Sequenciamento do genoma completo para o diagnóstico de distúrbios neurológicos de expansão de repetição no Reino Unido: um estudo retrospectivo de precisão diagnóstica e validação clínica prospectiva

Para maiores informações:ali.ma@wecistanche.com

Resumo

Fundo

Os distúrbios de expansão repetida afetam cerca de 1 em 3.000 indivíduos e são doenças clinicamente heterogêneas causadas por expansões de repetições curtas de DNA em tandem. Os testes genéticos são frequentemente locus-específicos, resultando no subdiagnóstico de pessoas com apresentações clínicas atípicas, especialmente em pacientes pediátricos sem história familiar prévia positiva. O sequenciamento do genoma completo é cada vez mais usado como teste de primeira linha para outras doenças genéticas raras, e nosso objetivo foi avaliar seu desempenho no diagnóstico de pacientes comneurológicodistúrbios de expansão repetidos.

Métodos

Nós avaliamos retrospectivamente a precisão diagnóstica do sequenciamento do genoma completo para detectar os loci de expansão de repetição mais comuns associados aneurológico(AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, C9orf72, CACNA1A, DMPK, FMR1, FXN, HTT e TBP) usando amostras obtidas no National Health Service na Inglaterra de pacientes com suspeita deneurológicodistúrbios; resultados de testes de PCR anteriores foram usados ​​como padrão de referência. A precisão clínica do sequenciamento do genoma completo para detectar expansões repetidas foi examinada prospectivamente em pacientes previamente testados geneticamente e não diagnosticados, recrutados em 2013–17 para o Projeto Genomas 100 000 no Reino Unido, suspeitos de ter uma doença genéticaneurológico(formas familiares ou de início precoce de ataxia, neuropatia, paraplegia espástica, demência, doença do neurônio motor,parkinsonianomovimentodistúrbios, deficiência intelectual ou distúrbios neuromusculares). Se uma chamada de expansão repetida foi feita usando sequenciamento de genoma completo, PCR foi usado para confirmar o resultado.

Descobertas

A precisão diagnóstica do sequenciamento do genoma completo para detectar expansões repetidas foi avaliada em relação a 793 testes de PCR realizados anteriormente no NHS de 404 pacientes. O sequenciamento de todo o genoma classificou corretamente 215 de 221 alelos expandidos e 1.316 de 1.321 alelos não expandidos, mostrando 97,3% de sensibilidade (95% CI 94,2–99,0) e 99,6% de especificidade (99,1–99 ·9) nos 13 loci associados à doença quando comparados com os resultados dos testes de PCR. Em amostras de 11 631 pacientes do Projeto Genomas 100 000, o sequenciamento do genoma completo identificou 81 expansões repetidas, que também foram testadas por PCR: 68 foram confirmadas como expansões repetidas em toda a faixa patogênica, 11 não - expansões ou permutações intermediárias patogênicas, e duas eram repetições não expandidas (taxa de descoberta falsa de 16%).

Interpretação

Em nosso estudo, o sequenciamento do genoma completo para a detecção de expansões repetidas mostrou alta sensibilidade e especificidade, e levou à identificação deneurológicorepetidos distúrbios de expansão em pacientes previamente não diagnosticados. Esses achados apoiam a implementação do sequenciamento do genoma completo em laboratórios clínicos para o diagnóstico de pacientes que têm umaneurológicoapresentação consistente com um distúrbio de expansão repetida.

Financiamento

Conselho de Pesquisa Médica, Departamento de Saúde e Assistência Social, Serviço Nacional de Saúde da Inglaterra, Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde e Illumina.

