Uma distribuição distinta do fator induzível por hipóxia-1 em células tubulares renais cultivadas com hipoperfusão simulada por colocação de lamínula

Contato: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Tomoko Honda¹| Yosuke Hirakawa¹ | Kiichi Mizukami²| Toshitada Yoshihara²| Tetsuhiro Tanaka¹| Seiji Tobita²| Masaomi Nangaku

Abstrato

A hipóxia crônica no tubulointerstício renal desempenha um papel fundamental na progressão da doença crônica.rimdoença(CKD). Portanto, é importante investigar a hipóxia tubular e a atividade do fator induzível por hipóxia (HIF)-1 em resposta à hipóxia. A rarefação do capilar peritubular causa hipoperfusão na DRC; entretanto, o efeito da hipoperfusão sobre os HIFs raramente foi investigado. Induzimos hipoperfusão causada pela colocação de lamínula em humanosrim-2 células e observou um gradiente de oxigênio sob a lamela. A imunocitoquímica do HIF-1 mostrou uma formação em forma de rosquinha na borda de uma área positiva para pimonidazol, que chamamos de "anel HIF". A tensão de oxigênio do anel HIF foi estimada entre aproximadamente 4 mmHg e 20 mmHg. Este resultado não foi compatível com pesquisas anteriores mostrando acúmulo de HIF-1 na faixa anóxica com tensão de oxigênio homogênea. Observamos ainda a presença de um gradiente de pH sob uma lamela, bem como um deslocamento do anel HIF devido a mudanças no pH do meio de cultura, sugerindo que o anel HIF foi formado pela supressão de HIF-1 relacionado para pH baixo. Esta pesquisa demonstrou que a ativação de HIF{10}} imita o estado fisiológico em células cultivadas com hipoperfusão.

PALAVRAS-CHAVEhipoperfusão, hipóxia, fator induzível por hipóxia, gradiente de oxigênio, pH

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1|INTRODUÇÃO

A incidência de doenças crônicasrimdoença(DRC) está aumentando em todo o mundo à medida que as sociedades envelhecem (Tonelli & Riella, 2014). A progressão da DRC é irreversível quando o dano renal atinge um certo grau e, finalmente, resulta em doença renal terminal (DRT), independentemente da doença de base. Este resultado indica a existência de um "caminho final comum". De acordo com análises patológicas anteriores, o declínio da função renal está mais fortemente correlacionado com dano tubulointersticial do que com dano glomerular. Existem vários relatos demonstrando que a fibrose renal induz hipóxia crônica no tubulointerstício, e essa hipóxia tubulointersticial agrava a DRC e leva à DRT. Esta evidência indica que a hipóxia tubulointersticial desempenha um papel na via final comum da DRC (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). orimé altamente suscetível à hipóxia devido à sua alta demanda de oxigênio e à existência de um shunt de oxigênio entre as artérias e veias intrarrenais (Nangaku, 2006; Welch et al., 2001; Zhang et al., 2014). Portanto, consideramos essencial investigar a hipóxia e a resposta à hipóxia no tubulointerstício renal.

A resposta biológica primária à hipóxia em organismos vivos ocorre através da via do fator induzível por hipóxia (HIF) (Hypoxia, 2011; Semenza & Wang, 1992; Zhou et al., 2003). HIF consiste em - e -subunidades. Embora a subunidade - seja constitutivamente ativa, a subunidade - é degradada na presença de oxigênio. Em condições normóxicas, o HIF- é hidroxilado pelo domínio prolil hidroxilase (Ph.D.), tornando-o reconhecível pelo supressor tumoral von Hippel-Lindau (VHL). Este reconhecimento resulta na ubiquitinação e degradação do HIF- hidroxilado no proteassoma. Sob condições hipóxicas, o HIF- se acumula no citosol, porque o HIF- não hidroxilado escapa à degradação. O HIF- acumulado é translocado do citosol para o núcleo, onde se dimeriza com o HIF- e atua como fator de transcrição, promovendo a expressão de genes a jusante. Das três isoformas identificadas de subunidades HIF—HIF-1 , HIF-2 e HIF-3 — as células epiteliais tubulares renais são conhecidas por expressar HIF-1 (Tanaka et al ., 2016). Estudos anteriores mostraram acúmulo transitório ou regional de HIF norimcom DRC (Goldfarb et al., 2006; Yu et al., 2012), e este HIF é ativado na redução da tensão de oxigênio no meio DRC. A má adaptação à hipóxia na DRC pode ser causada pela presença de fatores que suprimem as vias HIF (Asai et al., 2016; Tanaka et al., 2013; Thangarajah et al., 2009). Os efeitos protetores da ativação do HIF foram relatados em vários modelos animais, incluindo ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina e ratos com nefrectomia 5/6 (Deng et al., 2010; Nordquist et al., 2015). Ph.D. inibidores atraíram recentemente a atenção como novas abordagens terapêuticas para a anemia renal em pacientes com DRC (Akizawa et al., 2019; Chen et al., 2017, 2019; Coyne et al., 2017; Miyata et al., 2011; Pergola et al. ., 2016; Provenzano et al., 2016). No entanto, os detalhes da progressão da hipóxia renal e a forma como o acúmulo de HIF ocorre norimcom DRC, permanecem obscuros. A hidroxilação dependente de oxigênio do HIF- ocorre no citosol e, portanto, é importante medir a tensão de oxigênio intracelular e extracelular. Existem vários métodos usados ​​para medir a tensão de oxigênio, incluindo o uso de microeletrodos ou ressonância magnética dependente do nível de oxigênio no sangue (BOLD-MRI). Usamos microscopia de imagem de vida útil de fosforescência (PLIM) para medição quantitativa do status de oxigênio intracelular (Hirakawa et al., 2017; Yoshihara et al., 2015). BTPDM1 é um corante fosforescente baseado no complexo de irídio (III) BTP, (bp)2Ir(acc) (bp=benzoato-piridina, aac=acetilacetona) com um grupo catiônico dimetilamino, que é passivamente distribuídos nos lisossomos intracelulares. Foi sintetizado como uma sonda fosforecente para medir a pressão intracelular de oxigênio (Yoshihara et al., 2015). O PLIM com BTPDM1 possibilitou a aquisição de imagens de alta resolução da pressão parcial de oxigênio em células tubulares renais na superfície renal de camundongos normais, fornecendo dados que indicam a presença de um gradiente de oxigênio, mesmo em rins normais (Hirakawa et al., 2018 ).

