[6]-Gingerol facilita a secreção de CXCL8 e a produção de ROS em neutrófilos humanos primários, visando o canal TRPV1 parte 2

2.6. Impacto de [6]-Gingerol na secreção de CXCL8 após estimulação de fMLF

O resultado anterior levantou a questão de saber se a expressão alterada da proteína na superfície dos neutrófilos afeta as respostas gerais dessas células a moléculas ativadoras conhecidas como fMLF.

Quando os neutrófilos isolados foram pré-incubados com [6]-gingerol em uma concentração de 50 nM por 2 h e estimulados com diferentes concentrações de fMLF por mais 4 h, um aumento na secreção de CXCL8 após estimulação subsequente com fMLF em concentrações de 0,3 nM (22 por cento, p {{10}}.08), 0,5 nM (32 por cento, p = 0,05), e 1 nM (33 por cento, p=0,03) foi demonstrado em comparação com a estimulação única com fMLF (Figura 6). Além disso, a pré-incubação dos neutrófilos por 2 h com 50 nM [6]-gingerol promoveu uma mudança do valor EC50 de 0,66 para 0,49, indicando aumento da capacidade de resposta das células para fMLF. Em contraste, pré-incubar os neutrófilos com 50 nM [6]-gingerol por 2 h sozinho não induziu a secreção de CXCL8 (CXCL8 não detectável, dados não mostrados).

Os neutrófilos são uma das células mais importantes do sistema imunológico humano. Eles têm funções imunológicas importantes e podem nos proteger efetivamente de vários germes, vírus, bactérias e outros patógenos, melhorando assim nossa imunidade.

A principal função dos neutrófilos é entrar rapidamente no local da lesão quando infectados ou feridos para fagocitar e digerir patógenos, células necróticas e complexos imunes, etc., e liberar uma série de substâncias antibacterianas e mediadores inflamatórios, como complemento, interferon, fatores celulares , etc., ativando e guiando outras células imunes para combater patógenos e reparar tecidos danificados. Além disso, os neutrófilos também podem participar da produção de autoanticorpos e reparo tecidual no organismo.

Portanto, os neutrófilos estão intimamente relacionados com a imunidade do organismo. Uma contagem baixa de neutrófilos pode tornar o corpo suscetível a infecções ou doenças autoimunes, enquanto uma contagem alta pode levar a inflamação excessiva ou desequilíbrio do sistema imunológico. Portanto, manter uma contagem normal de neutrófilos é muito importante para a manutenção da imunidade humana.

Ao fazer exercícios, comer de forma saudável, dormir o suficiente, etc., podemos melhorar nossa imunidade, combater vários patógenos, reduzir a inflamação e proteger nossa saúde. Ao mesmo tempo, quando ocorre uma doença, também podemos manter uma contagem normal de neutrófilos, fortalecer a imunidade e promover a recuperação por meio de tratamento ativo e evitando o abuso desnecessário de drogas.

Em suma, os neutrófilos são uma parte importante do sistema imunológico do nosso corpo. Manter uma contagem normal de neutrófilos pode aumentar nossa imunidade e proteger nossa saúde. Portanto, mantenhamos uma atitude positiva perante a vida, prestemos atenção à nossa saúde, melhoremos efetivamente a imunidade e desfrutemos de uma vida saudável e feliz. Desse ponto de vista, precisamos estar atentos para melhorar nossa imunidade. Cistanche pode melhorar significativamente a imunidade, porque as cinzas da carne contêm uma variedade de componentes biologicamente ativos, como polissacarídeos, dois cogumelos, Huang Li, etc. Esses ingredientes podem estimular a carne. Todos os tipos de células do sistema imunológico aumentam sua atividade imunológica.

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2.7. Impacto do [6]-Gingerol na produção de ROS

Em seguida, analisamos se a incubação de neutrófilos com [6]-gingerol afeta a geração de espécies reativas de oxigênio após o período de incubação de 2 h com [6]-gingerol e após estimulação subsequente com 1 nM fMLF.

