Um estudo de toxicidade subcrônica de 13-semana de 2-(l-mentoxi)etanol em ratos F344

Introdução

2-(1-mentoxiO etanol (Nº CAS 38618-23-4) é um líquido límpido e incolor com odor característico e é amplamente utilizado como agente aromatizante. O Comitê Conjunto de Especialistas em Aditivos Alimentares da FAO/OMS (JECFA) avaliou 2-(l-metoxi)etanol como agente aromatizante, categorizado como substâncias estruturalmente relacionadas ao mentol1. Com base na classe estrutural dos agentes aromatizantes, 2-(l-metoxi)o etanol foi classificado na Classe I. Nos Estados Unidos e na Europa, os níveis de ingestão de 2-(l-metoxi)etanol por humanos foi estimado em 12 ug/pessoa/dia e 0,01 ug/pessoa/dia, respectivamente, ambos abaixo do limite da Classe I de 1.800 ug/pessoa/dia. Com base nessas estimativas, considera-se que 2-(1-mentoxi)o etanol pode não apresentar preocupações de segurança durante o uso rotineiro como agente aromatizante.

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As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(1-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 mg/kg de peso corporal [PC])1. Apesar do uso de 2-(1-mentoxi)etanol como agente aromatizante, dados limitados estão disponíveis sobre a toxicidade de dose repetida deste composto. Nosso laboratório investigou a toxicidade de vários aditivos alimentares, incluindo agentes aromatizantes representativos de cada categoria, em modelos de roedores2–7. Para esclarecer o perfil toxicológico e estabelecer um nível de efeito adverso não observado (NOAEL), conduzimos um estudo de toxicidade subcrônica de 13-semanas de 2-(1-mentoxi)etanol, que foi administrado oralmente a ratos F344 por gavagem.

Materiais e métodos

Teste químico

2-(1-mentoxi)etanol (Lote No. 5I0002, pureza 99,9%) produzido por Takasago Int. (Tóquio, Japão) foi fornecido pela Divisão de Padrões e Avaliação, Departamento de Segurança Alimentar, Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar, Japão, com o apoio da Associação Japonesa de Materiais de Sabores e Fragrâncias (Tóquio, Japão). Embora a substância de teste tenha sido fornecida como uma mistura de isômeros ópticos (Nº CAS 38618-23-4), ela foi confirmada como o enantiômero l (Nº CAS 75443-64-0) ​​pelo fabricante. Gavagem oral com óleo de milho (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japão) como veículo foi selecionada como via de administração devido à insolubilidade aquosa e volatilidade do 2-(1-mentoxi)etanol. Soluções de 2-(1-mentoxi)etanol foram preparadas diariamente, imediatamente antes da administração. Após armazenamento por 2 horas em temperatura ambiente, as proporções residuais de 2-(1-mentoxi) etanol em solução de 4, 40 e 400 mg/mL foram confirmadas como 96,8%, 99,8% e 96,5% , respectivamente, por cromatografia gasosa (Japan Inspection Association of Food and Food Industry Environment, Tóquio, Japão).

Animais experimentais

No total, 40 ratos machos e 40 fêmeas livres de patógenos específicos (F344 / DuCrlCrlj, 5 semanas) foram adquiridos na Charles River Laboratories Japan (Yokohama, Japão) e utilizados após aclimatação durante uma semana. Durante o estudo, os animais foram alojados em gaiolas de policarbonato com cama macia de lascas, mantidos em sala com sistema de barreira para controle do ciclo claro/escuro (12 h), ventilação (taxa de troca de ar de 18 vezes/h), temperatura ( 24 ± 1 grau) e umidade relativa (55 ± 5%). As gaiolas e a cama de cavacos foram substituídas duas vezes por semana. Cada animal teve livre acesso à água da torneira e a uma dieta basal (CRF-1; Oriental Yeast, Tóquio, Japão). No início da experiência, os animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos de 10 ratos machos e fêmeas cada, com base nos pesos corporais medidos imediatamente antes do início do tratamento com o produto químico em estudo.

