Um homozigoto Dab1-// é uma nova causa potencial de anomalias congênitas autossômicas recessivas do rim e do trato urinário de camundongos
Feb 28, 2022
Introdução
Camundongos mutantes Yotari, obtidos pela aquisição espontânea de uma mutação no gene Dab1, apresentam anormalidades histológicas no sistema nervoso central [1,2], muito semelhantes às de camundongos reeler (reelin//), sugerindo que reelin e DAB1 pertencem a a mesma via de sinalização [1-4]. As aberrações na via reelin/DAB1 foram relatadas como associadas a vários distúrbios psiquiátricos [5-7]. Curiosamente, além do sistema nervoso central, a presença das proteínas DAB1 e reelina também foi confirmada no sistema nervoso periférico e em alguns tecidos extraneurais. A presença de DAB1 foi encontrada em podócitos de camundongos [8] e fetos humanos.rins[9] enquanto a expressão de reelina foi relatada durante o desenvolvimento fetal de camundongos e humanos, bem como em algumas células endoteliais ao longo dos vasos sanguíneos no camundongo adulto [9-11]. A via canônica reelin/DAB1 pode desencadear proteínas distintas a jusante, incluindo receptores NOTCH2, que desempenham papéis críticos nas decisões de destino celular e diferenciação duranterimdesenvolvimento [12-14]. Receptores NOTCH2 são necessários para formar túbulos proximais e podócitos [13], mas uma vez que a maturação do néfron é alcançada, esta via é principalmente silenciada [15]. Em condições agudasdoenças renais,A expressão aumentada de NOTCH2 pode contribuir potencialmente para a regeneração, enquanto a expressão sustentada está causalmente associada à fibrose intersticial e glomeruloesclerose [15]. A regulação negativa da sinalização NOTCH pode diminuir muito a autofagia e causar prejuízo na diferenciação podocitária durante o desenvolvimento [16].
Consequentemente, podócitos disfuncionais desempenham um papel crucial na doença glomerular, especialmente na síndrome nefrótica idiopática humana [17,18] e na síndrome nefrótica de alteração mínima (MCNS) [19]. Assim, a autofagia mantém a homeostase celular em condições fisiológicas normais, enquanto em condições patológicas pode progredir para a morte autofágica. Um biomarcador de autofagia amplamente utilizado é o LC3B, uma proteína estrutural das membranas autofagossômicas [21]. O crosstalk complexo entre autofagia e apoptose também contribui para a manutenção do equilíbrio homeostático como resposta ao microambiente da célula. É bem conhecido que os eventos apoptóticos aumentam em número duranterimdesenvolvimento [22] e diminuem muito uma vez que a maturação termina, exceto em condições delesão renal[23]. Inegavelmente, a apoptose é um mecanismo complexo regulado pela interação de várias vias, mas principalmente termina com a ativação da caspase3 (CASP3), cuja ativação é um dos marcadores mais usados para detecção de apoptose [23].
Neste relatório, nosso objetivo foi analisar como o silenciamento funcional do gene Dab1 influenciarimmorfologia e a expressão e localização de proteínas reelina, NOTCH2, LC3B e CASP3 clivadas em camundongos pós-nataisrins. Assumimos que essas proteínas são expressas no camundongo pós-natalrim,e sua interação funcional contribui para a manutenção de sua estrutura e função. Além disso, como a presença de DAB1 foi confirmada durante o fetorimdesenvolvimento [9], pode-se presumir que sua inativação pode causar distúrbios em um amplo espectro de anomalias congênitas dorime trato urinário (CAKUT).