Existem gradientes de oxigênio em órgãos vivos, incluindorins, mesmo em condições normais (Hirakawa et al., 2018; Kietzmann, 2017; Zhdanov et al., 2015), e tais gradientes também podem ser esperados na DRC. A hipoperfusão é causada pela rarefação da microvasculatura na DRC, na qual a lesão glomerular progressiva resulta em diminuição do fluxo sanguíneo capilar peritubular, agravando a fibrose intersticial. A fibrose intersticial prejudica a difusão e o suprimento de oxigênio para as células tubulares e leva à rarefação da microvasculatura, agravando ainda mais a hipóxia tubulointersticial (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Os efeitos biológicos da hipoperfusão, no entanto, permanecem obscuros, porque a maioria dos estudos investigou os efeitos da hipóxia e HIF-1 em células cultivadas sob condições de perfusão homogênea e tensão de oxigênio (Rexius-Hall et al., 2017). Estudos anteriores demonstraram que as células cultivadas em monocamada cobertas com uma lamela fornecem um bom modelo de hipoperfusão induzida por uma barreira à difusão no meio de cultura. A hipoperfusão modelada está associada a um gradiente de oxigênio porque uma lamela impede a difusão de oxigênio do topo do meio para as células (Pitts & Toombs, 2004; Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015). Em uma monocamada de células cultivadas cobertas com uma lamela, a tensão de oxigênio intracelular cai com a distância da borda da lamela devido à difusão limitada de oxigênio nas células cultivadas. Como resultado, um gradiente de oxigênio é formado da borda para o centro da lamela, e a tensão de oxigênio intracelular pode cair para uma faixa anóxica no centro da lamela (Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015). . No presente estudo, focamos na ativação do HIF e investigamos se há uma mudança independente de oxigênio na expressão do HIF na presença de hipoperfusão com gradiente de oxigênio. Uma vez que existe hipoperfusão com gradiente de oxigênio nos túbulos renais in vivo, a observação de efeitos independentes de oxigênio na expressão de HIF no modelo de lamínula pode fornecer informações sobre o mecanismo subjacente à insuficiência do acúmulo de HIF na DRC.

extrato de cistachepara rim

2|MATERIAIS E MÉTODOS

2.1|Cultura de células

As células cultivadas foram incubadas em uma incubadora umidificada com 5% de CO2. A incubação hipóxica foi realizada em uma incubadora pessoal de CO2/multigás APM-30D (Astec). A anoxia foi induzida com uma bolsa de anoxia, AnaeroPack e conjuntos de cultivo anaeróbico #A-13 (Mitsubishi Gas Chemical).

Células HK-2 (Homo sapiens, humanosrim, masculino, CRL- 2190, ATCC, RRID: CVCL_0302), uma linha de células epiteliais do túbulo proximal imortalizada de rim humano adulto normal, foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco/mistura de nutrientes F{{2} } Presunto (DMEM/F12) (D8062, Sigma Aldrich) contendo 10 por cento de soro fetal bovino (FBS) (F7524, Sigma Aldrich) e solução de penicilina-estreptomicina (15070063, Thermo Fisher Scientific) em uma placa de cultura de 10 cm. Para passagem, as células HK{10}} foram dissociadas com tripsina ({11}}, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e centrifugadas a 300 g por 5 min.

Células de câncer do colo do útero HeLa e embriões humanosrimas células 293 (HEK293) foram cultivadas em DMEM com glicose baixa (1000 mg/L) (D6046, Sigma Aldrich) contendo 5 por cento de FBS em uma placa de cultura de 10 cm. Estas células foram passadas como células HK-2.

As células epiteliais do túbulo proximal renal (RPTECs) (CC- 2553, Cambrex) foram mantidas usando kits RenaLifeTM Comp (LRC-LL0025, Lonza Ltd.). Para passagem, os RPTECs foram dissociados usando tripsina, neutralizados com Solução Neutralizante de Tripsina (CC-5002, Lonza Ltd.) e centrifugados a 200 g por 5 min.

2.2|Estabelecimento de um modelo de hipoperfusão por uma colocação de lamínula

As lamínulas redondas de 15 mm de diâmetro (C015001, Matsunami) foram limpas com ultrassom e armazenadas em etanol 99,5% antes do uso. Dois métodos foram empregados, baseados na observação de células fora da lamínula.

As células cultivadas em monocamada foram colocadas entre uma lamela e o fundo de um prato (Figura S1a,b), ou um método alternativo (Figura S1c), conforme descrito abaixo. O método tradicional ou alternativo foi selecionado para estabelecer nosso modelo de lamínula para imagens ao vivo, sejam imagens de oxigênio ou imagens de PH. Para a imunocitoquímica (ICC), optou-se pelo método alternativo, pois quando se utiliza o método tradicional, a maioria das células frequentemente se desprende do fundo da placa durante a retirada da lamínula para fixação das células (Figura S2a).

2.2.1|Método tradicional

No Dia 1, as células foram colocadas no fundo de um prato à base de vidro de 27 mm (3910-035, Iwaki) a uma confluência de 100 por cento * (aproximadamente 5,0 × 105/prato). Eles foram cultivados em DMEM/F12 contendo 10 por cento de FBS sem solução antibiótica durante a noite. No Dia 2, uma lamela foi colocada sobre as células cultivadas pelo período indicado (Figura S1b).

2.2.2|Método alternativo

As células foram semeadas em uma lamela em um prato de cultura de 35 mm a 100 por cento de confluência (aproximadamente 5,0 × 105/prato) no dia.

1. Eles foram cultivados em DMEM/F12 contendo 10 por cento de FBS sem solução antibiótica durante a noite. No Dia 2, a lamínula foi invertida, para fixar a superfície de suas células ao fundo de uma nova placa de vidro de 27 mm por um período especificado (Figura S1c).

Também criamos um modelo de lamínula usando lamínulas redondas com diâmetro de 10 mm (CS01005, Matsunami) (Figura S2b).

2.3|Imagens de oxigênio ao vivo com BTPDM1

As células cultivadas foram preparadas no Dia 1, conforme descrito acima. No Dia 2, as células foram lavadas duas vezes com solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS) (H8264, Sigma Aldrich) e incubadas com 500 nM BTPDM1, um corante lipofílico catiônico à base de irídio usado como uma sonda fosforescente intracelular (Yoshihara et al., 2015), em DMEM/F12 sem vermelho de fenol (21041-025, Thermo Fisher Scientific) por 30 min. Depois que as células foram lavadas duas vezes com HBSS, elas foram ensanduichadas entre uma lamínula e o fundo de uma placa, conforme descrito acima. A intensidade da fosforescência de BTPDM1 em células cultivadas cobertas com uma lamela foi observada usando um filtro de excitação e emissão, e a fosforescência de BTPDM1 (Hirakawa et al., 2015) foi detectada usando um microscópio de fluorescência, BZ-X710 (Keyence Corporation). As imagens obtidas do microscópio fluorescente invertido foram ajustadas para brilho e contraste usando o software de análise BZ-X.

2.4|Imunocitoquímica

As células em uma lamínula foram cultivadas com 200 µM de pimonidazol HCl (HP3-100, Hypoxyprobe, Inc.) em DMEM/F12 sem vermelho de fenol por 1 h, após o que a lamínula foi virada e anexada a uma placa de vidro de cobertura, como descrito anteriormente. As células foram então cultivadas em DMEM/F12 sem vermelho de fenol por um período especificado. Quando a contracoloração com pimonidazol não foi usada, o pré-tratamento com pimonidazol foi omitido.

