Efeito renoprotetor dos tratamentos AM6545 e AM4113 na síndrome metabólica
Mar 21, 2022
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PARTE Ⅰ: Interferência com TGF 1-Inflamação e fibrose mediadas por trás dos efeitos renoprotetores dos antagonistas neutros do receptor CB1 AM6545 e AM4113 em um modelo de rato com síndrome metabólica
Basma G.Eid, Thikryat Neamatallah, Abeer Hanafy, Hany M.El-Bassossy & et al.
1. Introdução
Metabólicosíndrome(MetS), é uma combinação demetabólicoanormalidades que comumente se manifestam como resistência à insulina (RI), obesidade abdominal, dislipidemia e hipertensão arterial [1]. Pacientes com MetS(Metabólicosíndrome) estão em alto risco de desenvolver diabetes, doença cardiovascular aterosclerótica (DCV) e insuficiência renal [2]. Todas essas doenças representam condições de saúde graves e muitas vezes fatais que são prevalentes na maioria dos países. A prevalência de MetS(Metabólicosíndrome) está aumentando globalmente com mais de um bilhão de pessoas agora afetadas [3]. Esse aumento está associado à inatividade física, consumo de alimentos altamente calóricos e bebidas suplementadas com açúcares [4,5]. A relação entre MetS(Metabólicosíndrome) e doença renal crônica (DRC) é controverso. No entanto, vários estudos relataram que uma dieta rica em frutose induz MetS(Metabólicosíndrome) que posteriormente progride para várias manifestações de nefropatia, como filtração glomerular reduzida, albuminúria, uricosúria, proteinúria e alterações na morfologia renal [6-8]. Possíveis mecanismos de insuficiência renal podem incluir a liberação sistêmica de mediadores de citocinas pró-inflamatórias, radicais livres e estresse oxidativo na SM.Metabólicosíndrome)[9,10]. De fato, a incidência de DRC em pacientes com SM(Metabólicosíndrome) é 2.6-vezes maior do que em indivíduos sem qualquer MetS(Metabólicosíndrome) componentes [11].
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Intervenções terapêuticas para MetS(Metabólicosíndrome) incluem a modulação do sistema endocanabinóide (EC) hiperativo através da inibição do subtipo de receptor canabinóide CB1 |12]. Demonstrou-se que a inibição do receptor CB1 regula o apetite, a ingestão de alimentos e a lipogênese em ratos obesos [13-15]. O CB1 é um receptor acoplado à proteína G tipo rodopsina classe A (GPCR) que ativa principalmente proteínas G i/o [16]. Os receptores CB1 onipresentes são amplamente encontrados no sistema nervoso central (SNC), o que pode aumentar a incidência de distúrbios neuropsiquiátricos [17]. Foi estabelecido que um sistema completo de endocanabinóides existe no rim e tem um papel significativo na homeostase renal, bem como no desenvolvimento de nefropatia diabética e condições como DRC [18]. Os receptores CB1 e CB2 foram relatados como presentes em as várias partes do néfron, bem como outras células renais em humanos e roedores [19]. Além disso, o sistema endocanabinóide no rim desempenha um papel predominante na hemodinâmica renal [20].
Rimonabant (SR141716), por exemplo, é um agonista inverso do receptor CB1 que foi aprovado clinicamente em abril de 2006 para tratarmetabólicocomplicações e obesidade na Europa [21]. No entanto, a retirada da droga penetrante do SNC, rimonabant, foi perseguida pela Agência Europeia de Medicamentos, uma vez que estava associada à ansiedade, depressão e aumento da tendência de causar suicídio [17].
Para contornar os efeitos colaterais neuropsiquiátricos do rimonabant, que eram atribuíveis aos efeitos centrais associados ao seu perfil de agonista inverso, buscamos duas estratégias para o desenvolvimento de análogos eficazes que não possuem seus efeitos colaterais indesejáveis. A primeira delas foi a descoberta de antagonistas neutros de CB1. Esses compostos, ao contrário de suas contrapartes agonistas inversas que agem promovendo o estado inativo do receptor, impedem que os endocanabinóides de ocorrência endógena interajam com CB1. AM4113 representa um antagonista neutro de CB1 bem-sucedido que compartilha os efeitos desejáveis do rimonabant, mas não possui seus efeitos colaterais indesejáveis. Nossa segunda estratégia foi desenvolver antagonistas do receptor CB1 incapazes de atravessar a barreira hematoencefálica.AM6545representa um ligante de ação periférica bem-sucedido, mantendo ao mesmo tempo o perfil de antagonista neutro CB1. Ambas as drogas foram relatadas para manter a atividade terapêutica em diferentes modelos animais com menos efeitos adversos do que o rimonabant [22-26].
