparação às semanas 56 e 61 (Figuras 3a e S2e). Uma diminuição gradual nas abundâncias de dois táxons microbianos, nomeadamente, Ruminococcus e Bacteroides, também foi observada durante a Fase II, com as suas abundâncias sendo as mais baixas no ponto final do ensaio (Semana 71) (Figuras 3b e S2f, g), independentemente da intervenção.

Além disso, avaliamos se havia diferenças na abundância da microbiota intestinal entre os tratamentos e ao longo das semanas usando os participantes como estratos. A PERMANOVA indicou que a presença do tratamento e/ou o momento do ensaio (semana) durante ambas as fases teve efeitos marginais significativos no abundância de microbiota intestinal (p <{0}},05).

As dispersões (variâncias) entre grupos e um modelo que leva em conta variáveis ​​demográficas com significância estatística estão resumidos no Arquivo Suplementar S3. Exploramos ainda mais a força de associação e variação da microbiota intestinal explicada pela intervenção usando RDA. Diferenças significativas foram encontradas apenas na Fase II.

A abundância de proteínas gama foi mais enriquecida no grupo controle (WR) do que no grupo SLR, enquanto bactérias totais mais altas, Firmicutes e Bacteroidetes foram associadas à intervenção SLR na Semana 61 (RDA1 explicou 30,58% da variância total, R2adj {{5} }.29,p=0.001, Figura 3c). Para a Semana 71, a abundância de Bacteroidetes foi maior no grupo controle do que no grupo SLR (RDA1 explicou 8,18% da variância total, R2adj=0.06,p=0.005, Figura 3d) .

Procedemos então a uma seleção gradual de variáveis ​​explicativas (variáveis ​​de intervenção e demográficas) com base na AIC. O modelo revelou que apenas a intervenção explicou significativamente as variações nos perfis da microbiota intestinal de crianças em idade escolar (q=0,035).

3.3. Desempenho Cognitivo entre os Grupos Controle e Intervenção

Na Fase I, encontramos diferenças significativas entre os grupos controle e intervenção nos resultados cognitivos. O grupo SLR apresentou pontuações significativamente mais altas no teste Corsi block-tapping (denominado MMG, jogo de correspondência de memória) e desempenho geral (OVP) no teste de vigilância psicomotora (PVT-B), enquanto os tempos de reação (TR) e lapsos foram inferiores ao controle. grupo (Figura 4).

Na Fase II, os padrões de desempenho cognitivo permaneceram inalterados. Também comparamos o desempenho cognitivo (dentro dos indivíduos) ao longo das semanas de cada fase e descobrimos que o grupo de controle (Fase I) teve melhor desempenho em relação aos lapsos na semana 15 em comparação com a linha de base e a semana 4 (q=0,02) (Figura S3). O RT foi maior na semana 15 em comparação com a semana 4 (q=0 0,008), enquanto não foram detectadas diferenças significativas em MMG ou OVP. MMG foi o único resultado cognitivo que foi significativamente maior para o grupo SLR (Fase I) na Semana 15 em comparação com o valor basal (q=0.003) e Semana 4 (q=0.03) (Figura S4) .

Na Fase II, não houve diferenças significativas ao longo das semanas em nenhuma das medidas de desempenho cognitivo nos grupos controle ou SLR. Além disso, a idade e o sexo também foram incluídos na RDA, e os resultados não mostraram nenhum efeito da intervenção no desempenho cognitivo das crianças. em qualquer grupo em qualquer um dos momentos durante as 71 semanas do estudo.

Descobriu-se, no entanto, que a idade descreve significativamente a variação dos resultados cognitivos no início do estudo (p=0 0,008), na semana 4 (p=0 0,005) e na semana 15 (p=0 0,028) (Figura 5), ​​para os quais a idade foi positivamente correlacionada com MMG e OVP. Não foram encontrados efeitos significativos causados ​​pela intervenção, idade ou sexo no desempenho cognitivo na Semana 56, Semana 61 ou Semana 71.

Ao considerar os perfis cognitivos ao longo das semanas de cada tratamento em cada fase, tanto a semana (p=0 0,001) quanto o gênero (p=0 0,001) descreveram significativamente variações no desempenho cognitivo do grupo de controle (Fase I) , para o qual o sexo feminino e a Semana 15 foram positivamente correlacionados com MMG e OVP (Figura S5a).