As análises não mostraram impacto estatisticamente significativo de uma incubação de 2 h de neutrófilos com 50 nM [6]-gingerol (Figura 7A). No entanto, pré-incubar neutrófilos por 2 h com 50 nM de [6]-gingerol e subsequentemente estimular as células com 1 nM fMLF aumentou a produção de ROS em 27,8 por cento ± 2,2 por cento (Figura 7B).

2.8. A inibição farmacológica do TRPV1 reverte os efeitos induzidos por [6]-Gingerol

Para verificar o envolvimento de TRPV1 nos aumentos induzidos por [6]-gingerol na secreção de CXCL8 e na produção de ROS após estimulação com fMLF, o inibidor específico de TRPV1 trans-tertbutilciclohexanol (BCH) foi aplicado. [5a] A ligação de BCH a TRPV1 interrompe sua interação com [6]-gingerol e, portanto, deve inibir os efeitos induzidos por [6]-gingerol, o que permitiria a conclusão de que os efeitos observados são mediados por TRPV1.

Para esta abordagem, os neutrófilos humanos foram incubados com [6]-gingerol por 2 h ou com [6]-gingerol e BCH por 2 h e, posteriormente, estimulados com 1 nM fMLF. Pudemos mostrar que o aumento na produção de CXCL8 induzido pela pré-incubação dos neutrófilos com 50 nM [6]-gingerol e subsequente estimulação com 1 nM fMLF não pôde ser detectado, quando as células foram pré-incubadas com uma combinação de [6]- gingerol e 100 μM BCH (Figura 8A), confirmando o envolvimento de TRPV1 nos efeitos induzidos por [6]-gingerol. No caso da produção de ROS, a pré-incubação dos neutrófilos com uma combinação de [6]-gingerol e BCH levou a valores ainda mais baixos do que o controle de solvente (Figura 8B).

3. Discussão

Embora as propriedades quimiossensoriais de alguns canais TRP tenham sido bem descritas, sua função em tecidos não sensoriais é muito menos clara. Em relação ao seu perfil de expressão geral em tecidos não sensoriais, como leucócitos sanguíneos, apenas alguns estudos foram realizados no passado. Em 2011, Wenning et al.[24] analisaram a expressão de RNA de membros das famílias TRPC, TRPM e TRPV em células T CD4+ humanas primárias via RT-PCR. Eles encontraram expressão consistente de TRPC1, TRPC3, TRPV1, TRPM2 e TRPM7.

Além disso, TRPC3 demonstrou modular a proliferação dependente de Ca2 plus de células T CD4 plus primárias. Com relação ao perfil de expressão, os resultados relatados[24] são consistentes com nossos dados, exceto para TRPC3, que, no presente trabalho, foi detectado apenas com frequência de 80%. Em neutrófilos humanos, Heiner et al.[11] analisaram o padrão de expressão de transcritos específicos de TRP via RT-PCR. Eles demonstraram transcritos específicos para LTRPC2 (TRPM2), TRPV1, proteína semelhante ao receptor vanilóide 1 (TRPV2), Ca2 epitelial mais canal 1 (TRPV5), Ca2 epitelial mais canal 2 (TRPV6) e TRPC6, que está completamente de acordo com nossa resultados.

No entanto, até agora, de acordo com nosso conhecimento, nenhum dado quantitativo abrangente sobre a expressão de RNA de todos os 27 membros da superfamília TRP humana foi analisado para cinco dos tipos de células leucocitárias sanguíneas mais proeminentes. Os resultados obtidos permitem concluir que a expressão do canal TRP não é dependente da linhagem. Portanto, pode-se supor que a expressão dos canais TRP é regulada e não individualmente. Quais circunstâncias influenciam a expressão de cada canal de TRP em cada tipo celular em um determinado momento só pode ser especulado, mas pode incluir, além dos aspectos fisiológicos gerais, também os hábitos alimentares e o estado nutricional do indivíduo.