Design de estudo

Em um estudo preliminar de {{0}}dia avaliando 2-(1-mentoxi) etanol administrado em doses de 0, 200, 400 e 800 mg/ kg de peso corporal/ dia, os pesos absolutos e relativos do fígado aumentaram significativamente em todos os grupos tratados de ambos os sexos (dados não mostrados). Com base nesses resultados, selecionamos doses de 2-(1-mentoxi) etanol de 0, 15, 60 e 250 mg/kg de peso corporal/dia para administração a ratos machos e fêmeas no presente {{ Estudo de toxicidade de 13}} semanas.

As condições gerais e a mortalidade foram avaliadas diariamente. Os pesos corporais, bem como as quantidades de dieta fornecida e residual, foram medidos uma vez por semana durante o período experimental. Todos os ratos ficaram em jejum durante a noite ao completar o tratamento, e amostras de sangue para hematologia e bioquímica sérica foram coletadas da aorta abdominal sob anestesia por inalação profunda usando isoflurano. O desenho do estudo foi de acordo com as Diretrizes para Designação de Aditivos Alimentares e Revisão de Padrões para Uso de Aditivos Alimentares do Japão (1996) e aprovado pelo Comitê de Cuidados e Utilização de Animais do Instituto Nacional de Ciências da Saúde, Japão.

Hematologia e bioquímica sérica

Os seguintes parâmetros hematológicos foram analisados ​​utilizando analisadores hematológicos automáticos ProCyte Dx (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, EUA): contagem de leucócitos (WBC), contagem de glóbulos vermelhos (RBC), concentração de hemoglobina (HGB), hematócrito (HCT), volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM), concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM), contagem de plaquetas (PLT) e células leucocitárias diferenciais, incluindo neutrófilos (Neut), linfócitos (Linfa), monócitos (Mono), eosinófilos (Eosino) e basófilos (Baso). A análise bioquímica sérica foi realizada pela Oriental Yeast para os seguintes parâmetros: proteína total (TP), albumina (Alb), relação albumina/globulina (A/G), bilirrubina total (Bil), glicose, colesterol total (T-Chol), triglicerídeo (TG), nitrogênio ureico (BUN), creatinina (Cre), cálcio (Ca), fósforo inorgânico (IP), sódio (Na), potássio (K), cloro (Cl), aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina (ALP) e -glutamil transpeptidase (-GTP).

Pesos de órgãos e avaliação histopatológica

Uma necropsia completa foi realizada para todos os animais, e o cérebro, timo, pulmões, coração, baço, fígado, glândulas supra-renais, rins, testículos e ovários foram pesados. Esses órgãos, bem como tecidos da medula espinhal, nervo trigêmeo, glândula pituitária, cavidade nasal, glândulas salivares, língua, esôfago, traquéia, aorta, glândula tireóide, glândula paratireóide, pâncreas, estômago, intestinos delgado e grosso, submandibular e mesentérico gânglios linfáticos, vagina, útero, bexiga urinária, próstata, vesículas seminais, epidídimo, fêmur e esterno com medula óssea, vértebras, músculos esqueléticos, nervo ciático, pele e glândula mamária, foram fixados em formalina tamponada neutra a 10%; em seguida, foram preparados cortes embebidos em parafina e corados com hematoxilina e eosina para exame histopatológico. Os testículos e olhos com glândulas de Harder foram fixados em fixador de Bouin e solução de Davidson, respectivamente. Os tecidos ósseos, incluindo a cavidade nasal, vértebras, esterno e fêmur, foram descalcificados usando uma mistura de ácido fórmico a 10% e formalina tamponada a 10% por até 2 semanas. A avaliação histopatológica foi realizada para todos os tecidos obtidos de animais do grupo controle e o grupo que administrou a dose mais alta, a menos que fossem observadas lesões relacionadas ao tratamento.