Após o término do período de cultivo, cada lamínula foi coletada e as células foram imediatamente fixadas com metanol/acetona (1:1) em gelo, onde permaneceram por 30 min. Após lavar duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) de Dulbecco (D5652, Sigma Aldrich), a membrana celular foi permeabilizada por 30 min, incubada com 5% de albumina de soro bovino (BSA) (A3059, Sigma Aldrich) por 30 min e, posteriormente, com bloco de proteína sem soro (X0909, DAKO) por 10 min. As células foram coradas com um primeiro anticorpo e subsequentemente com um segundo anticorpo fluorescente. A lista dos primeiros anticorpos é apresentada na Tabela S1. A imunoglobulina policlonal anti-coelho FITC-suíno (F0205, diluição 1:20, DAKO) foi usada como o primeiro anticorpo se o hospedeiro fosse um coelho. O anticorpo fluorescente Alexa Fluor 594 estreptavidina (S11227, diluição 1:500, Thermo Fisher Scientific) foi usado como o primeiro anticorpo se o hospedeiro fosse um camundongo, seguido por IgG anti-camundongo biotinilado (H mais L) (BA{{23} }, diluição de 1:1000, Vector Laboratories), como o segundo anticorpo. A coloração nuclear foi realizada usando tricloridrato de bisBenzimida H 33342 (B2261, Sigma Aldrich) para cada amostra.

Os sinais fluorescentes foram observados usando um microscópio fluorescente invertido, BZ-X710 (Keyence Corporation) com os seguintes filtros: Texas Red com um comprimento de onda de excitação (Ex) de 560/40 nm, comprimento de onda de emissão (Em) de 630/75 nm, GFP ( Ex: 470/40 nm, Em: 525/50 nm) e DAPI (Ex: 360/40 nm, Em: 460/50 nm). As imagens foram ajustadas para brilho e contraste usando o software de análise BZ-X.

2.5|ICC de HIF de células HK-2 tratadas com cloreto de cobalto

O método alternativo foi modificado para produzir um modelo de lamínula de células HK-2 tratadas com cloreto de cobalto. As células HK-2 foram semeadas em densidade semiconfluente (2,5 × 105/prato) em uma lamela no Dia 1 e tratadas com 300 µM de cloreto de cobalto hexahidratado (C 8661, Sigma Aldrich) por 16 h em Dia 2. No Dia 3, a lamínula foi invertida para fixar as superfícies das células ao fundo de uma nova placa de vidro de 27 mm por 3 h, e o ICC de HIF foi realizado.

2.6|Western blotting

Para investigar o acúmulo de HIF{{0}} sob diferentes tensões de oxigênio e em diferentes níveis de pH, 1.0 × 106 HK-2 células por placa de cultura de 10 cm foram incubados sob normóxia, 2 por cento de oxigênio, 1 por cento de oxigênio ou anóxia, por 5 h, ou em DMEM/F12 a pH 7,4, pH 6,0 ou pH 5,0 por 5 h.

Estas células foram lisadas em tampão RIPA contendo tampão Tris 50 mM (pH 8.0), NaCl 150 mM, 0,5 p/v por cento de sódio desoxicolato, 0,1 por cento p/v de SDS e 1,0 por cento p/v de NP40.

Para Western blotting, tampão de amostra SDS contendo {{0}},35 M Tris-HCl (pH 6,8), 10 por cento de SDS, 36 por cento de glicerol, 0,012 por cento de azul de bromofenol e 0,1 M de ditiotreitol (DTT) foi adicionado às proteínas. As proteínas contendo tampão de amostra SDS foram eluídas por fervura a 95 graus por 5 min.

As proteínas foram separadas por eletroforese em géis de poliacrilamida SDS 10 por cento. As proteínas foram então transferidas para uma membrana AmershamTM HybondTM PVDF (10600023, GE Healthcare) em tampão de transferência (tampão de base Tris 48 mM, glicina 39 mM, SDS 0,04 por cento e metanol 20 v/v por cento) usando um Trans-Blot® Sistema de Transferência TurboTM (Bio-Rad). As membranas foram incubadas à temperatura ambiente com anticorpos primários, anticorpo anti-HIF1 (NB100-134, diluição 1:500, Novus Biologicals, RRID: AB_350071) e anticorpo anti-actina (A2066 , diluição 1:2000, Sigma Aldrich, RRID: AB_476693), e posteriormente no anticorpo secundário, imunoglobulina anti-coelho de cabra policlonal/HRP (P0448, diluição 1:10000, DAKO, RRID: AB{{26 }}). O Substrato de Western Blotting PierceTM ECL Plus (32132, ThermoFisher Scientific) foi usado para detecção. A quimioluminescência foi observada usando um analisador Luminoimage ImageQuantLAS4000mini (GE Healthcare). A reprodutibilidade foi confirmada pela realização de pelo menos três experimentos independentes. A intensidade das bandas foi quantificada usando o software National Institutes of Health ImageJ (Schneider et al., 2012).

2.7|Ensaio de repórter de luciferase

Um ensaio repórter de luciferase foi realizado para medir o acúmulo de HIF1 na incubação de cultura hipóxica homogênea. Anteriormente, construímos um gene marcado da luciferase impulsionado por um elemento responsivo à hipóxia (HRE) e desenvolvemos o Vector Repórter responsivo à hipóxia (Construção Transgene). Este foi construído a partir de cópias em tandem do HRE do gene do fator de crescimento endotelial vascular de rato subclonado na região 5' da unidade de transcrição am CMV-promotor-luciferase (pré-Luc) (Chiang et al., 2011; Tanaka et al., 2004).

Células HK{{0}} em uma concentração de 1,0 × 105 por poço foram preparadas em 12-placas de cultura de poço (150628, Thermo Fisher Scientific). As células foram co-transfectadas com 500 ng de vetores de pGL3-Basic HRE-luciferase e 30 ng de vetores de controle de luciferase pRL-SV40 Renilla (Promega), usando 2 µl de reagente de transfecção FuGENE® HD (E2311, Promega) por Nós vamos. Células HK-2 cotransfectadas com 500 ng de pGL3-Vetores básicos de luciferase de vaga-lume e 30 ng de vetores de controle de luciferase pRL-SV40 Renilla (Promega) foram usados ​​como controle negativo.

As células transfectadas foram incubadas sob normóxia, 2 por cento de hipóxia, 1 por cento de hipóxia ou uma bolsa de anoxia, por 5 h. As células foram então colhidas usando 100 µl de tampão de lise de proteína passiva, para o ensaio de luciferase dupla. Um luminômetro LB9507 (EG e Berthold) foi usado para as medições. Para corrigir a eficiência de transfecção, o valor relativo da unidade de luz da luciferase do pirilampo foi dividido pelo da luciferase de Renilla.