Palavras-chave:yotari; função renal; desenvolvimento renal pós-natal; coloração por imunofluorescência; microscopia eletrônica de transmissão
CISTANCHE VAI MELHORAR A FUNÇÃO RENAL/RENAL
Materiais e métodos
Coleta de AmostrasComo mutantes convencionais nulos de Dab1, usamos camundongos yotari (Dab1/ ) descritos anteriormente por Howell et al. [24]. Os primers de PCR utilizados para a genotipagem dos camundongos foram yotari: GCC CTTCAGCATCACCATGCT e CAGTGAGTACATATTGTGTGAGTTCC, tipo selvagem do locus Dab1: GCCCTTCAGCATCACCATGCT e CCTTGTTTCTTTGCTTTAA-GGCTGT [5]. Camundongos C57BL/6 N foram criados e alojados em grupo em gaiolas de policarbonato padrão (incluindo pelo menos um de cada genótipo) com acesso ad libitum a comida e água em uma sala com temperatura controlada (23 ± 2 ◦C) com 12 h de luz/ ciclo escuro. Nos dias pós-natais 4, 11 e 14 (P4, P11 e P14), os camundongos foram profundamente anestesiados com pentobarbital e perfundidos transcardialmente por 10 min com tampão fosfato salino (PBS, pH 7,2) e paraformaldeído a 4% (PFA ) em PBS 0,1 M.Rinsforam removidos e fixados com 4% de PFA em 0.1 M PBS durante a noite para análises histológicas convencionais (hematoxilina-eosina (H&E), coloração imuno-histoquímica e imunofluorescência) e em uma mistura de 2% de PFA mais 2,5% de glutaraldeído (GA) para exame de microscopia eletrônica. Após a fixação, o tecido foi preparado para posterior exame histológico, conforme descrito anteriormente [25,26].
Imunofluorescência e coloração de imunoperoxidaseApós a desparafifinização e reidratação, os cortes foram aquecidos por 20 min em tampão citrato 0,01 M (pH 6,0) em vaporizador de água e, posteriormente, resfriados à temperatura ambiente. O tampão de bloqueio (ab 64226, Abcam, Cambridge, UK) foi aplicado por 30 min para excluir coloração não específica. As seções foram então incubadas em uma câmara de umidade durante a noite com anticorpos primários (Tabela 1). Após lavagem em PBS, os anticorpos secundários (Tabela 1) foram aplicados por uma hora e lavados em PBS novamente. Em seguida, os núcleos foram corados com 4060 -diamidino-2-fenilindol (DAPI) por 2 min, lavados em PBS e cobertos com lamínula. Realizamos o teste de pré-adsorção para que cada anticorpo primário fosse utilizado com o peptídeo correspondente e aplicasse sua combinação aos cortes. Os resultados não mostraram coloração de anticorpos. Além disso, foram realizados controles com a omissão do anticorpo primário para determinar os níveis de ligação não específica dos anticorpos secundários.
Para coloração de imunoperoxidase, anti-CASP3 policlonal de coelho (1:100 diluições, ab13847, Abcam, Cambridge, Reino Unido) foi aplicado como anticorpo primário por uma hora em uma câmara de umidade após o tratamento da seção com 0,1 por cento H2O2. Após a lavagem em PBS, a detecção secundária foi realizada usando o link e a estreptavidina peroxidase, cada uma por quinze minutos (DakoCytomation, CA 93013 USA, LOT 03477) e diaminobenzidina (Dako, CA 93013 USA, LOT 10051369), cuidadosamente controladas para evitar sobrecoloração de fundo. Os núcleos foram corados com hematoxilina, lavados em água corrente por 10 min, brevemente desidratados em séries ascendentes de soluções de etanol e cobertos com lamínula.
Preparação de Tecidos para Microscópio Eletrônico de Transmissão (TEM)Após fixação com uma mistura de 2 por cento de PFA e 2,5 por cento de GA em 0.1 M PBS por 2 h, as amostras foram lavadas com PBS e pós-fixadas em uma solução aquosa de 2 por cento de tetróxido de ósmio por 2 h. Todas as amostras foram lavadas duas vezes em PBS, desidratadas em graus crescentes de etanol e incluídas em Epon 812 (TAAB Laboratories Equipment, Reading, UK). Seções seriadas (70 nm de espessura) foram cortadas em um ultramicrótomo Ultracut UCT (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha) e coradas com 1 por cento de acetato de uranila e citrato de chumbo.