Introdução

Apesar dos recentes avanços na compreensão da base genética de espécies rarasneurológicodistúrbios, até 70 por cento dos pacientes com tais distúrbios permanecem geneticamente não diagnosticados.1–3 Em parte, isso se deve aos desafios técnicos de testar variantes genéticas complexas e repetitivas, incluindo expansões repetidas; estima-se que tais expansões afetem cerca de 1 em 3.000 pessoas (apêndice p 1) e sejam a principal causa de mais de 40 distúrbios neurogenéticos,4 incluindo a doença de Huntington e a síndrome do X frágil. Os distúrbios de expansão repetida são clínica e geneticamente heterogêneos, e a expansão repetida pode estar associada a várias doenças. Por exemplo, expansões em C9orf72 podem se apresentar como esclerose lateral amiotrófica ou demência frontotemporal.5 Expansões repetidas em diferentes loci também podem produzir características fenotípicas semelhantes, tornando-as difíceis de distinguir clinicamente: expansões repetidas em pelo menos dez genes de ataxia espinocerebelar frequentemente presentes na idade adulta -ataxia de início,6 e aqueles em C9orf72 e AR podem causar doença do neurônio motor.7,8

Os distúrbios de expansão repetida são causados ​​por um aumento no número de sequências curtas repetitivas de DNA em tandem, e os limiares de patogenicidade para cada distúrbio são específicos do locus. O tamanho da expansão varia de menos de 30 repetições (por exemplo, em CACNA1A) a vários milhares de unidades de repetição (por exemplo, em FMR1, DMPK, C9orf72 e FXN, que podem se estender até 5 kb de tamanho). Expansões de repetição exibem instabilidade molecular, o que pode levar a mudanças no tamanho da repetição (geralmente aumentando em comprimento) ao longo de gerações e tecidos. gerações.4 O início pediátrico de distúrbios de expansão repetida pode se apresentar como síndromes multissistêmicas sem assinaturas fenotípicas específicas,9 e as crianças com esses distúrbios são, portanto, mais propensas a serem subdiagnosticadas quando uma história familiar de distúrbio de expansão repetida está ausente do que quando está presente.10– 12

A avaliação laboratorial de expansões repetidas é tipicamente restrita à avaliação molecular direcionada de um locus individual guiada pelo diagnóstico clínico suspeito usando métodos baseados em PCR ou Southern blot,13 que podem ser caros e demorados. Além disso, devido às características fenotípicas variadas e sobrepostas desses distúrbios, os loci de expansão de repetição associados à doença podem permanecer não testados.14

O sequenciamento do genoma completo está surgindo como uma ferramenta de diagnóstico de primeira linha em pacientes com doenças raras15, mas, até recentemente, pensava-se que tinha capacidade limitada para avaliar loci contendo expansões repetidas.16 Os avanços na bioinformática, no entanto, tornaram viável a detecção da doença -causando expansões repetidas a partir de dados de sequenciamento de próxima geração.17–22 Aqui, relatamos a avaliação diagnóstica de uma abordagem de sequenciamento de genoma completo para detectar expansões repetidas usando dados de PCR retrospectivos e sua validação clínica em pacientes no Projeto 100.000 Genomas que tinha uma suspeita de distúrbio neurológico, não diagnosticado com testes genéticos anteriores.

Métodos

Projeto de estudo e participantes

Essa avaliação do sequenciamento do genoma completo para a detecção de expansões repetidas incluiu avaliações de precisão diagnóstica e de precisão clínica. A precisão diagnóstica foi avaliada usando dados de pacientes que haviam sido previamente testados por PCR para expansões repetidas conhecidas por causar doença neurológica.4 Os pacientes foram identificados a partir de duas fontes: o 100 000 Genomes Project e o Genomic Laboratory sediado em Cambridge University Hospitals ( Cambridge, Reino Unido). Para ambos os conjuntos de pacientes, os testes de PCR foram realizados em amostras de pacientes por laboratórios do Serviço Nacional de Saúde (NHS) como parte da avaliação clínica de rotina: para amostras do Projeto 100.000 Genomas, os testes de PCR foram feitos antes do recrutamento para o projeto pelo Laboratório de Neurogenética do University College London Hospital (Londres, Reino Unido); amostras com expansões repetidas confirmadas por PCR foram obtidas de pacientes testados pelo Laboratório Genômico baseado em Cambridge. Pacientes com resultados de testes PCR positivos e negativos para distúrbios de expansão repetidos foram identificados para inclusão em nosso estudo por meio de sistemas de registros laboratoriais; todos os pacientes deram consentimento informado por escrito para uso de sua amostra para fins de garantia de qualidade e pesquisa e treinamento, como parte da otimização e validação do serviço clínico.