No presente estudo, nosso objetivo foi determinar se o tratamento com os antagonistas do receptor CB1AM6545eAM4113melhoraria a função renal em um modelo de alto teor de sal e frutose demetabólicosíndromee explorar o mecanismo subjacente para a função melhorada. Tal estudo nos permitiria identificar se algum dos efeitos desses compostos possui um componente relacionado à inativação de CB1 produzida centralmente.
2. Resultados
2.1. Efeito dos tratamentos AM6545 e AM4113 no tônus endocanabinóide renal
A medição de anandamida (AEA) e 2-araquidonoil glicerol (2-AG) em homogenatos renais foi realizada para avaliar o tônus endocanabinóide no rim. Conforme mostrado na Tabela 1, quando os ratos de controle (C) foram tratados comAM6545(C mais A65) ouAM4113(C mais A41) não houve efeito significativo no conteúdo de AEA e 2-A Gin no rim. Animais commetabólicosíndrome(MetS) apresentou níveis elevados de AEA e 2-AG em comparação com os controles (C). Depois de tratar ometabólicosíndromeratos com qualquerAM6545(M mais A65) ouAM4113(M mais A41), os animais ainda apresentaram níveis muito mais elevados de AEA e 2-AG nos rins em relação aos controles.
Tabela 1. Conteúdo renal de anandamida e 2-araquidonoil glicerol.
2.2. Efeito dos Tratamentos AM6545 e AM4113 na Função Renal em Ratos MetS (síndrome Metabólica)
MetS(Metabólicosíndrome) devido à alimentação rica em sal com alto teor de frutose está associada à deterioração da função renal, conforme indicado pelo aumento da taxa de excreção de albumina (AER) e proteinúria em comparação com controles (p<0.05, figure="" 1a,="" b).="" both="">AM6545eAM4113significativamente inibido (p<0.05)the elevated="" proteinuria="" and="" albumin="" excretion="" rate="" to="" similar="" levels="" suggesting="" protection="" of="" renal="" function="" in="">Metabólicosíndrome). NenhumAM6545nemAM4113afetou significativamente AER ou proteinúria quando administrado em animais de controle (Figura 1A, B). A depuração de creatinina foi calculada e foi muito menor nometabólicosíndromegrupo (M) em comparação aos controles (Figura ]C). Administrar ouAM6545(M mais A65) ou AM4113 (M mais A41) para ometabólicoratos não tiveram efeito sobre a depuração de creatinina (Figura 1C).
Figura 1. Os antagonistas do receptor CB1AM6545eAM4113melhorar os parâmetros funcionais renais em alimentados com alto teor de sal e frutosemetabólicosíndromeratos.
(A) mostra a taxa de excreção de albumina (AER), (B) mostra a proteinúria e (C) mostra a depuração de creatinina medida no controle
(C) emetabólicosíndrome(M) ratos, bem como após 4 semanas de injeção intraperitoneal deAM6545no controle (C mais A65) emetabólicoratos (M mais A65) ou AM4113 no controle (C mais A41) oumetabólicoratos (M mais A41) na dose de 10mg/kg/dia.
Os resultados são mostrados como gráficos de caixa e a média é mostrada como( plus )(n=8).*p<0.05 relative="" to="" the="" control="" group=""><0.05 relative="" to="" the="">metabólicosíndromegrupo por ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Tukey.
2.3. Efeito dos Tratamentos AM6545 e AM4113 na Pressão Arterial
A medição da pressão arterial usando o método não invasivo do manguito de cauda revelou que a MetS(Metabólicosíndrome) (M, M mais A65, M mais A41) apresentaram pressão arterial sistólica e diastólica significativamente maiores em comparação aos animais controle. O tratamento dos animais comAM6545ouAM4113não causou alterações significativas nas pressões arteriais sistólica e diastólica (Tabela 2).
Tabela 2. Efeito de AM6545 e AM4113 na pressão arterial sistólica e diastólica (PA) de ratos induzidos por síndrome metabólica (SM).