Por exemplo, foi demonstrado que altos níveis de glicose aumentaram a expressão de TRPC1, TRPC3, TRPC5, TRPC6, TRPM6 e TRPM7 em monócitos humanos.[25] Vale ressaltar que não conseguimos detectar TRPC3 e TRPC5 em monócitos, o que pode ser explicado pela análise de células de diferentes doadores, suportando uma regulação altamente individual da expressão do canal TRP.

Por outro lado, a estimulação de neutrófilos com o ligante TRPV1 [6]-gingerol na concentração de 50 nM por 2 h não apresentou impacto significativo na expressão de seu RNA e proteínas de superfície. O último resultado pode sugerir a conclusão de que a incubação não leva a uma internalização do receptor. Isso se deve à constatação de que a capsaicina provoca a internalização do TRPV1 apenas em concentrações mais altas (EC50: 500 nM) nas células TRPV1 mais HEK293.[26]

A incubação de neutrófilos com [6]-gingerol na concentração de 50 nM por 2 h levou a alterações significativas na expressão de proteínas de superfície além do TRPV1, ou seja, aumento da expressão do receptor fMLF FPR1, CD11b e CD66b. Esse achado foi interessante porque foi demonstrado anteriormente que o priming de neutrófilos resulta em expressão de superfície elevada do receptor fMLF FPR1, CD11b, CD35 e CD66b.[27] Inversamente, a expressão de CD62L foi reduzida via liberação enzimática em neutrófilos sensibilizados.[28] Priming é um processo pelo qual os neutrófilos são transferidos de um estado de repouso para um estado "pronto para ir" que é caracterizado por uma capacidade de responder mais fortemente a estímulos ativadores, sem características de ativação completa, por exemplo, produção de ROS.[16b] Se as alterações fenotípicas observadas podem ser atribuídas ao priming de neutrófilos permanece indefinido neste ponto.

No entanto, o aumento da expressão de superfície de FPR1 pode levar ao aumento da capacidade de resposta dos neutrófilos ao seu ligante, fMLF, o ativador de neutrófilos mais importante e bem estudado. A estimulação de neutrófilos com fMLF conduz, entre outras respostas, à libertação de quimiocinas, sendo o CXCL8 (IL-8) crucial para esta resposta. CXCL8 funciona como um quimioatraente para outras células, direcionando-as para o local da infecção. De fato, a pré-incubação de neutrófilos humanos com [6]-gingerol e subsequente estimulação com fMLF levou ao aumento da secreção da quimiocina CXCL8. No entanto, esse efeito só pode ser observado em uma faixa de concentração de 0.3– 1 nM fMLF. A razão para isso pode ser que concentrações mais altas de fMLF induzem a dessensibilização ou internalização do receptor,

o que aboliria o aumento induzido por [6]-gingerol na expressão de FPR1.[29] A resposta aumentada para fMLF também foi mostrada para produção de ROS após pré-incubação das células com [6]-gingerol e subsequente estimulação com 1 nM fMLF. A inibição farmacológica de TRPV1 por trans-test-butil ciclohexanol levou a níveis de ROS ainda mais baixos do que no controle, o que pode indicar um envolvimento parcial geral de TRPV1 na produção de ROS em neutrófilos humanos, como foi demonstrado para neurônios do gânglio da raiz dorsal de camundongos.[30 ]

A pré-incubação de 2 h em si não aumentou a produção de ROS, o que também aponta para uma maior capacidade de resposta das células, mas não houve iniciação da produção de ROS por [6]-gingerol. Além disso, a triagem de citocinas e quimiocinas revelou apenas um número bastante baixo de transcritos regulados pela incubação de neutrófilos com [6]-gingerol, mesmo com transcrição de TRPV1 inalterada e níveis de proteína de superfície. Isso implica que as alterações funcionais e fenotípicas observadas ocorrem na ausência de síntese de novo.