As crianças tiveram melhor desempenho na MMG na semana 15 no grupo SLR (Fase I), enquanto o sexo feminino foi positivamente correlacionado com lapsos e TR (Figura S5b). O efeito do ajuste do tratamento para idade e sexo também foi avaliado para cada fase, controlando a semana (pontos no tempo). A RDA mostrou que a idade teve forte relação com OVP e MMG na Fase I (Figura S6a), enquanto, na Fase II, o desempenho em relação ao TR e aos lapsos foi pior no grupo SLR do que no grupo controle (Figura S6b).
No geral, a idade e os momentos foram mais associados ao desempenho cognitivo das crianças em idade escolar do que à intervenção, e o efeito da intervenção só foi observado quando se restringiam amostras dentro de cada semana da Fase II, após ajuste para idade e sexo.

3.4. Associação entre Microbiota Intestinal e Desempenho Cognitivo de Crianças em Idade Escolar

Encontramos correlações fracas entre a microbiota intestinal e os resultados cognitivos em todos os momentos da intervenção com base nos coeficientes de correlação de Spearman. Várias associações foram significativas (p <{0}}.05), mas apenas uma associação, detectada na Semana 4 para o grupo SLR (Roseburia vs. Lapsos, rho=−0,40, q {{6 }}.04), permaneceu significativo após ajuste para comparações múltiplas (Figura S7).

Algumas associações que se aproximaram da significância foram encontradas na Semana 56 e na Semana 71. As associações identificadas no grupo SLR na Semana 56 incluíram Faecalibacterium –RT (rho=0.62, q=0.07 ), Prevotella – OVP (rho=−0.55, q {{10}}.08), Gammaproteobacteria –OVP (rho=−0,58, q=0,07) e Faecalibacterium –OVP (rho=−0,64, q=0,05). Na Semana 71, Faecalibacterium foi positivamente correlacionado com TR no grupo controle (rho=0.62, q=0.07).

Levando em conta idade e sexo, uma análise mais aprofundada da associação entre a microbiota intestinal e o desempenho cognitivo em cada momento foi realizada usando um MFA para revelar variações entre os perfis individuais dos grupos de tratamento (Arquivo Suplementar S4).

Embora a variação individual tenha sido explicada pela abundância da microbiota intestinal no Dim 1 de ambas as fases (p < 0.0001), uma forte separação entre os grupos controle e SLR foi observada no Dim 2 (Figuras 6 e 7). O perfil de contraste entre esses dois grupos foi influenciado pela idade e pela OVP, que se correlacionaram positivamente com Dim 2 (p < 0,0001), enquanto tanto o TR quanto os lapsos foram correlacionados negativamente (p < 0,0001).

No entanto, a proteína gama foi a mais influente na descrição da variação individual nesta dimensão na semana 61 (p < 0.0001). O nível desta bactéria foi menor no grupo SLR (coordenada=−1,35, p < 0,0001).

Apesar dos tamanhos amostrais desiguais, o MFA indicou que a diferença nos perfis das crianças em idade escolar neste ensaio clínico não randomizado foi mais influenciada pela idade e pelo desempenho cognitivo do que pela microbiota intestinal, sugerindo menor contribuição da intervenção para a variação individual neste estudo.

4. Discussão

Nosso estudo não observou alterações significativas na abundância absoluta da microbiota intestinal após a primeira fase da intervenção do arroz Sinlek em crianças em idade escolar. Diferenças significativas entre os grupos, no entanto, foram observadas na Fase II (semanas 61 e 71) para bactérias totais, Firmicutes, Bacteroidetes e Gammaproteobacteria.

Também observamos diferenças significativas no desempenho cognitivo entre os grupos controle e intervenção em ambas as fases. Não encontramos uma forte correlação entre a microbiota intestinal e o desempenho cognitivo em nenhum momento.

Análises adicionais sugeriram que, nesta coorte, a intervenção com arroz Sinlek não contribuiu para variações na microbiota intestinal e nos perfis cognitivos de crianças em idade escolar, uma vez que os resultados foram influenciados principalmente pela idade.

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