O sequenciamento do genoma completo de cada amostra foi feito em um dos dois laboratórios: Genomics England (Hinxton, Reino Unido) para as amostras 100.000 Genomes Project (n=254) e o Illumina Clinical Services Laboratory (ICSL; San Diego, CA, USA) para amostras obtidas pelo Genomic Laboratory baseado em Cambridge (n=150). No geral, esse conjunto de dados foi usado para a parte de precisão diagnóstica do estudo e consistiu em dados de PCR e sequenciamento de genoma completo de 404 pacientes, cobrindo 13 loci que representam os distúrbios de expansão de repetição neurológica mais comuns: 11 loci associados a ataxia e distúrbios neurodegenerativos de início (HTT, AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, TBP, C9orf72 e FXN), um locus associado à deficiência intelectual (FMR1) e um locus associado à distrofia miotônica (DMPK). Para cada locus, os dados do teste de PCR estavam disponíveis para pelo menos um alelo expandido (apêndice p 24).

A acurácia clínica foi avaliada examinando a concordância de expansões repetidas, detectadas com sequenciamento de genoma completo, com suspeita de diagnóstico clínico após confirmação por PCR em pacientes com suspeita de distúrbios neurológicos genéticos (formas de ataxia familiar ou de início precoce, neuropatia, paraplegia espástica, demência , doença do neurônio motor,parkinsonianodistúrbios do movimento, deficiência intelectual ou distúrbios neuromusculares) recrutados para o Projeto 100.000 Genomas em 2013–17. O Projeto 100.000 Genomas é um programa do Reino Unido para avaliar o valor do sequenciamento do genoma completo em pacientes com necessidades diagnósticas não atendidas em doenças raras e câncer. Após a aprovação ética do 100000 Genomes Project pelo East of England Cambridge South Research Ethics Committee (referência 14/EE/1112), inclusive para análise de dados e retorno de achados diagnósticos aos pacientes, esses pacientes foram recrutados por profissionais de saúde e pesquisadores de 13 Centros de Medicina Genômica na Inglaterra e foram inscritos no projeto se eles ou seu responsável forneceram consentimento por escrito para que suas amostras e dados fossem usados ​​na pesquisa, incluindo este estudo. Os probandos e, se possível, outros membros da família, foram inscritos de acordo com os critérios de elegibilidade estabelecidos para doenças raras específicas (apêndice pp 5-11). Os pacientes foram recrutados para o Projeto 100.000 Genomas após testes genéticos padronizados no NHS, conforme indicado nos critérios de elegibilidade. Dados clínicos padronizados de linha de base foram registrados usando Human Phenotyping Ontology (HPO)23 contra modelos de dados específicos de doença.24 O status da doença dos membros da família, em relação à indicação clínica do probando para teste, também foi coletado.

Para identificar expansões repetidas causadoras em pacientes com doença não diagnosticada geneticamente, testamos pacientes com suspeita de distúrbios genéticos consistentes com uma doença de expansão repetida. Os pacientes foram selecionados com base na concordância de sua doença e termos HPO com distúrbios associados à expansão repetida. Os dados de sequenciamento do genoma completo dos pacientes foram interrogados para procurar expansões em conjuntos particulares de repetições usando quatro painéis de expansão de repetição diferentes de acordo com suas características clínicas (apêndice p 5). As expansões repetidas selecionadas para inclusão nesses painéis são os loci de expansão repetida causadores de doenças neurológicas mais comuns. Pacientes com características clínicas potencialmente compatíveis com mais de um distúrbio de expansão repetida foram testados em vários painéis. Se uma chamada de expansão repetida foi feita usando o sequenciamento do genoma completo, o teste de confirmação por PCR foi realizado.