2.4. Impacto dos Tratamentos AM6545 e AM4113 na Histopatologia Renal em Ratos MetS (síndrome Metabólica)
Exame de seções coradas por H&E de MetS(Metabólicosíndrome) apresentaram alterações histopatológicas marcantes, principalmente no córtex renal, onde foram observadas alterações anormais principalmente nos glomérulos e túbulos contorcidos proximais e estroma renal em relação ao grupo controle. O rim de ratos controle apresentou a estrutura normal do córtex renal (Figura 2A, B), que continha principalmente corpúsculos renais consistindo de capilares glomerulares envolvidos pela cápsula de Bowman. Além disso, havia um espaço capsular entre os túbulos contorcidos proximal (PCT) e distal (DCT). Células cubóides altas com citoplasma eosinofílico com núcleos centrais arredondados revestem os túbulos contorcidos proximais. Microvilosidades altas preenchiam o lúmen dos túbulos, que apresentavam uma borda luminal em escova. Os túbulos contorcidos distais eram escassos em relação ao PCT. Em MetS(Metabólicosíndrome), o rim apresentou graus variáveis de alterações (Figura 2C-E) onde alguns glomérulos estavam hipertrofiados com capilares glomerulares dilatados enquanto outros glomérulos pareciam atróficos. Além disso, a maioria dos PCTs estava dilatada com perda das bordas em escova; suas células tinham citoplasma vacuolado e núcleos picnóticos escuros. Além disso, o DCT apresentou algumas alterações degenerativas com paredes e citoplasma vacuolado. Além disso, espaços intersticiais, hemorragia peritubular e infiltrado celular inflamatório mononuclear foram observados em diferentes áreas do córtex renal. Curiosamente, MetS(Metabólicosíndrome) ratos tratados comAM6545(Figura 3A, B) e AM4113 (Figura 3C, D) mostraram uma melhora acentuada no perfil histológico renal manifestado por glomérulos quase normais e PCT sem sinais de degeneração e/ou infiltração de células inflamatórias.
Figura 2. Fotomicrografias representativas da estrutura histológica do córtex renal em controle emetabólicosíndromeratos.
O grupo controle (A, B) mostra glomérulos (G) e túbulos renais normais (PCT, DCT), enquanto no grupometabólicosíndromegrupo (CE) alguns glomérulos apareceram atrofiados (G1) enquanto outros apareceram hipertrofiados (G2) com capilares dilatados ().
A maior parte da PCT apareceu degenerada com lúmen alargado, perda da borda em escova e núcleos picnóticos (dentro de um círculo).
Observe a presença de amplos espaços intersticiais (*), extravasamento de sangue (*) e infiltração com células inflamatórias (ICI). (H&E—A, C ×200—B, D, E×400).
Figura 3. Fotomicrografias representativas da estrutura histológica do córtex renal nos grupos de ratos demetabólicosíndromeTratado comAM6545(Uma bandaAM4113(C, D) Antagonistas do receptor CB1.
Observe a restauração da aparência quase normal em comparação com o grupo controle em relação aos glomérulos (G) e túbulos (PCT, DCT). (H&E—A, C×200—B, D ×400)
2.5. Efeito dos Tratamentos AM6545 e AM4113 nos Níveis de Ácido Úrico em Ratos MetS (Síndrome Metabólica)
Dada a importância do ácido úrico na inflamação renal e progressão para doença renal crônica, a Figura 4 mostra que MetS(Metabólicosíndrome) os animais tiveram um aumento de dez vezes no teor de ácido úrico na urina em relação aos controles (p<0.05). however,="" both="" cb1="" antagonists,="">AM6545eAM4113, significativamente (p<0.05) inhibited="" this="" increased="" uric="" acid="" content="" while="" restoring="" it="" to="" near="" normal="" values.="" meanwhile,="" neither="">AM6545nemAM4113afetou significativamente o conteúdo urinário de ácido úrico em animais controle.
2.6. Efeito deAM6545eAM4113Tratamentos nos níveis de TGF 1 em MetS(Metabólicosíndrome) Ratos
O estudo investigou ainda o papel do TGF 1 como um importante mediador de pró-inflamação e fibrose. Conforme mostrado na Figura 5, a concentração tecidual de TGF 1 em rins isolados de MetS(Metabólicosíndrome) ratos foi marcadamente (p<0.05) increased="" than="" in="" normal="" animals.="" however,="" the="" four="" weeks="" of="" treatment="" with="">AM6545eAM4113resultou em um significativo (p<0.05)reduction of="" tgfβ1="" concentrations,="" restoring="" it="" to="" normal="" values.="" while="" neither="">AM6545nemAM4113afetaram significativamente as concentrações teciduais de TGF 1 nos rins de controle. Este resultado sugere que o receptor CB1 tem um papel crítico na mediação da inflamação e fibrose renal.