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2.8|Análise de apoptose

As células cultivadas foram cobertas com uma lamela por 0 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h e 24 h, e então coletadas usando tripsina. Células tratadas com 3 por cento de peróxido de hidrogênio (081- 04215, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) por 30 min foram preparadas como controle apoptótico. A análise quantitativa da apoptose foi realizada utilizando Muse Annexin V e Dead Cell Kits (MCH100105, Millipore) em um Muse™ Cell Analyzer (Millipore), de acordo com as instruções do fabricante.

2.9|PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR)

A extração de RNA total e a síntese de cDNA foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante para RNAiso Plus (9109, Takara) e PrimeScript™ RT Master Mix (RR036B, Perfect Real Time) (Takara), respectivamente. Real-time PCR foi realizado usando THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (QPS- 201, Toyobo) no CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). Os níveis de transcrição foram normalizados para o nível de expressão de mRNA de -actina. qRT-PCR foi realizado em triplicado usando primers específicos de genes. O HIF-1 foi amplificado usando iniciadores diretos, 5'-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3' e reversos, 5'-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3''. -actina foi amplificada usando primers 5'-TCCCCCAACTTGA GATGTATGAAG-3' direto, e 5'-AACTGGTCTCAAG TCAGTGTACAGG-3' reverso.

2.10|Transfecção com siRNA

Para investigar o knockdown de HIF-1 induzido por RNAi em células HK-2, 5.0 × 104 HK-2 células por poço foram preparadas em placas de seis poços. Dois tipos de RNAi—HIF-1 siRNA (siHIF-1 #1 [HSS104774, Thermo Fisher Scientific] e siHIF-1 #2 [HSS104775, ThermoFisher Scientific])—foram usados ​​com Lipofectamine RNAiMAX Reagente de Transfecção (Thermo Fisher Scientific). Como controle negativo, foi usado Stealth RNAi™ siRNA Negative Control Med GC Duplex #3 (12935-113); 1,5 µl de cada siRNA e 5 µl de RNAiMAX foram misturados. As células transfectadas com siRNA foram incubadas sob condições normóxicas ou hipóxicas (1 por cento O2) por 48 h e o RNA foi extraído. A eficiência de knockdown de-HIF-1 foi examinada usando qRT-PCR.

2.11|Imagens ao vivo de efeitos de um gradiente de PH

Visualizamos o gradiente de pH intracelular de células vivas sob uma lamela. As células foram tratadas com pHrodo Green AM Intracellular pH Indicator (p35373, ThermoFisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante, antes de implementar o modelo de lamínula. Um microscópio de fluorescência invertido, BZ-X710 (Keyence Corporation) com um filtro GFP foi usado para observar a transição de tempo do gradiente de intensidade de fluorescência sob uma lamela.

2.12|Análise quantitativa do anel HIF

2.12.1|Local do anel HIF

Medimos a distância dos anéis de HIF e áreas positivas para pimonidazol das bordas da lamínula usando ImageJ, como segue. As áreas dos círculos externo e interno do anel HIF e do círculo positivo para pimonidazol foram determinadas e o raio de cada círculo foi calculado. Cada valor foi subtraído de 7,5 mm, que é o raio de uma lamínula de 15 mm, para calcular sua distância de uma borda de lamínula. Três experimentos independentes de ICC de HIF em cada condição foram realizados.

2.12.2|Definição do anel HIF

Usamos imagens fluorescentes obtidas de um modelo de lamínula incubado sob normóxia e pH neutro. Definimos o local do anel HIF e sua parte externa e interna como 2,5–3.0 escala (0,22–0,45 mm), 0,5 –1.0 escala (1,12– 1,35 mm) e 5.0–5,5 escala (2,24–2,47 mm) de uma borda de lamínula, respectivamente, usando ImageJ. Medimos cinco sites de sinais HIF-1 por amostra e calculamos a média. Três experimentos independentes de ICC de HIF foram realizados.

pó de extrato de cistache

2.13|Medição da pressão de oxigênio por imagem PLIM

2.13.1|Construção de uma linha de calibração para medir a pressão de oxigênio

Uma curva de calibração de células HK-2 foi feita, com base no método descrito em nosso relatório anterior (Yoshihara et al., 2015). Células HK-2 carregadas com 500 nM BTPDM1 por 30 min foram cultivadas em uma incubadora multigás de concentração de oxigênio variável equipada com um microscópio fluorescente invertido que foi conectado ao sistema de medição de vida útil. Uma linha de calibração baseada em análises de Stern-Volmer foi construída usando o tempo de vida de fosforescência (PL) de células HK{10}} sob várias tensões de oxigênio diferentes usando

Equação (1)

onde τp representa o PL em pO2, τ0 representa o PL na desoxigenação, kq representa a constante de taxa de extinção e pO2 representa a pressão parcial de oxigênio. Usando esta linha de calibração, a pressão de oxigênio pode ser calculada a partir do PL.

2.13.2|imagem PLIM de um modelo de lamínula

Células HK-2 carregadas com 500 nM BTPDM1 por 30 min foram preparadas. Um modelo de lamínula foi construído e cultivado em uma incubadora multigás de concentração variável de O2 equipada com um microscópio fluorescente invertido, conectado ao sistema de medição de vida útil.

As imagens de microscopia de imagem com vida útil de fosforescência (PLIM) foram gravadas usando um microscópio de fluorescência invertido equipado com um sistema de varredura confocal (Hirakawa et al., 2018). As imagens PLIM foram obtidas após 30 minutos de incubação em 21 por cento de O2 ou 4 por cento de O2. Quatro imagens PLIM por amostra, das regiões superior, inferior, esquerda e direita próximas à borda da lamínula, foram obtidas para determinar o PL médio, levando em consideração a variação de PLs em uma lamínula.

2.13.3|Identificação do anel HIF em uma imagem PLIM

Pimonidazol foi positivo abaixo de 10 mmHg de pressão de oxigênio. O PL equivalente de 10 mmHg de pressão de oxigênio foi de 4.034,6 ns, de acordo com a linha de calibração, de modo que a linha externa do círculo de pimonidazol na imagem PLIM pôde ser identificada. Posteriormente, os locais dos anéis HIF externo e interno na imagem PLIM podem ser encontrados usando análise quantitativa de distância. Medimos a faixa de PLs médios equivalentes ao anel HIF em 21% de O2 e 4% de O2.

2.13.4|Medição da pressão de oxigênio do anel HIF

Calculamos a faixa de pressões de oxigênio do anel HIF a partir dos PLs, usando a linha de calibração. As imagens PLIM foram analisadas usando SPCImage 5.0 (Becker & Hickl GmbH).