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Imunohistoquímica para 2u-globulina

Em ratos machos, o acúmulo de 2u-globulina no rim foi examinado por análise imuno-histoquímica de cortes embebidos em parafina. Para recuperação antigênica, os cortes obtidos de 5 ratos de cada grupo foram incubados com proteinase K (DAKO, Glostrup, Dinamarca) por 1 min em temperatura ambiente. Todas as seções foram imersas em solução de H2O2/metanol a 3% por 10 min em temperatura ambiente para inativação da atividade da peroxidase endógena. Após bloquear reações inespecíficas com soro de coelho normal a 10%, as secções foram incubadas com um anticorpo primário para 2uglobulina (diluído 1:400; anticorpo anti-2u-globulina de rato; R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA) durante a noite a 4 grau 8. A visualização da ligação do anticorpo foi realizada utilizando um kit VectaStain Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA) e 3,3'-diaminobenzidina. Todas as seções foram contrastadas com hematoxilina.

Análise estatística

As variações nos valores dos dados de peso corporal durante o período experimental, bem como de hematologia, bioquímica sérica e peso de órgãos, foram avaliadas quanto à homogeneidade usando o teste de Bartlett. A análise de variância unidirecional e o teste de Kruskal-Wallis, respectivamente, foram empregados para dados homogêneos e heterogêneos. Na determinação de diferenças estatisticamente significativas, o teste de comparação múltipla de Dunnett foi utilizado para comparar os grupos de controle e de tratamento. As comparações de incidências e graus histopatológicos foram analisadas utilizando o teste exato de probabilidade de Fisher e o teste U de Mann-Whitney, respectivamente. Valores P de<0.05 were considered statistically significant.

Resultados

Parâmetros durante a vida, hematologia e bioquímica sérica

Não foram observados sinais clínicos significativos durante todo o período experimental e todos os animais sobreviveram até a necropsia programada. Além disso, não foram observadas diferenças significativas no peso corporal e na ingestão diária de alimentos em ratos machos e fêmeas (fig. 1A e B).

Os dados hematológicos e bioquímicos séricos são mostrados nas Tabelas 1 e 2, respectivamente. Análises hematológicas revelaram diminuição significativa de HGB, HCT, MCV e MCH e aumento de PLT em ratos machos administrados com 250 mg/kg de peso corporal/dia 2-(1-mentoxi)etanol (Tabela 1). Na bioquímica sérica, foram observados aumentos significativos em TP, T-Chol e Ca e diminuições em Bil e ALP em homens do grupo de 250 mg/kg (Tabela 2). Um aumento significativo na Cre e uma diminuição na A/G foram observados em homens dos grupos de 60 e 250 mg/kg. Nas mulheres, um aumento significativo de Ca e uma diminuição de ALP foram registrados nos grupos de 60 e 250 mg/kg, enquanto níveis elevados de T-Chol e redução de A/G, Bil, TG, AST e ALT foram detectados nos grupos de 250 mg. /kg grupo. Embora tenha sido observado um aumento significativo em TG e uma diminuição em Cl em homens aos quais foram administrados 60 mg/kg, a falta de qualquer relação de dose sugeriu que estas diferenças não estavam associadas à exposição à substância de teste.

Pesos de órgãos

Os dados relativos aos pesos dos órgãos estão resumidos na Tabela 3. Os pesos absolutos e relativos do fígado aumentaram significativamente em ambos os sexos do grupo de 250 mg/kg (Tabela 3). Um aumento significativo no peso relativo do fígado foi observado em homens do grupo de 60 mg/kg. Nos homens, os pesos absoluto e relativo dos rins aumentaram significativamente nos grupos de 60 e 250 mg/kg. No grupo masculino de 250 mg/kg, foram observados aumentos significativos nos pesos absolutos e relativos das glândulas supra-renais e nos pesos relativos do baço e testículos.