Aquisição e Análise de DadosA análise foi realizada com um microscópio de epiflfluorescência (Olympus BX51, Tóquio, Japão) equipado com uma câmera digital DP71 (Olympus), um microscópio eletrônico de transmissão JEM 1400 (JEOL, Tóquio, Japão) operado a 80 kV e fotografado com um carregador JEOL. sistema de câmera de dispositivo acoplado (CCD) (Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA, EUA) e, por último, um microscópio de campo claro (BX40, Olympus, Tóquio, Japão). Todas as imagens analisadas foram processadas com o software ImageJ e Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA, EUA). Por grupo examinado, usamos de três a quatro animais. Todos coletadosrinsforam cortadas em seções de 5 µm de espessura, e no máximorim length determined by using these samples was reported. Mean proximal convoluted tubules (PCT), distal convoluted tubules (DCT) and glomeruli diameters were determined by averaging 100 structure diameters per analyzed sample. As nephron segments have irregular shapes, we took the largest diameter of every examined segment as representative. The staining intensity was semiquantitatively evaluated at four degrees: the absence of any reactivity (( ), mild reactivity (+), moderate reactivity (++), and strong reactivity (+++) (Table 2). The number of DAB1, reelin, NOTCH2, LC3B, and cleaved CASP3 immunoreactive cells was counted and expressed as a percentage of total cells. For each sample, we analyzed twenty PCT, DCT, and G at ×40 objective magnifification. We averaged the number of positive cells per group. Any level of nuclear, cytoplasmic, or membrane staining was regarded as positive. Three investigators analyzed the images independently. Interrater agreement was tested with interclass correlation analysis, which yielded a coeffificient >0.75, indicando excelente concordância [27].
Análise estatísticaUm teste t bicaudal foi realizado para analisar as diferenças no diâmetro médio entre PCT, DCT e G de animais selvagens e yotari. O diâmetro foi apresentado como média ± desvio padrão (DP). O nível de significância foi estabelecido em p < 0.05.="" um="" teste="" de="" anova="" de="" duas="" vias="" seguido="" pelo="" teste="" de="" comparação="" múltipla="" de="" tukey="" foi="" usado="" para="" examinar="" as="" diferenças="" na="" porcentagem="" de="" células="" positivas="" entre="" pct,="" dct="" e="" glomérulos="" em="" todos="" os="" pontos="" de="" tempo.="" a="" porcentagem="" de="" células="" positivas="" foi="" expressa="" como="" a="" média="" ±="" erro="" padrão="" da="" média="" (sem).="" o="" nível="" de="" significância="" foi="" estabelecido="" em="" p="">< 0,05.="" a="" análise="" foi="" realizada="" no="" software="" graphpad="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="">
Resultados
Coloração de Hematoxilina-Eosina (H&E) e Medição do Diâmetro do Rimcoloração H&E de cortes sagitais medianos dorinsem todos os pontos de tempo examinados destaca a pequenarimfenótipo de camundongos yotari em comparação com o tipo selvagem (Figura 1a). Na média 4Primo diâmetro dos animais yotari foi em torno de 55 µm do que em torno de 75 µm. Além disso, essa diferença foi perceptível em momentos posteriores devido ao crescimento mais lento dorinsem yotari em comparação com o crescimento progressivo darinsem animais selvagens. Para determinar se a redução narimtamanho foi causado por uma diminuição no tamanho do segmento do néfron, calculamos a média do diâmetro de PCT, DCT e G por grupo. De fato, houve uma diminuição no diâmetro médio G, PCT e DCT no grupo yotari em comparação com o tipo selvagem (Figura 1b, p < 0,05).="" além="" disso,="" a="" coloração="" h&e="" revelou="" córtex="" mais="" fino="">renalextensão da pelve em animais yotari e DCT levemente dilatada difusamente em 14P. A estrutura básica e o padrão de maturação glomerular são os mesmos em ambos os grupos de animais examinados.