2.14|Análise estatística

O teste de Dunnett foi usado para comparar os grupos experimental e controle, e valores < 0,05="" foram="" considerados="" para="" indicar="" diferenças="" estatisticamente="" significativas.="" o="" teste="" t="" de="" student="" foi="" usado="" para="" comparar="" três="" ou="" mais="" grupos,="" e="" o="" valor="" de="" p="" ajustado="" de="" bonferroni="" foi="" aplicado.="" todas="" as="" análises="" estatísticas="" foram="" realizadas="" usando="" jmp="" pro="" ver13.2.1="" (sas).="" os="" valores="" foram="" assumidos="" como="" derivados="" de="" uma="" população="" com="" distribuição="" normal="" e="" são="" mostrados="" como="" média="" ±="" desvio="" padrão="">

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3|RESULTADOS

3.1|Formação de gradiente de oxigênio no modelo de hipoperfusão

Confirmamos a existência de um gradiente de oxigênio no modelo de hipoperfusão induzida pela colocação de lamínula, avaliando diretamente a tensão de oxigênio, usando fosforescência. A medição da intensidade da fosforescência pode prever uma tendência aproximada na pressão de oxigênio (Hirakawa et al., 2015; Yoshihara et al., 2015). Observamos a intensidade de fosforescência de um modelo de lamínula de células HK-2 tratadas com BTPDM1. As imagens da intensidade de fosforescência mostraram hipóxia na maior parte da área dentro da lamínula, mas nenhuma hipóxia perto da borda, uma observação que sugeriu a existência de um gradiente de oxigênio ao redor da borda da lamela em células HK-2 cobertas com uma lamínula (Figura 1a). Como a intensidade da fosforescência depende da concentração da sonda e do tempo de excitação, a medição do tempo de vida da fosforescência (PL) é útil para a análise quantitativa da pressão de oxigênio (Yoshihara et al., 2015). Assim, para a medição quantitativa da tensão de oxigênio de células cultivadas ao redor da borda de uma lamela, obtivemos imagens PLIM de células HK-2 cobertas com uma lamínula por 30 min (Figura 1b). PL estendido à medida que a distância da borda da lamínula aumentou. Confirmamos que a tensão de oxigênio, calculada usando uma linha de calibração (Figura S3), diminuiu à medida que a distância da borda da lamínula aumentou, evidenciando a existência de um gradiente de oxigênio ao redor da borda da lamínula (Figura 1c). O exame do perfil temporal da intensidade de fosforescência indicou que o gradiente de oxigênio começou a se formar 10 minutos após a colocação da lamínula

(Figura 1d).

3.2|Distribuição exclusiva de HIF-1 no modelo de hipoperfusão,"anel de HIF"

Examinamos a distribuição HIF-1 no modelo de hipoperfusão com um gradiente de oxigênio. O ICC de HIF-1 em células HK-2 mostrou um realce em forma de rosquinha na borda da área positiva para pimonidazol, que chamamos de "anel HIF" (Figura 2a). A intensidade do sinal HIF-1 foi significativamente maior no anel HIF do que em suas áreas internas ou externas (Figura 2b). Este fenômeno foi confirmado usando ICC com outro anticorpo HIF-1 (Figura S4a) ou outras linhas celulares tubulares (Figura S4b,c). Também realizamos análises ICC de HIF-1 em outros tipos de células cultivadas, como células de câncer cervical HeLa. Embora a fraca adesão dessas células a uma lamela tenha dificultado uma avaliação detalhada da distribuição de HIF-1, observamos um aprimoramento em forma de rosquinha de HIF-1 em células HeLa (Figura S4d).

O anel HIF e a área positiva para pimonidazol começaram a se formar várias horas após a colocação da lamínula, e o anel HIF apareceu estático por 3 h (Figura 2c). O knockdown HIF-1 resultou no desaparecimento do sinal HIF-1 , incluindo o anel HIF (Figura 2d, Figura S4e), indicando que o anel HIF era dependente de HIF-1 .

Para investigar a possibilidade de que a formação do anel HIF seja dependente de oxigênio, investigamos a distribuição de HIF-1 no modelo de lamínula sob incubação com diferentes tensões de oxigênio. Colocamos um prato em câmaras hipóxicas com diferentes tensões de oxigênio imediatamente após fazer um modelo de lamínula. Durante a incubação hipóxica, observamos que tanto o anel HIF quanto a área positiva para pimonidazol pareciam se expandir para fora (Figura 3a). Medimos a distância de cada anel HIF e área positiva para pimonidazol de uma borda de lamínula sob normóxia, 4 por cento de O2 e 1 por cento de incubação de O2. Tanto o anel HIF quanto a área positiva para pimonidazol expandiram-se para fora à medida que a tensão de oxigênio circundante diminuiu (Figura 3b). Esses resultados indicaram que o anel HIF era dependente de HIF{10}} e tensão de oxigênio.

Para confirmar que o acúmulo em forma de rosquinha é um fenômeno específico do HIF, realizamos ICC com genes de manutenção no modelo de lamínula. Os sinais de GAPDH e actina foram mantidos em toda a área de uma lamela e foram comparáveis ​​entre a região do anel HIF e as demais regiões (Figura S5a,b).

3.3|Medição da faixa de pressão de oxigênio do anel HIF

Confirmamos o aumento em forma de anel do acúmulo de HIF-1 em células cultivadas cobertas com uma lamela, um fenômeno dependente da tensão de oxigênio. Para determinar a faixa de tensão de oxigênio envolvida, analisamos a pressão de oxigênio do anel HIF usando uma técnica de vida útil de fosforescência. Obtivemos imagens PLIM do modelo de lamínula após 30 min de incubação em 21 por cento de O2 ou 4 por cento de O2 (Figura 4a). O anel HIF formado na borda do círculo de pimonidazol no ICC do HIF (Figura 3b). Identificamos o sítio na imagem PLIM que era equivalente à área positiva para pimonidazol no ICC do HIF e posteriormente identificamos o sítio correspondente ao anel HIF (Figura 4b), usando análise quantitativa dos dados de distância do anel HIF e do área positiva para pimonidazol (Figura 3b). Também medimos a faixa de PLs do anel HIF e, em seguida, usamos uma linha de calibração (Figura S3) para calcular a pressão de oxigênio do anel HIF em 21 por cento de O2 (4,20 [3,46–4,97] ~35,9 [28,5–44,9] mmHg) , e 4 por cento de O2 (2,19 [0,21–4,32] ~20,4 [17,1–24,1] mmHg) (Figura 4c).

3.4|Acúmulo de HIF-1 sob tensão homogênea de oxigênio

Enquanto sinais fracos de HIF-1 fora do anel HIF em um modelo de lamínula podem ser atribuídos a hipoxia insuficiente, aqueles dentro do anel, onde HIF-1 deveria ter sido mais fortemente ativado pela menor tensão de oxigênio, devem ser controlado por um fenômeno independente de oxigênio. Para examinar os fenômenos que causam a falta de acúmulo máximo de HIF-1 na área anóxica ocorrendo apenas no modelo de hipoperfusão, examinamos se havia uma relação inversa entre a tensão de oxigênio e o acúmulo de HIF-1 sob incubação com tensão de oxigênio homogênea. A análise de Western blot de lisados ​​celulares sob diferentes tensões homogêneas de oxigênio mostrou um aumento no acúmulo de HIF-1 durante a incubação anóxica (Figura 5a). O ensaio repórter HRE-luciferase também indicou que o acúmulo de HIF-1 foi aumentado com menor tensão de oxigênio sob condições de tensão de oxigênio homogênea (Figura 5b). Esses resultados indicaram que o acúmulo de HIF{10}} era dependente da tensão de oxigênio, com o acúmulo máximo observado na faixa anóxica. As características do HIF-1 devem variar entre um modelo de hipoperfusão e um modelo com tensão de oxigênio homogênea. Especulamos que o fenômeno único de acúmulo de HIF-1 neste modelo de hipoperfusão pode ser determinado por um fator diferente da tensão de oxigênio.