Sobre achados anteriores um tanto inconsistentes, nossos resultados suportam uma expressão funcional de TRPV1 em neutrófilos humanos. No entanto, Schepetkin et al.[22] mostraram um impacto inibitório mediado por TRPV1-da geranil acetona na migração de neutrófilos para fMLF e uma mobilização intracelular de Ca2 plus induzida por CXCL8-, em contraste com nossos resultados, que apontam para um efeito estimulatório no TRPV1 após ativação subsequente . Além de serem compostos diferentes, uma razão para essa discrepância pode ser as diferentes concentrações de compostos usados, uma vez que Schepetkin et al.[22] aplicamos uma concentração de 50 μM de geranil acetona, enquanto em nosso trabalho aplicamos apenas 50 nM [6]-gingerol. Essa concentração foi escolhida com base em nosso trabalho anterior, que mostrou uma concentração plasmática máxima de 42,0 ± 16,3 nmol L−1 30 minutos após o consumo do chá de gengibre e concentrações decrescentes ao longo de um período subsequente de 2 horas. No entanto, o chá de gengibre foi consumido em 20 min, o que pode não corresponder ao comportamento de consumo usual. Portanto, assumimos que uma concentração plasmática de 50 nM [6]-gingerol é alcançável por meio da ingestão alimentar, enquanto concentrações mais altas não são muito prováveis ​​de ocorrer.[9]

O efeito inibitório da geranil acetona foi atribuído à dessensibilização cruzada, o que levaria a uma diminuição das respostas aos estímulos ativadores, e pode-se supor que esse efeito esteja presente apenas em concentrações mais altas do ligante TRPV1 na faixa de μM, levando a concentrações intracelulares mais altas de Ca2 plus. Nesse contexto, vale ressaltar que análises de concentração-resposta em nosso trabalho anterior sobre a secreção de citocinas em células T revelaram um valor de IC50 de 82,2 μM para [6]-gingerol.[9] Isso, juntamente com o efeito inibitório observado de 50 μM de geranil acetona, fortaleceria a suposição de que altas concentrações de ligantes de TRPV1 agem de forma bastante intuitiva, enquanto concentrações mais baixas aumentam as funções das células imunes. Concentrações de [6]-gingerol abaixo de 50 nM não foram incluídas no estudo. Portanto, a questão permanece, se concentrações mais baixas revelariam efeitos significativos e biologicamente relevantes. No entanto, o estudo apresentado demonstra que uma concentração de [6]-gingerol, alcançada no plasma sanguíneo após a ingestão dietética habitual de chá de gengibre, é suficiente para facilitar a secreção de CXCL8, bem como a produção de ROS em neutrófilos humanos.

Nossas descobertas mostram que, em concentrações nutricionalmente relevantes, um ingrediente alimentar sensorialmente ativo pode afetar as respostas celulares gerais em tecidos não sensoriais, como leucócitos sanguíneos, por meio do canal TRPV1. As modificações observadas na função dos neutrófilos, juntamente com a extensa expressão dos canais TRP nos leucócitos do sangue como potenciais estruturas-alvo, destacam a importância de avaliar o potencial bioativo dos ingredientes alimentares com foco particular nas concentrações alcançáveis ​​por meio de hábitos alimentares comuns.

4. Seção Experimental

Isolamento de Leucócitos: Amostras de sangue comercial de doadores saudáveis ​​anônimos foram recebidas de SonnenGesundheitszentrum/Transfusionsmedizin, (tradução em inglês: Sun Health Center/Transfusion Medicine) Munique (Alemanha). Neutrófilos, células NK, células B e células T foram isoladas usando os respectivos kits de isolamento de sangue total MACSxpress (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. Em seguida, os eritrócitos remanescentes foram depletados com o kit MACSxpress Erythrocyte Depletion (Miltenyi Biotec). Para o isolamento de monócitos, foram utilizadas as microesferas StraightFrom Whole Blood CD14, o Whole Blood Column Kit e a solução de lise de glóbulos vermelhos (Miltenyi Biotec).