Análise Histológica Descritiva Baseada em Microfotografias TEMEm microfotografias obtidos por TEM, os glomérulos de camundongos do tipo selvagem mostraram a aparência típica de todas as partes da barreira de fifiltração, que eram normalmente desenvolvidas e reconhecíveis (Figura 2a). Podócitos, processos podócitos e pedículos, fendas de fifiltração, membranas basais glomerulares e o lúmen capilar com o endotélio fenestrado foram facilmente distinguíveis (Figura 2a). Por outro lado, nos glomérulos de camundongos yotari, observou-se dano progressivo dos podócitos com apagamento do processo podal e ausência de fendas de fifiltração (Figura 2b–d). Essas alterações ultraestruturais foram observadas em todos osrinsexaminou e envolveu a maioria dos glomérulos examinados. Não foram observadas anormalidades no PCT ou DCT de camundongos yotari do que animais do tipo selvagem (Figura 2e-h). Na PCT, as interfaces celulares foram mal definidas devido à irregularidade das membranas celulares e à interdigitação das células com suas vizinhas. O citoplasma era abundante, contendo núcleos bem distintos, mitocôndrias alongadas, invaginações basais e muitas fossetas tubulares entre as microvilosidades, que formavam uma borda em escova na membrana apical. A maior ampliação revelou a superfície apical das células epiteliais PCT contendo microvilosidades longas para formar a borda em escova e junções apertadas entre as bordas das células luminais das células epiteliais tubulares vizinhas (Figura 2e,f). Por outro lado, a superfície apical das células epiteliais DCT continha poucas microvilosidades curtas e numerosas vesículas (Figura 2g,h).
Figura 2. Microfotografias de microscópio eletrônico de transmissão (TEM) de tipo selvagem e yotaririns.Glomérulos de animais de tipo selvagem (a) mostraram uma barreira de fifiltração normalmente desenvolvida com endotélio fenestrado (E) do capilar (C), membrana basal (BM), podócitos (P) com pedículos (PE) e fendas de fifiltração (FS ). Norinsdos animais yotari, pode-se notar apagamento dos pedículos e ausência de fendas de fifiltração (asteriscos, b–d). Nenhuma anormalidade foi observada nos túbulos contorcidos proximais (PCT) ou túbulos contorcidos distais (DCT) de camundongos yotari em comparação com os animais do tipo selvagem (e-h). Na PCT, o citoplasma era abundante, contendo núcleos bem distintos (N), mitocôndrias alongadas (M), invaginações basais (BI) e muitas fossetas tubulares (TP) entre as microvilosidades, que formavam uma borda em escova (BB) na membrana apical (e,f). A maior ampliação revelou a superfície apical das células epiteliais PCT contendo microvilosidades longas para formar a borda em escova e junções apertadas (TJ) entre as bordas das células luminais das células epiteliais tubulares vizinhas (e,f). Por outro lado, a superfície apical das células epiteliais DCT contém poucas microvilosidades curtas e numerosas vesículas (g,h). A barra de escala nas imagens (a–d) e inserções (e–h) é de 1 µm; a barra de escala nas imagens (e–h) é de 2 µm.
Localização e Colocalização de Reelin e DAB1A reelina foi fracamente expressa com reatividade leve a moderada (Tabela 2) nos glomérulos e DCT de todos os animais examinados em todos os pontos de tempo observados (p < 0.05,="" figura="" 3a).="" apenas="" no="" pct="" de="" camundongos="" yotari="" a="" porcentagem="" de="" células="" positivas="" foi="" significativamente="" maior="" do="" que="" os="" animais="" do="" tipo="" selvagem="" (p="">< 0,05,="" figura="" 3a).="" nas="" células="" glomerulares,="" a="" localização="" da="" coloração="" foi="" perinuclear,="" enquanto="" na="" pct="" e="" dct,="" foi="" espalhada="" por="" todo="" o="" citoplasma="" (figura="">
Figura 4. Coloração por imunofluorescência de yotari pós-natalrinscom marcador reelin (a) e coloração de imunofluorescência dupla de tipo selvagem pós-natalrinscom marcadores DAB1 e reelin (b). (a,b) A coloração DAPI do DNA nuclear se fundiu com DAB1 e a imunofluorescência de reelina é mostrada em paralelo (fusão). Os pontos de tempo observados foram P4, P11, P14. A expressão dos marcadores examinados nos glomérulos (G), túbulos contorcidos proximais (PCT) e túbulos contorcidos distais (DCT) está marcada com as setas, enquanto os asteriscos indicam a expressão da reelina na matriz extracelular (a). As inserções mostram a expressão mais proeminente na imagem. A coloração nuclear DAPI revelou pobre colocalização de DAB1 e reelin, principalmente no DCT (ponta de seta). A barra de escala é de 20 µm e refere-se a todas as imagens.