3.5|A formação do anel HIF foi independente do PhD

Examinamos se a degradação do HIF-1, um possível mecanismo de formação do anel HIF, foi regulada positivamente dentro do anel HIF. Essa ideia parecia inválida, porque a hidroxilação por Ph.D., um processo limitante da degradação do HIF, requer oxigênio como substrato. O cloreto de cobalto é amplamente utilizado como estabilizador químico de HIF. Construímos um modelo de lamínula de células HK-2 tratadas com cloreto de cobalto e realizamos análise ICC de HIF. O sinal HIF-1 não aumentou dentro do anel HIF, o que ficou obscuro devido ao aumento do sinal de HIF-1 fora do anel (Figura 6c). O ICC de células HK-2 com knockdown de PHD2, que se acredita ser a prolil hidroxilase HIF primária em experimentos de cultura de células (Strowitzki et al., 2019), produziu resultados semelhantes (Figura S6). Esses resultados indicaram que o eixo PHD-VHL de degradação de HIF não estava relacionado à formação do anel de HIF.

3.6|Impacto do pH no acúmulo de HIF-1

Um relatório anterior descreveu o uso de um modelo de lamínula de miócitos cardíacos que tiveram uma queda no pH dentro da lamela (Pitts & Toombs, 2004). Investigamos o pH sob uma lamela e seu impacto na formação do anel HIF. Tratamos as células HK-2 com um indicador de pH intracelular, cuja intensidade de fluorescência permite a avaliação do pH nas células. Imagens ao vivo mostraram que o pH diminuiu na maior parte da área interna, mas não perto da borda da lamínula, sugerindo a existência de um gradiente de pH ao redor da borda no modelo de lamínula (Figura 6a). A análise quantitativa da correlação entre intensidade de fluorescência e distância de uma borda de lamínula mostrou que a primeira foi elevada à medida que a distância aumentou, uma observação que apoiou a existência de gradientes de pH e oxigênio ao redor da borda da lamínula (Figura 6b). A análise de Western blot de lisados ​​celulares sob concentrações homogêneas de oxigênio descobriu que a incubação com meio de pH 5,0 suprimiu a acumulação de HIF-1 sob condições hipóxicas (Figura S7a–d). Também confirmamos que o acúmulo de HIF-1 sob hipóxia sob diferentes condições de pH diminuiu abaixo de pH 6,0 (Figura S8a–c).

Um relatório enfatizou a importância de condições levemente ácidas, com pH em torno de 6.0. De acordo com este estudo, a reoxigenação após hipóxia acidificou o meio, o que causou o sequestro nucleolar do VHL. Por sua vez, a degradação do HIF foi prevenida em miotubos C2C12, neurônios PC12 e células cancerosas renais 786-0 (Mekhail et al., 2004). Em nosso estudo, não houve alteração na distribuição de VHL em células tubulares entre as regiões com acúmulo de HIF-1 e aquelas em que foi suprimido, em um modelo de lamínula com valores de pH de 5.0 a 7,4 (Figura S9a–c). As células tubulares estão expostas a uma ampla gama de condições de pH (Burke et al., 1999; Pavuluri et al., 2019; Raghunand et al., 2003), por isso investigamos a variação do anel HIF em meios de diferentes pH valores entre 5,0 e 8,5. O anel HIF foi claramente observado em meios com pH 8,5 e 7,4 (Figura 6c). O anel HIF também existia em pH 6,5, mas estava obscurecido (Figura 6c). O sinal HIF-1 foi atenuado em toda a área de uma lamela em pH 5,0. (Figura 6c). Realizamos uma análise quantitativa adicional da relação posicional entre o anel HIF e a borda da área positiva para pimonidazol (Figura 7a) e descobrimos que a posição do anel variava dependendo do pH. O círculo interno tendeu a se expandir para fora em pH 6,5, em comparação com pH 7,4, enquanto o círculo externo encolheu significativamente para dentro em pH 8,5, com base na borda da área positiva de pimonidazol (Figura 7b,c). Também confirmamos que as atividades dos genes de manutenção foram mantidas em um modelo de lamínula sob incubação ácida (Figura S10). Portanto, o pH parece desempenhar um papel importante no mecanismo subjacente à formação do anel HIF.

4|DISCUSSÃO

Neste estudo, identificamos uma distribuição única de HIF-1 em células tubulares renais, usando um modelo de hipoperfusão induzida pela colocação de lamínula. Descobrimos que a formação e a manutenção do anel HIF foram reguladas pela pressão de oxigênio e pH, os quais existiam em um gradiente na borda da lamínula de um modelo de lamínula. Com base nesses resultados, propomos um possível mecanismo para a formação do anel HIF, envolvendo HIF-1 acumulando com a diminuição da tensão de oxigênio, e o acúmulo sendo suprimido devido ao baixo pH dentro de uma certa distância de uma borda de lamínula (Figura 8 ).