Para cada paciente com expansão repetida confirmada, o médico local foi informado do resultado diagnóstico potencial, e a contribuição da expansão repetida para as características clínicas do paciente foi avaliada. Para expansões repetidas que explicassem total ou parcialmente as características clínicas do paciente, um relatório diagnóstico foi emitido de acordo com os procedimentos padrão locais.

Procedimentos

Para as amostras históricas do NHS usadas na parte de precisão diagnóstica de nosso estudo, as expansões repetidas foram testadas anteriormente usando amplificação por PCR e análise de fragmentos. Southern blotting foi realizado para grandes expansões C9orf72. Na parte de precisão clínica do nosso estudo, expansões repetidas detectadas por sequenciamento de genoma completo em pacientes do Projeto Genomas 100 000 foram testadas por PCR em amostras armazenadas em laboratórios genéticos do NHS. Detalhes adicionais, incluindo sequências de primers, são fornecidos no apêndice (pp 2–3, 25–26).

O DNA foi preparado para o sequenciamento do genoma inteiro usando a preparação da biblioteca TruSeq DNA PCR-Free, e o sequenciamento de 150 bp ou 125 bp de extremidade pareada foi realizado nas plataformas HiSeq 2000 ou HiSeq X na instalação de genomas de alto rendimento da Genomics England e no ICSL . Os genomas foram sequenciados a uma profundidade média de 35× (31× a 37×; apêndice p 27). A genotipagem de repetição curta em tandem foi realizada usando o pacote de software ExpansionHunter versão 3.1.2.25,26 Em resumo, o ExpansionHunter realinha as leituras de sequenciamento em um conjunto predefinido de repetições em tandem curtas para estimar o tamanho de ambos os alelos de um indivíduo (apêndice p 3).

A saída do ExpansionHunter inclui uma estimativa do número de elementos repetidos, tamanho geral e limite de confiança para cada locus avaliado. Diretrizes da Association for Medical Pathology e do College of American Pathologists recomendam a inspeção visual de chamadas de variantes durante a avaliação de rotina de variantes de sequenciamento de alto rendimento.27

No entanto, variantes de repetição em tandem curtas não podem ser visualizadas adequadamente por ferramentas de visualização comuns, como o Integrative Genomics Viewer. de genótipos ExpansionHunter (apêndice pp 3, 15). A inspeção visual do gráfico de empilhamento foi realizada em todas as chamadas de repetição em tandem curtas de sequenciamento de genoma inteiro para confirmar que a previsão do ExpansionHunter para alelos estava inteiramente contida em cada leitura (ou seja, a sequência de repetição era menor que o comprimento de leitura de sequenciamento); para confirmar a presença de uma expansão monoalélica ou bialélica; para detectar chamadas falso-positivas putativas; e para detectar alelos falso-negativos em expansões de repetição bialélicas, como FXN (apêndice pp 4, 16).

O ExpansionHunter estima o tamanho da repetição de dados de sequenciamento de genoma inteiro analisando leituras de sequenciamento que contêm total ou parcialmente uma repetição em tandem curta. Se um alelo de repetição em tandem curto for menor que o comprimento lido, o ExpansionHunter prevê o tamanho exato; se um alelo de repetição em tandem curto for maior que o comprimento de leitura, o ExpansionHunter estima o tamanho da repetição dentro de um IC, dependendo da composição da sequência do locus, da profundidade do sequenciamento e da qualidade do sequenciamento.

Análise estatística

Classificamos as repetições como expandidas pelo sequenciamento do genoma inteiro se o tamanho previsto pelo ExpansionHunter estivesse acima do limite de pré-mutação, ou não expandido se o tamanho previsto estivesse abaixo do limite (apêndice p 28).