Quase não houve reatividade imune de DAB1 em glomérulos e PCT de animais de tipo selvagem em P4, enquanto a porcentagem de células positivas com reatividade leve (Tabela 2) aumentou significativamente em P11 e P14 (p < 0.05,="" figura="" 3b).="" no="" dct,="" dab1="" foi="" expresso="" principalmente="" nas="" partes="" apicais="" e="" laterais="" das="" membranas="" celulares="" (figura="" 4b)="" com="" forte="" reatividade="" (tabela="" 2).="" a="" porcentagem="" de="" células="" positivas="" foi="" significativamente="" maior="" do="" que="" nas="" estruturas="" anteriores,="" em="" torno="" de="" 60="" por="" cento="" (figura="" 3b),="" principalmente="" na="" mácula="" densa="" (figura="" 4b).="" quase="" não="" houve="" colocalização="" do="" dab1="" e="" reelin,="" exceto="" no="" dct="" de="" animais="" de="" tipo="" selvagem="" em="" p14="" (ponta="" de="" seta,="" figura="" 4b).="" biomoléculas="" 2021,="" 11,="" 609="" 8="" de="" 14="" figura="" 4.="" coloração="" por="" imunofluorescência="" de="" yotari="">rinscom marcador reelin (a) e coloração de imunofluorescência dupla de tipo selvagem pós-natalrinscom marcadores DAB1 e reelin (b). (a,b) A coloração DAPI do DNA nuclear fundiu-se com DAB1, e a imunofluorescência reelina é mostrada em paralelo (fusão). Os pontos de tempo observados foram P4, P11, P14. A expressão dos marcadores examinados nos glomérulos (G), túbulos contorcidos proximais (PCT) e túbulos contorcidos distais (DCT) está marcada com as setas, enquanto os asteriscos indicam a expressão da reelina na matriz extracelular (a). As inserções mostram a expressão mais proeminente na imagem. A coloração nuclear DAPI revelou pobre colocalização de DAB1 e reelin, principalmente no DCT (ponta de seta). A barra de escala é de 20 µm e se refere a todas as imagens. Quase não houve reatividade imune de DAB1 em glomérulos e PCT de animais de tipo selvagem em P4, enquanto a porcentagem de células positivas com reatividade leve (Tabela 2) aumentou significativamente em P11 e P14 (p < 0,05,="" figura="" 3b).="" no="" dct,="" dab1="" foi="" expresso="" principalmente="" nas="" partes="" apicais="" e="" laterais="" das="" membranas="" celulares="" (figura="" 4b)="" com="" forte="" reatividade="" (tabela="" 2).="" a="" porcentagem="" de="" células="" positivas="" foi="" significativamente="" maior="" do="" que="" nas="" estruturas="" anteriores,="" em="" torno="" de="" 60="" por="" cento="" (figura="" 3b),="" principalmente="" na="" mácula="" densa="" (figura="" 4b).="" quase="" não="" houve="" colocalização="" do="" dab1="" e="" reelina,="" exceto="" no="" dct="" de="" animais="" do="" tipo="" selvagem="" em="" p14="" (ponta="" de="" seta,="" figura="">
Padrões de Expressão Espacial e Temporal de NOTCH2 e LC3BA porcentagem de células NOTCH{{0}}positivas foi inferior a 20 por cento nos glomérulos de ambos os genótipos animais em todos os pontos de tempo observados. Apenas em P14 a porcentagem de células positivas foi significativamente maior nos glomérulos dos animais yotari do que nos animais selvagens (p < 0,05,="" figura="" 3c).="" a="" intensidade="" da="" coloração="" foi="" leve="" a="" moderada="" (tabela="" 2),="" localizada="" principalmente="" perinuclear="" (figura="" 5a–f).="" no="" pct="" e="" no="" dct="" de="" ambos="" os="" genótipos="" animais,="" a="" porcentagem="" de="" células="" positivas="" aumentou="" ao="" longo="" do="" tempo.