Histopatologia e imunohistoquímica

Os dados dos achados histopatológicos e imuno-histoquímicos estão resumidos nas Tabelas 4 e 5, respectivamente. Os achados histopatológicos revelaram que a frequência de acúmulo de grânulos eosinofílicos (Fig. 2A-D), túbulos basofílicos e molde hialino, bem como inflamação intersticial focal no rim, foram significativamente aumentadas em grupos de tratamento exclusivamente masculinos quando comparados com o controle grupo (Tabela 4). Com base nas análises imuno-histoquímicas, ratos machos tratados com a substância teste apresentaram aumento na imunorreatividade da 2u-globulina nas células epiteliais dos túbulos proximais, demonstrando uma clara dependência da dose (Fig. 2E-H) (Tabela 5).

Na necropsia, um rato macho no grupo de 25{3}} mg/kg apresentou aumento grave do rim direito devido a um nefroblastoma histologicamente característico. Embora o nefroblastoma seja incomum na maioria das linhagens de ratos9, este caso foi considerado incidental, pois nenhum outro animal apresentou lesões semelhantes. Além disso, em estudos de carcinogenicidade oral, a incidência de nefroblastoma espontâneo em ratos machos F344/DuCrlCrlj variou entre 0–2,0%10. Embora várias lesões tenham sido detectadas esporadicamente em outros órgãos, não foram aparentes alterações significativas dependentes do tratamento na incidência dessas lesões.

Discussão

Até o momento, 24 agentes aromatizantes, incluindo 2-(1-mentoxi) etanol, foram avaliados pelo JECFA como substâncias estruturalmente relacionadas ao mentol, e todos estão listados como "sem preocupação de segurança" nos níveis atuais estimados de ingestão1, 11. 2-(1-Mentoxi)etanol é classificado em um subgrupo de álcoois ou éteres alicíclicos e é considerado conjugado principalmente com ácido glucurônico, seguido de excreção urinária1. Embora os valores orais de LD50 destas substâncias em roedores sejam relativamente elevados, os dados de estudos de toxicidade de dose repetida permanecem limitados. Um estudo de toxicidade de dose repetida de 13-semana revelou que o carboxilato de mentil pirrolidona (CAS No. 68127-22-0), um composto estruturalmente relacionado ao mentol, pode estar associado ao aumento do peso relativo do fígado e dos rins em homens e mulheres Ratos Wistar. O acúmulo de 2u-globulina nos túbulos proximais de ratos machos também foi observado na dose de 1.111 mg/kg de peso corporal/dia, e o NOAEL foi determinado como 109 mg/kg de peso corporal/dia1.

No presente estudo de toxicidade subcrônica de 13-semana do 2-(1-mentoxi)etanol, não foram observadas alterações toxicológicas no estado geral, no peso corporal e na ingestão de alimentos. Após avaliação hematológica, observamos diminuição de HGB (96,6% em relação aos valores médios de controle), HCT (96,3%), MCV (98,4%) e MCH (98,2%) e aumento de PLT (111%) no sexo masculino Grupo de 250 mg/kg, que foram consideradas influências toxicológicas do tratamento com 2-(1-mentoxi)etanol. Os pesos absolutos (115% em ambos os sexos) e relativos (119% nos homens e 111% nas mulheres) do fígado aumentaram significativamente em ambos os sexos nos grupos de 250 mg/kg. Embora não tenha havido alterações histopatológicas no fígado, aumento dos níveis séricos de T-Chol (110% em homens e 121% em mulheres) e TP (105% em homens) e uma redução de TG (60,1% em mulheres) nos 250 grupos mg/kg indicam alterações tóxicas associadas ao metabolismo lipídico e à síntese proteica no fígado. Também foram detectadas redução de HGB e MCH e elevação de PLT, T-Chol e TP em homens e diminuição de TG e aumento do peso absoluto e relativo do fígado em ambos os sexos, com significância estatística no estudo preliminar de 28-dia (dados não mostrados ), corroborando que essas alterações nos parâmetros hematológicos e bioquímicos séricos, bem como no peso do fígado, não foram efeitos incidentais, mas sim relacionados à substância em estudo. Em contraste, o aumento significativo nos pesos relativos do fígado detectado no grupo masculino de 60 mg/kg no presente estudo não foi acompanhado por um aumento nos pesos absolutos ou alterações nos parâmetros bioquímicos relacionados, sugerindo que este aumento foi uma mudança adaptativa.