Isolamento de RNA, transcrição reversa e PCR quantitativo em tempo real: o RNA de leucócitos foi isolado usando QIAzol Lysis Reagent (Qiagen, Hilden, Alemanha) após um tratamento com DNase usando o conjunto de DNase livre de RNase (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante. A integridade do RNA foi determinada por meio do kit RNA 6000 Nano (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemanha) usando o Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). O RNA foi transcrito em cDNA usando o iScript gDNA Clear cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories GmbH, Feldkirchen, Alemanha). Para qPCR, 50 ng de cDNA e SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (BioRad Laboratories GmbH) foram misturados com pares de primers específicos.

Os respectivos primers foram validados por meio de sequenciamento de produtos de PCR derivados de experimentos de qRT-PCR usando RNA do cérebro ou testículo humano (do FirstChoice Human Total RNA Survey Panel, Thermo Fisher Scientific) para TRPM4, TRPM5 e TRPV5, respectivamente. O primer e as respectivas sequências de produtos foram fornecidos na Tabela S1, Informações de suporte. ACTB, B2M, HMBS e HPRT1 foram usados ​​como genes de referência e os respectivos primers foram adquiridos da Bio-Rad Laboratories. Controle de RT, controle de PCR, controle de gDNA e controle de qualidade de RNA (Bio-Rad Laboratories) foram usados ​​como controles gerais de PCR. As reações de PCR foram realizadas em um CFX 96 Real-Time System (Bio-Rad Laboratories) usando as seguintes condições de PCR: 95 graus por 1 min, seguido de 45 ciclos de 95 graus por 15 segundos e 60 graus por 1 minuto. As frequências, que indicavam quantos doadores investigados o transcrito poderia ser detectado, e os valores de Δct foram calculados usando o Microsoft Excel.

Incubação de neutrófilos: após o isolamento do sangue de doadores saudáveis, os neutrófilos foram suspensos em RPMI 1640 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha) sem nenhum outro suplemento com uma densidade celular de 1 × 1{{18 }}6 mL−1. [6]-gingerol (Sigma, superior ou igual a 98 por cento de pureza) ou DMSO, respectivamente, foi adicionado em uma concentração final de 50 nM ou 0,02 por cento. Posteriormente, as células foram incubadas a 37 graus e 5% de CO2 por 2 h e usadas diretamente para análises posteriores ou centrifugadas a 300 × g por 10 min em temperatura ambiente, lavadas com RPMI 1640 (Gibco) e incubadas posteriormente com fMLF (Alomone Labs, Jerusalém, Israel) por 4 h ou DMSO (0,02 por cento) como controle de solvente, respectivamente.

Imunocoloração: Para imunocoloração, 105 neutrófilos, tratados ou não tratados, foram centrifugados a 300 × g por 10 min. O sobrenadante foi aspirado e as células ressuspensas em tampão PBS. Os anticorpos foram adicionados de acordo com o fabricante, e as suspensões misturadas e incubadas a 4 graus por 10 min no escuro. Em seguida, as células foram lavadas com 1 mL de tampão PBS e ressuspensas em 500 μL de tampão PBS para análise em MACSQuant Analyzer 16 (Miltenyi Biotec). Os anticorpos utilizados foram: CD15-VioBlue (concentração final: 2,5 ug mL−1), CD62LVioGreen (concentração final: 7,5 ug mL−1), CD11b-APC (concentração final: 2 ug mL−1), CD66b- APC/Vio770 (concentração final: 1 ug mL−1), anticorpo receptor fMLP-FITC (concentração final: 20 ug mL−1) (Miltenyi Biotec), anti-TRPV1-FITC (concentração final: 25 ug mL −1) (Alomone Labs), Rabbit IgG Isotype Control-FITC (concentração final: 25 ug mL−1) (Thermo Fisher Scientific). A viabilidade celular foi avaliada por coloração com iodeto de propídio (Miltenyi Biotec). Os valores médios de intensidade de fluorescência (MFI) e os valores correspondentes foram obtidos usando o software Flowlogic 7.3 (minivan Technologies, Mentone, Victoria, Austrália).