="" em="" p14,="" a="" porcentagem="" de="" células="" positivas="" foi="" significativamente="" maior="" em="" pct="" e="" dct="" de="" animais="" yotari="" do="" que="" pct="" e="" dct="" de="" animais="" do="" tipo="" selvagem="" (p="">< 0,05,="" figura="" 3c).="" a="" intensidade="" do="" sinal="" em="" todos="" os="" pontos="" de="" tempo="" observados="" foi="" leve="" a="" moderada="" (tabela="" 2)="" e="" espalhada="" por="" todo="" o="" citoplasma="" (figura="" 5a-f).="" figura="" 5.="" coloração="" de="" imunofluorescência="" de="" tipo="" selvagem="" pós-natal="" e="">rinscom marcadores NOTCH2 e LC3B e coloração de imunoperoxidase com marcador caspase3 clivada (CASP3). (a–f) A coloração DAPI do DNA nuclear é mesclada com NOTCH2 e LC3B. Os pontos de tempo observados foram P4, P11, P14. A expressão dos marcadores NOTCH2 e LC3B nos glomérulos (G), túbulos contorcidos proximais (PCT) e túbulos contorcidos distais (DCT) está marcada com as setas. Reatividade especialmente forte de LC3B pode ser observada na cápsula de Bowman de glomérulos em decomposição (asterisco, e). As inserções mostram a expressão mais proeminente na imagem. CASP3 foi mal expresso em todos os pontos de tempo observados. A única expressão significativa foi nos glomérulos de camundongos yotari em P14 (setas). A barra de escala é de 20 µm e refere-se a todas as imagens. Biomoléculas 2021, 11, 609 9 de 14 3.4. Padrões de Expressão Espacial e Temporal de NOTCH2 e LC3B A porcentagem de células NOTCH2-positivas foi inferior a 20 por cento nos glomérulos de ambos os genótipos animais em todos os pontos de tempo observados. Apenas em P14 a porcentagem de células positivas foi significativamente maior nos glomérulos dos animais yotari do que nos animais selvagens (p < 0,05,="" figura="" 3c).="" a="" intensidade="" da="" coloração="" foi="" leve="" a="" moderada="" (tabela="" 2),="" localizada="" principalmente="" perinuclear="" (figura="" 5a–f).="" no="" pct="" e="" no="" dct="" de="" ambos="" os="" genótipos="" animais,="" a="" porcentagem="" de="" células="" positivas="" aumentou="" ao="" longo="" do="" tempo.="" em="" p14,="" a="" porcentagem="" de="" células="" positivas="" foi="" significativamente="" maior="" em="" pct="" e="" dct="" de="" animais="" yotari="" do="" que="" pct="" e="" dct="" de="" animais="" selvagens="" (p="">< 0,05,="" figura="" 3c).="" a="" intensidade="" do="" sinal="" em="" todos="" os="" pontos="" de="" tempo="" observados="" foi="" leve="" a="" moderada="" (tabela="" 2)="" e="" espalhada="" por="" todo="" o="" citoplasma="" (figura="">
Figura 5. Coloração de imunofluorescência de tipo selvagem pós-natal e yotaririnscom marcadores NOTCH2 e LC3B e coloração de imunoperoxidase com marcador caspase3 clivada (CASP3). (a–f) A coloração DAPI do DNA nuclear é mesclada com NOTCH2 e LC3B. Os pontos de tempo observados foram P4, P11, P14. A expressão dos marcadores NOTCH2 e LC3B nos glomérulos (G), túbulos contorcidos proximais (PCT) e túbulos contorcidos distais (DCT) está marcada com as setas. Reatividade especialmente forte de LC3B pode ser observada na cápsula de Bowman de glomérulos em decomposição (asterisco, e). As inserções mostram a expressão mais proeminente na imagem. CASP3 foi mal expresso em todos os pontos de tempo observados. A única expressão significativa foi nos glomérulos de camundongos yotari em P14 (setas). A barra de escala é de 20 µm e refere-se a todas as imagens.