A hipoperfusão é induzida pela rarefação da microvasculatura na DRC (Mimura & Nangaku, 2{{20}}10; Nangaku, 2006). Em nosso trabalho anterior, usamos imagens in vivo para demonstrar a presença de um gradiente de oxigênio em células tubulares renais de rins normais de camundongos (Hirakawa et al., 2018). Espera-se também que a tensão de oxigênio seja heterogênea nas células tubulares na DRC. No entanto, ainda não está claro se a existência de hipoperfusão com gradiente de oxigênio afeta o sistema de defesa contra hipóxia, HIF. Neste estudo, investigamos a distribuição de HIF em células tubulares proximais cultivadas sob um modelo de hipoperfusão e descobrimos que o gradiente de oxigênio em células tubulares renais cultivadas foi modelado com sucesso usando uma lamela de vidro redondo. Evidências de experimentos usando tensão homogênea de oxigênio indicaram que HIF-1 , cuja hidroxilação e subsequente degradação são principalmente dependentes de oxigênio, se acumulou. Essa é a quantidade de HIF-1 que aumenta à medida que a tensão de oxigênio diminui. Em nosso modelo de lamínula, no entanto, HIF-1 foi suprimido na área anóxica e teve o maior acúmulo a uma certa distância de uma borda de lamínula. Este acúmulo de HIF em forma de rosquinha nunca foi mostrado antes. Mostramos que o movimento do anel HIF pode ser observado independentemente da tensão de oxigênio da atmosfera de incubação, mas sua localização depende da tensão de oxigênio. A faixa de tensão de oxigênio no anel HIF foi medida em aproximadamente 4–20 mmHg usando PLIM com BTPDM1. A maioria dos estudos anteriores, focados em células cultivadas em uma atmosfera com uma tensão de oxigênio homogênea, descobriu que a quantidade de proteína HIF{12}} aumentou nas faixas hipóxicas ou anóxicas (Ameri et al., 2002; Carrera et al. , 2014). Assim, em nosso modelo, a formação do anel HIF deve ter sido afetada por um fator diferente da tensão de oxigênio; era independente do Ph.D., um processo limitante da taxa de degradação do HIF. Um avanço na elucidação do mecanismo de formação do anel HIF foi a nossa descoberta do papel do gradiente de pH, bem como o gradiente de oxigênio, no modelo de lábio coberto, que limitou o influxo do meio semelhante a uma hipoperfusão in vivo modelo. Neste modelo de hipoperfusão, o pH intracelular diminuiu à medida que a distância da borda da lamínula aumentou, e um gradiente de pH foi observado ao redor da borda da lamínula. Mostramos que o acúmulo de HIF-1 foi suprimido em pH baixo, em torno de pH 5,0, em comparação com a incubação em pH neutro sob tensão de oxigênio homogênea. A borda externa do anel HIF expandiu para fora em pH 6,5, e a borda interna do anel HIF encolheu para dentro em pH 8,5, com base na borda da área positiva para pimonidazol. O anel HIF foi obscurecido sob condições ácidas e o sinal HIF-1 desapareceu em pH 5,0. Assim, elucidamos a importância do pH para a formação do anel HIF em um modelo de lamínula. Demonstramos a possibilidade de que o anel HIF foi formado pela supressão do acúmulo de HIF-1 pelo baixo pH dentro do anel.

Vários estudos anteriores usando o método de lamínula usaram células cancerígenas. De acordo com um relatório usando a linha celular de hepatoma humano Hep3B, que expressa o desvio para o vermelho dependente de oxigênio da proteína fluorescente verde (AcGFP1), imagens ao vivo de células cobertas com uma lamela retangular mostraram um desvio para o vermelho à medida que a distância de uma borda de lamínula aumentou (Takahashi & Sato, 2010). O espectro de emissão das células do hepatoma mudou do comprimento de onda da fluorescência da proteína fluorescente verde (GFP) para o vermelho à medida que a tensão de oxigênio diminuía. Em outro estudo, a tensão de oxigênio de células SCC-7 com uma lamela redonda de 15-mm foi medida usando uma técnica de vida útil de fosforescência. A tensão de oxigênio foi de 6,9 ​​mmHg e 166 mmHg, calculada a partir do PL, que foi de 3,89 µs e 893 µs, 0–2 mm dentro e 0–1 mm fora da borda da lamínula, respectivamente (Yoshihara et al., 2015). O método de lamínula também tem sido usado com miócitos cardíacos, um sistema que tem atraído atenção como um modelo promissor de isquemia-reperfusão in vivo. Kelly et al mostraram que os miócitos cobertos com uma lamínula sofreram alterações morfológicas marcantes ao longo do tempo, acompanhadas de alterações no potencial de membrana mitocondrial e na dinâmica da membrana plasmática, resultando eventualmente na morte do miócito. Eles também demonstraram que o pH intracelular de miócitos cobertos com uma lamela cai rapidamente para aproximadamente pH 4 no centro de uma lamela (Pitts & Toombs, 2004). Um modelo de lamínula, inibindo oxigênio ou difusão nutricional para células cultivadas sob uma lamela, pode imitar um modelo in vivo de zonas isquêmicas, normais e marginais no centro, fora e na borda de uma lamela, respectivamente. Vários estudos utilizaram este modelo como modelo de isquemia-reperfusão de miócitos in vitro (Chun et al., 2015; Pitts et al., 2008; Solhjoo & O'Rourke, 2015; Wang et al., 2012). Até onde sabemos, nosso estudo é o primeiro a aplicar um método de lamínula a células tubulares. Em nosso sistema, a distância de uma borda de lamínula a uma região equivalente a 10 mmHg de tensão de oxigênio, onde o pimonidazol deveria se tornar positivo, foi de 1,22 mm, e a tensão de oxigênio diminuiu para zero a uma distância de 2 mm da borda da lamínula. . Esse resultado pode ser compatível com relatos anteriores usando lamínulas em torno de 15 mm, demonstrando a existência de um gradiente de oxigênio de pelo menos 2 mm da borda (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Examinamos a taxa de apoptose de células sob lamínulas (Figura S11) e descobrimos que GAPDH e actina foram mantidos mesmo dentro do anel HIF, indicando que o anel HIF não foi causado apenas por apoptose celular ou morte dentro do anel HIF.

Vários estudos mediram a tensão de oxigênio nos rins usando diferentes métodos. Alguns exemplos da medição da tensão de oxigênio de rins normais foram os seguintes: 50 mmHg e 30 mmHg no córtex e na medula usando microeletrodos; e 49 mmHg e 41 mmHg nos segmentos S1 e S2 das células tubulares do córtex utilizando PLIM (Hirakawa et al., 2017, 2018; Zhang et al., 2014). A tensão de oxigênio dos rins doentes seria menor. De acordo com um relatório anterior usando microeletrodos de oxigênio, ratos diabéticos apresentaram menor tensão de oxigênio no parênquima renal: 36 mmHg e 11 mmHg no córtex e na medula, respectivamente (Heyman et al., 2013; Palm et al., 2003). Como os microeletrodos de oxigênio medem a tensão parenquimatosa média de oxigênio, espera-se uma faixa mais ampla em rins doentes. A tensão de oxigênio intracelular diminuiu para zero mmHg em um modelo de rim isquêmico cuja artéria e veia renal lateral foram pinçadas (Hirakawa et al., 2015). Considerando esses achados, a faixa de tensão de oxigênio no anel HIF, aproximadamente 4-20 mmHg, parecia plausível in vivo.