Medição de ROS: As espécies reativas de oxigênio foram detectadas usando o CellROX Green Reagent (Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, os neutrófilos foram tratados com [6]-gingerol 50 nM por 2 h ou [6]-gingerol 50 nM por 2 h e subsequentemente com fMLF 1 nM por 4 h, ou os respectivos controles de solvente. O reagente CellROX foi adicionado às células em uma concentração final de 5 μM 30 min antes do final do período de incubação e a mistura foi ainda incubada por 30 min a 37 graus e 5 por cento de CO2. Em seguida, o meio foi removido e as células foram lavadas três vezes com PBS e analisadas usando um MACSQuant Analyzer 16 (Miltenyi Biotec). Os valores médios de intensidade de fluorescência (MFI) foram obtidos usando o software Flowlogic 7.3 (minivan Technologies).

Espectrofluorimetria: Para medir as concentrações intracelulares de Ca2 plus, os neutrófilos foram suspensos em RPMI 1640 (Gibco) com uma densidade celular de 1 × 106 mL−1. As células foram carregadas com Fura-2 AM (Promocell, Heidelberg, Germany) por 45 min a 37 graus e 5% de CO2, lavadas e ressuspensas em RPMI 1640 (Gibco). A fluorescência das células foi avaliada usando um Espectrofluorômetro SAFAS Xenius XC (SAFAS, Mônaco) nos seguintes comprimentos de onda: excitação de 340 nm/emissão de 510 nm e excitação de 380 nm/emissão de 510 nm. Fura-2 M é um corante raciométrico que pode ser excitado a 340 nm para sua forma ligada ao cálcio e 380 nm para sua forma não ligada. Um aumento na concentração de cálcio intracelular levaria a um aumento da fluorescência para a forma ligada ao cálcio e uma diminuição da fluorescência para a forma não ligada. A proporção de 340/380, que foi usada para contabilizar a carga celular desigual do corante, foi calculada usando o Microsoft Excel. A proporção de 340/380 para as células tratadas com o ionóforo ionomicina após 2 h foi ajustada para 100 por cento e a proporção para as células tratadas com 50 nM [6]-gingerol e o controle de solvente foi referido a este.

Ensaio imunoenzimático: As concentrações de CXCL8 nos sobrenadantes derivados dos experimentos de incubação (Seção 4.3) foram determinadas por ELISA Sandwich (DuoSet, R&D Systems, bio-techne, Minneapolis, MN, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante.

Análises estatísticas: Todos os experimentos foram realizados usando células de pelo menos três doadores independentes. Salvo indicação em contrário, os dados foram apresentados como média ± desvio padrão (DP) calculado pelo GraphPad Prism 9.0. Para as análises de diferenças estatisticamente significativas, foram realizadas duas amostras de testes t de Student ou, no caso de comparação de mais de duas variáveis, uma ANOVA one-way seguida de um teste de comparações múltiplas de Tukey como teste posthoc. O respectivo teste utilizado foi indicado na legenda da figura correspondente. Um valor p menor ou igual a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Informações de Apoio

Informações de suporte estão disponíveis na Wiley Online Library ou no autor.

Agradecimentos

A Declaração de Disponibilidade de Dados foi adicionada em 20 de fevereiro de 2023.

Conflito de interesses

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Contribuições do autor

GA, DK e VS conceberam e planejaram os experimentos; GA e KK realizaram os experimentos; VS supervisionou o projeto; GA escreveu o primeiro rascunho do manuscrito. Todos os autores revisaram o manuscrito final.

Declaração de Disponibilidade de Dados

Os dados estão disponíveis a pedido dos autores.

Palavras-chave

alimentos, gengibre, sistema imunológico, imunomodulação, leucócitos polimorfonucleares (PMNs).

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