Nos glomérulos e DCT de ambos os genótipos animais, a porcentagem de células LC3B-positivas aumentou ao longo do tempo (p < 0.05,="" figura="" 3d).="" em="" p11="" e="" p14,="" a="" porcentagem="" de="" células="" positivas="" foi="" significativamente="" maior="" nos="" glomérulos="" de="" animais="" yotari="" do="" que="" nos="" glomérulos="" de="" animais="" do="" tipo="" selvagem="" (p="">< 0="" 0,05,="" figura="" 3d).="" nos="" glomérulos="" de="" animais="" yotari,="" a="" intensidade="" de="" coloração="" foi="" principalmente="" moderada="" a="" forte="" (tabela="" 2)="" localizada="" no="" espaço="" perinuclear="" e="" nuclear="" (figura="" 5a-f),="" em="" todos="" os="" pontos="" de="" tempo="" observados,="" enquanto="" nos="" glomérulos="" de="" camundongos="" do="" tipo="" selvagem,="" a="" intensidade="" foi="" em="" sua="" maioria="" moderada="" (tabela="" 2).="" pct="" de="" yotari="" e="" animais="" do="" tipo="" selvagem="" continham="" cerca="" de="" 20="" por="" cento="" de="" células="" positivas="" em="" todos="" os="" pontos="" de="" tempo="" observados="" (p=""><0,05, figura="">
Expressão CASP-3 clivadaQuase não houve expressão do CASP ativado-3 norinsde animais do tipo selvagem em todos os pontos de tempo observados. Na PCT e DCT de camundongos yotari, várias células individuais foram CASP-3-positivas (Figura 3e). Apenas nos glomérulos dos rins yotari em P14 (Figura 5e), a porcentagem de células positivas aumentou significativamente em comparação comrinsde camundongos de tipo selvagem (p < 0 0,05, Figura 3e).
Discussão
Rimmorfogênese e desenvolvimento são processos complexos precisamente coordenados através da interação de um grande número de genes. Anomalias congênitas dorime trato urinário (CAKUT) são os defeitos congênitos mais comuns que constituem 23 por cento de todos esses defeitos e representam a principal causa de estágio finaldoença renalem crianças [28,29]. Distúrbios de gene único podem ser a fonte primária de CAKUT e, até agora, uma mutação em mais de 20 genes foi identificada como a causa de CAKUT [30]. Como nosso trabalho anterior mostrou grande expressão de DAB1 durante fetos humanos normais,rimdesenvolvimento [9], assumimos que DAB1 pode desempenhar um papel significativo durante o desenvolvimento de mamíferosrimdesenvolvimento. Para provar nossa hipótese, investigamos orimmorfologia e padrões de expressão de proteínas reelina, NOTCH2, LC3B e CASP3 ativadas em camundongos knockout Dab1.
CISTANCHE VAI MELHORAR A DOR RENAL/RENAL
Seção através dos ratos yotaririnsrevelou um córtex mais fino e uma média significativamente menorrime diâmetros PCT, DCT e G comparados com animais selvagens. A diminuição derimtamanho causado pela dotação de néfrons insuficiente é conhecido comorenalhipoplasia, um dos distúrbios CAKUT mais comuns, que predispõe a hipertensão de início na idade adulta e a doença renal crônica [31]. Além disso, as microfotografias capturadas com o TEM revelaram que os camundongos yotari exibiram danos proeminentes nos podócitos com apagamento do processo do pé e falta de fendas de fifiltração. Após a lesão, os podócitos sofrem um processo de apagamento no qual perdem sua estrutura, levando a uma redução na sua função de barreira de fifiltração [32]. Todas as formas de síndrome nefrótica, bem como a glomeruloesclerose segmentar focal (GESF), são caracterizadas por defeitos na estrutura ou função dos podócitos [33].
Nosso estudo atual mostrou a maior expressão de DAB1 nas partes apicais e laterais das membranas celulares do DCT, enquanto o REELIN estava principalmente espalhado por todo o citoplasma do PCT. Nos momentos investigados, não foram observadas alterações morfológicas nos túbulos de camundongos yotari, mas são necessárias mais investigações para elucidar o papel do DAB1 nos compartimentos tubulointersticiais. Houve uma eventual colocalização das proteínas DAB1 e REELIN, principalmente no DCT. Esses achados estão seguindo nosso trabalho anterior sobre a expressão dessas duas proteínas durante o feto humano.rimdesenvolvimento [9]. Isso pode sugerir que DAB1 e reelin têm papéis semelhantes em humanos e camundongosrinsativando algumas das vias a jusante, como as cascatas de sinalização Crk, MAPK e PI3K/Akt/mTOR [34-36]. Nossos dados também revelaram aumento da expressão de reelin nos glomérulos de camundongos yotari. Curiosamente, um estudo anterior mostrou que a fosforilação de DAB1 e o aumento da expressão de reelina nos glomérulos são acompanhados por hipertensão, proteinúria e lesão de podócitos em ratos infundidos com Ang II [10].