Descobrimos ainda que o pH afetou a formação do anel HIF, bem como a tensão de oxigênio. Como as células epiteliais tubulares do rim estão continuamente expostas ao líquido urinário, o pH das células tubulares deve ser afetado pelo da urina. Considerando a ampla faixa de pH na urina, decidimos estudar células incubadas em uma faixa de pH de 5.0–8,5. Houve estudos sobre a faixa de pH em rins normais. Um estudo descobriu que o pH do córtex era de 7,39 ± 0.{{10}}8, e o da medula era de 7,20 ± {{2{{39}) }}}.09, medido usando microeletrodos (Burke et al., 1999). Outro estudo, usando imagens de pH baseadas em ressonância magnética, mostrou valores de pH de 7,3 ± 0,13 e 7.0 ± 0,29 respectivamente (Raghunand et al., 2003). Foi relatado que o pH renal diminuiu de 6,5 para 6,32 e para tão baixo quanto 5,83 em um caso grave, em um modelo de camundongo de DRC com acidose (Pavuluri et al., 2019). Essas observações forneceram evidências de queda de pH e variação na DRC. No entanto, o impacto do pH no HIF-1 induzido pela hipóxia crônica na DRC não foi suficientemente bem examinado. No presente estudo, observou-se um deslocamento do anel HIF entre pH 6,5 e pH 7,4, faixa de pH plausível na DRC. Este resultado apoiou a hipótese de que uma leve diminuição do pH afeta o acúmulo de HIF-1 na DRC. Com base na evidência de queda de pH abaixo de 6,0 em casos graves de DRC, também é necessário avaliar o estado fisiológico do HIF-1 em pH mais baixo. Embora haja relatos de que um ambiente ácido, mesmo em normóxia, estabiliza o HIF-1 , a maioria desses relatos investigou condições de acidez leve, acima de pH 6,0 (Filatova et al., 2016; Mekhail et al., 2004) . Neste trabalho, mostramos a supressão do acúmulo de HIF-1 em células tubulares em pH 5,0 e atenuação dos sinais de HIF-1 em um modelo de lamínula incubado em pH 5,0. Portanto, a diminuição do pH renal na DRC in vivo pode estar correlacionada com a ativação insuficiente do HIF, bem como com toxinas urêmicas no rim hipóxico, agravando a progressão da DRC (Tanaka et al., 2013).

Nosso estudo tem várias limitações. Primeiro, na área de hipoperfusão, os meios de cultura devem ser deficientes em nutrientes, além da presença de deficiência de oxigênio e diminuição do pH. No entanto, é difícil delinear os efeitos do pH, tensão de oxigênio e outros fatores induzidos pela hipoperfusão. No corpo, a isquemia, hipoperfusão patológica do sangue causada por uma combinação de baixo oxigênio e baixos nutrientes, ocorre em órgãos e células. É importante entender as diferenças entre detecção de hipóxia e detecção de isquemia. Apesar da dificuldade em elucidar o efeito biológico de cada fator, nosso modelo de hipoperfusão é fisiologicamente plausível, mimetizando o estado patológico in vivo. Em segundo lugar, fazer um modelo de lamínula requer habilidade e prática, uma vez que a maioria das células ocasionalmente se desprende durante a remoção de uma lamínula, especialmente ao usar o método tradicional (Figura S2a). Este problema dependia da linha celular utilizada. Por exemplo, foi difícil para nós aplicar um modelo de lamínula às células HEK 293 porque sua adesão a uma lamínula era relativamente fraca. Terceiro, era desejável minimizar os danos às células cultivadas sob uma lamela. O número de células danificadas aumentou à medida que o período em que foram cobertas aumentou, como mostrado pela análise de apoptose. Determinamos que 3 h era apropriado para estimar o anel HIF quando parecia estar estático, e aproximadamente apenas 10 por cento das células tornaram-se apoptóticas (Figura S11). A quarta limitação foi a dificuldade de anexar células cultivadas a uma lamínula de forma uniforme em todas as amostras (Figura S2b,c). A diferença de fixação entre um método tradicional e um método alternativo de confecção de um modelo de cobertura labial também pode ter afetado o estudo. Medimos a faixa de tensão de oxigênio equivalente ao anel HIF por uma técnica de vida útil de fosforescência, na qual criamos um modelo de lamínula usando um método tradicional. Como o anel HIF durante a imunocitoquímica foi visualizado usando um método alternativo, a verdadeira tensão de oxigênio pode ser diferente. Minimizamos esses erros usando a evidência de que o pimonidazol era positivo em 10 mmHg ou menos da tensão de oxigênio. A quinta limitação é que o pH intracelular não é necessariamente o mesmo que o pH do meio de cultura. Vários relatórios anteriores mostraram que o pH intracelular é consistente com o pH médio até certo ponto em células cultivadas (Michl et al., 2019), poderíamos avaliar apenas a tendência do pH intracelular alterando o pH médio. In vivo, a relação entre o pH de regiões intracelulares e extracelulares, como urina ou fluido corporal, é mais complicada do que em células cultivadas. Assim, mais estudos sobre a forma como a mudança de pH regula o acúmulo da proteína HIF-1 in vivo serão necessários para o futuro.

Benefício Cistanche: melhorar rimfunção

Outra limitação é que o pH deve ter efeito sobre o marcador de hipóxia, o pimonidazol. Comparamos a distância da borda da área positiva para pimonidazol do centro de uma lamínula sob diferentes condições de pH em nosso modelo de lamínula. A borda da área positiva para pimonidazol foi comparável entre pH 6,5, 7,4 e 8,5 (Figura S12a,b). Um estudo anterior também demonstrou a manutenção da ligação do pimonidazol em diferentes valores de pH (Kleiter et al., 2006). Com base nessas evidências, concluímos que o pimonidazol é um marcador de hipóxia apropriado para nossos experimentos com lamínula. A limitação final é que, dada uma faixa de tensão de oxigênio entre aproximadamente 4 mmHg e 20 mmHg (0,52 por cento O2 a 2,6 por cento O2) do anel HIF, Pt(II)- e Pd(II)-porfirinas, que são amplamente utilizadas como agentes biológicos sondas de oxigênio, têm vantagens para medir concentrações de oxigênio muito baixas por causa de suas vidas de fosforescência significativamente mais longas em comparação com aquelas que usam complexos de Ir(III) (Yoshihara et al., 2017). No entanto, em geral, uma medida quantitativa de oxigênio baseada na fosforescência, calculada pela equação de Stern-Volmer, tem melhor desempenho em faixas baixas de O2 (Papkovsky & Zhdanov, 2016). Vários estudos anteriores demonstraram a medição baseada no complexo Ir(III) de tensões de oxigênio tão baixas quanto aproximadamente 10 mmHg (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Portanto, acreditamos que a faixa de tensão de oxigênio do anel HIF deve ser um resultado preciso.

5|CONCLUSÕES

Em resumo, descobrimos que entender os papéis do oxigênio e do pH é essencial para entender o estado fisiológico do HIF-1 na DRC e pode ser obtido investigando as células tubulares com hipoperfusão. O modelo de lamínula, com suas limitações do influxo de mídia, foi um bom modelo de hipoperfusão in vivo, especialmente nos túbulos na DRC, uma vez que a rarefação dos capilares peritubulares é uma das principais características da DRC (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Este modelo de hipoperfusão também pode mimetizar os gradientes de oxigênio e pH in vivo, como tumores e lesões isquêmicas. O modelo fornece uma abordagem promissora para a elucidação desses mecanismos biológicos.

CONFLITO DE INTERESSES

Todos os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

CONTRIBUIÇÕES DOS AUTORES

Todos os autores contribuíram para a formação do conceito geral. TH realizou os experimentos globais. TH e YH analisaram os resultados e fizeram as figuras. TH escreveu o manuscrito original. KM, TY e ST realizaram o experimento usando uma técnica de vida útil de fosforescência e editaram a parte do manuscrito. YH, TT e MN editaram o manuscrito geral. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

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