O coeficiente de correlação foi calculado para avaliar a correlação entre a taxa de excreção de albumina e o nível renal de TGF 1 (Tabela 3). Uma forte correlação estava presente entre o AER e TGF 1 no controle emetabólicosíndromeanimais. A correlação também esteve presente nos animais tratados comAM6545, mas não comAM4113.
Figura 4. Os antagonistas do receptor CB1AM6545eAM4113bloqueou a elevação de dez vezes no teor de ácido úrico na urina induzida por alto teor de frutose e alto teor de salmetabólicosíndromeratos.
A concentração de ácido úrico foi medida na urina do controle (C) emetabólicosíndrome(M) ratos, bem como controle emetabólicoratos tratados comAM6545(C mais A65) e (M mais A65), respectivamente ouAM4113(C mais A41) e (M mais A41) respectivamente na dose de 10 mg/kg/dia. Os resultados são mostrados como gráficos de caixa e a média é mostrada como ( mais )(n=8).*p<0.05relative to="" the="" control="" group="" and=""><0.05 relative="" to="" the="">metabólicosíndromegrupo por ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Tukey.
Figura 5. Os antagonistas do receptor CB1AM6545eAM4113reduzir a produção de TGF 1 em frutose induzidosmetabólicosíndromeratos.
A concentração de TGF 1 foi medida no controle (C) emetabólicosíndrome(M) ratos, bem como controle emetabólicoratos tratados comAM6545(C mais A65) e (M mais A65), respectivamente, ou AM4113(C mais A41) e (M mais A41), respectivamente, na dose de 10mg/kg/dia. Os resultados são mostrados como boxplots e a média é mostrada como( plus )(n=8).*p<0.05 relative="" to="" the="" control="" group=""><0.05 relative="" to="" the="">metabólicosíndromegrupo por ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Tukey.
Tabela 3. Os efeitos de AM6545 e AM113 na correlação entre a taxa de excreção de albumina (AER) e o nível renal do fator de crescimento transformador beta 1 (TGF1).
2.7. Efeito deAM6545eAM4113Tratamentos na Fibrose Renal em MetS(Metabólicosíndrome) Ratos
A Figura 6 mostra os cortes de rim de diferentes grupos corados pelo Tricromo de Masson para avaliar as fibras colágenas, que se apresentaram como uma coloração azulada. O córtex renal mostrou um aumento acentuado de fibras colágenas em rins retirados de MetS(Metabólicosíndrome) ratos (Figura 6B) em comparação com os ratos de controle (Figura 6A). No interstício e glomérulos, havia excesso de deposição de fibras colágenas. Em contraste, houve redução da deposição de fibras colágenas no córtex renal comAM6545(Figura 6C) e AM4113 (Figura 6D). A quantificação da coloração Tricromo de Masson revelou uma porcentagem maior nometabólicosíndrome(M) assim como nometabólicogrupos tratados (M mais A65, M mais A41) em comparação aos controles. No entanto, o tratamento de MetS(Metabólicosíndrome) animais comAM6545eAM4113causou uma redução significativa da coloração de Masson em relação ao não tratadometabólicogrupo.
Figura 6. Fotomicrografias representativas do córtex renal de diferentes grupos coradas com Tricromo de Masson. Observe o aumento acentuado das fibras colágenas.
(A) no rim demetabólicosíndrome(B) ao redor dos glomérulos (G) e túbulos (PCT, DCT) em comparação com o controle (A). Em contraste,AM6545-tratadometabólicosíndrome
(C) e AM4113-tratadometabólicosíndrome(D) mostrou uma redução notável das fibras colágenas. (Trichrome de Masson, A, B, C & D × 200).
(E) mostra a quantificação da coloração Tricromo de Masson expressa em porcentagem. Os resultados são mostrados como gráficos de caixa e a média é mostrada como( mais )(n=8).*Significativamente diferente de "C" em p<0.05,# significantly="" different="" from"m"="" at="" p=""><>