Além disso, a coloração por imunofluorescência revelou um aumento da expressão de receptores NOTCH2 nos glomérulos de camundongos P14 yotari. É bem conhecido que a expressão de NOTCH2 é regulada negativamente uma vez que a maturação do néfron é alcançada, exceto nas condições delesões renais,como nefropatia diabética e GESF [15,37]. Camundongos com síndrome nefrótica induzida por adriamicina também mostraram aumento da expressão de NOTCH2 ativado, que melhora a fibrose [38]. Nos momentos investigados, não observamos aumento da fibrose, mas resta elucidar o papel exato do NOTCH2 expresso no yotari pós-natalrins.Seria necessária uma observação adicional sobre se as alterações fifibróticas ocorrem nos estágios posteriores. No entanto, já existem alguns achados que sugerem que o efeito de curto prazo do aumento da ativação de NOTCH2 está associado a um forte benefício de sobrevivência para podócitos lesados, que é perdido em modelos de longo prazo, como a nefropatia diabética [39].
A maior expressão de LC3B nos glomérulos de camundongos P11 e P14 yotari provavelmente refletiu um acúmulo de autofagossomos nos podócitos. Para mostrar claramente que a autofagia foi acelerada. É necessário analisar a proporção das expressões das proteínas LC3-II e LC3-I. Em condições normais, a autofagia é necessária parafunção renal[40], especialmente em podócitos. Devido à sua capacidade limitada de divisão e substituição celular, exibem um alto nível basal de autofagia [41]. Apesar desses achados, a elevação na expressão de LC3B tem sido relatada em várias doenças glomerulares [42-44], principalmente em associação com o apagamento do processo do pé e desenvolvimento de síndrome nefrótica, como visto em camundongos nocaute condicional do receptor de pró-renina [45,46]. Todos esses estudos sugerem um papel protetor da autofagia aprimorada em condições patológicas, ainda mais apoiadas pelos achados da nefropatia induzida por adriamicina, onde a autofagia é ativada para proteger contra lesão podocitária [43], bem como na doença glomerular dependente da idade, onde ela retarda o declínio funcional progressivo dafunção renal[40]. Análise de humanosrimas biópsias também mostraram evidências de aumento da autofagia em associação com o apagamento do processo do pé em várias doenças glomerulares, incluindo a síndrome nefrótica de alteração mínima (MCNS), que é uma das causas mais comuns de síndrome nefrótica idiopática [19]. Nas condições de nefropatia diabética e doença aguda induzida por lipopolissacarídeoslesão renal,aumentar a autofagia com algumas terapêuticas através da inibição da via PI3K/AKT/mTOR melhora a função renal [47,48]. Todos esses achados implicam que a autofagia tem um papel citoprotetor indispensável para a adaptação ao estresse emlesão renal, e sua modulação pode ser uma estratégia terapêutica promissora, embora, em algumas circunstâncias, a autofagia também possa ser deletéria e progredir para a morte celular.
CISTANCHE VAI MELHORAR A INSUFICIÊNCIA RENAL/RENAL
Exceto pela elevação da autofagia, um aumento do nível de apoptose também pode ser observado nos glomérulos de camundongos P14 yotari. A autofagia geralmente previne a apoptose, mas sob circunstâncias patológicas específicas, também pode ter um efeito oposto na sobrevivência celular, aumentando e promovendo a apoptose. Após o nascimento, a apoptose norinsé muito diminuída, exceto nas condições delesão renal,como a síndrome nefrótica idiopática onde contribui para o desenvolvimento da doença [23]. potencial nova causa de anomalias congênitas autossômicas recessivas dorime trato urinário. No entanto, o principal papel do DAB1 duranterimdesenvolvimento permanece incerto. Além disso, esses camundongos apresentaram anormalidades do processo do pé e um aumento do nível de reelina, NOTCH2, LC3B e proteínas CASP3 clivadas nos glomérulos que podem levar a lesões glomerulares, como síndrome nefrótica, que em correlação com hipoplasia, pode ser uma causa potencial de morte desses animais durante o período de desmame. Para confirmar essa hipótese, é necessário fornecer informações adicionais sobre a pressão arterial e outros parâmetros clínico-laboratoriais, como níveis séricos de creatinina, albumina e proteínas.