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Considerou-se que o aumento significativo do peso absoluto (120%) e relativo (118%) das glândulas supra-renais no grupo masculino de 250 mg/kg estava associado ao produto químico em estudo. Além disso, o aumento dos pesos absolutos e relativos das glândulas supra-renais em ambos os sexos revelou uma clara dependência da dose no estudo preliminar de 28-dia (dados não apresentados), indicando a associação com o tratamento com o produto químico em estudo. Embora a hipertrofia adrenal pudesse resultar do estresse, não houve achados sugestivos de estresse, como redução do ganho de peso corporal ou atrofia do timo e de outros órgãos linfóides, tanto no presente estudo quanto nos preliminares. Como pode não haver alterações histopatológicas na glândula adrenal, mesmo com produção prejudicada de glicocorticóides em casos de inibição de enzimas relacionadas à esteroidogênese12, não se pode excluir a possibilidade de que o aumento do peso da glândula adrenal seja um achado tóxico. Em contraste, o aumento dos pesos relativos do baço e dos testículos no grupo masculino de 250 mg/kg, não observado no estudo preliminar, foi considerado toxicologicamente insignificante devido à ausência de lesões histopatológicas ou ao aumento significativo dos pesos absolutos. Da mesma forma, a bioquímica sérica revelou diminuição da A/G e aumento do Ca em ambos os sexos, o que foi considerado sem significado toxicológico, visto que não foram detectadas anormalidades em parâmetros relacionados. Além disso, a diminuição dos níveis de Bil e ALP em ambos os sexos e a diminuição de AST e ALT nas mulheres contrastaram com os efeitos tóxicos esperados e foram considerados não significativos.

Nefropatia crônica caracterizada por túbulos basofílicos, molde hialino e inflamação intersticial focal foi observada com significância estatística em homens de todos os grupos tratados. Além disso, foi detectado aumento da Cre sérica e dos pesos absoluto e relativo dos rins nos grupos masculinos de 60 e 250 mg/kg; essas mudanças não foram observadas nos grupos de tratamento feminino. Nestes casos, o grau de acumulação de grânulos eosinofílicos nas células epiteliais tubulares proximais aumentou de uma forma aparentemente dependente da dose. Esses grânulos foram confirmados como 2u-globulina por imuno-histoquímica, indicando a ocorrência de nefropatia por 2u-globulina. As 2u-globulinas ligadas a certos produtos químicos, como o d-limoneno, acumulam-se nos lisossomos e são observadas nos túbulos proximais como grânulos eosinofílicos ou hialinos9. Esse acúmulo pode danificar células epiteliais, levando à nefropatia crônica progressiva e consequente formação tumoral9. Assim, embora o NOAEL para 2-(1-mentoxi)etanol associado à nefropatia por 2u-globulina em rins de ratos machos não tenha sido identificado, este tipo de nefropatia é alegadamente específico para ratos machos e, portanto, não relevante para humanos avaliação de risco13. Um risco aumentado de insuficiência renal mediado por mecanismos relacionados ao acúmulo de 2u-globulina é altamente improvável, uma vez que esta proteína está ausente em humanos14. Portanto, considerou-se razoável excluir da determinação do NOAEL as alterações associadas à nefropatia crónica observadas nos homens.

Em conclusão, o presente estudo de toxicidade subcrônica de 13-semana demonstrou que 250 mg/kg de peso corporal/dia de tratamento com 2-(1-mentoxi) etanol causou alterações tóxicas na hematologia, na bioquímica sérica e no peso dos órgãos em ratos F344 machos e fêmeas. Com base nos resultados observados, o NOAEL de 2-(1-mentoxi)etanolfoi avaliado como 60 mg/kg de peso corporal/dia para ambos os sexos.

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