Sensibilidade e CIs para detecção de expansão de repetição de sequenciamento de genoma inteiro foram calculados como a proporção de alelos com repetições expandidas entre alelos previamente confirmados por PCR com repetições expandidas. A especificidade foi estimada como a proporção de alelos não expandidos entre as repetições não expandidas previamente testadas por PCR. Uma descrição completa das fórmulas estatísticas é fornecida no apêndice (p 1).

Para comparar tamanhos de repetição por PCR com estimativas de tamanho de repetição por sequenciamento de genoma inteiro, alelos quantificados por PCR foram comparados com tamanhos de repetição previstos pelo ExpansionHunter para alelos mais curtos que o comprimento de leitura em todos os 13 loci de repetição em tandem curtos. A concordância foi calculada pela porcentagem de tamanhos de repetição previstos pelo ExpansionHunter que estavam de acordo com o tamanho quantificado por PCR, levando em consideração o erro de PCR de mais ou menos uma repetição. A análise estatística foi realizada usando o software estatístico R versão 3.6.3.

Papel da fonte de financiamento

O desenho do estudo, inscrição de pacientes, coleta de dados e sequenciamento foram liderados por funcionários da Genomics England e pesquisadores acadêmicos. Os funcionários da Illumina realizaram o sequenciamento de 150 amostras de pacientes como um componente planejado de todo o estudo de precisão diagnóstica de sequenciamento do genoma e desenvolveram o ExpansionHunter. Funcionários da Genomics England, pesquisadores acadêmicos e coautores RTH, ED e MAE realizaram a análise e interpretação de expansões repetidas em pacientes recrutados para o Projeto Genomas 100 000. As fontes de financiamento não tiveram nenhum papel na interpretação dos dados ou na redação do relatório.

Resultados

A precisão diagnóstica do sequenciamento do genoma completo para detectar expansões repetidas foi avaliada em relação a 793 testes de PCR realizados anteriormente no NHS de 404 pacientes (64 pacientes foram testados para mais de uma repetição; figura 1). Destes testes, 183 foram classificados como tendo uma repetição expandida e 610 como não tendo uma expansão repetida por PCR, resultando em um total de 221 alelos individuais expandidos e 1321 não expandidos em 13 loci da doença (apêndice pp 24, 28). O sequenciamento de todo o genoma classificou corretamente 215 de 221 alelos expandidos e 1.316 de 1.321 alelos não expandidos em comparação com os resultados do teste de PCR (apêndice pp 27, 29), mostrando uma sensibilidade inicial de 97,3 por cento (95 por cento CI 94,2-99 ·0) e especificidade de 99,6 por cento (99,1–99,9; tabela 1). Após a correção visual de todas as chamadas com base na qualidade das leituras, a sensibilidade aumentou para 99,1% (96,8–99,9) e a especificidade para 100% (99,7–100; figura 2A, tabela 1). A visualização dos alelos expandidos permitiu a detecção de resultados falso-positivos e a reclassificação de todos os alelos falso-negativos em FXN, dos quais apenas um alelo foi classificado corretamente como expandido em amostras com expansões bialélicas (apêndice pp 17, 18).

O comprimento de repetição foi quantificado por PCR em 509 testes de PCR interrogando 945 alelos em 13 loci de expansão de repetição. As correlações entre ExpansionHunter e PCR para tamanhos de repetição menores e maiores que o comprimento de leitura de sequenciamento (ou seja, 150 bp) são mostradas no apêndice (apêndice p 19). Alta concordância foi observada para repetições menores que o comprimento de leitura, com 92,7 por cento (836 de 902) de concordância entre PCR e ExpansionHunter. Observou-se variabilidade de locus, com alta concordância entre ExpansionHunter e PCR para ATXN2, ATXN7, CACNA1A e HTT, e baixa concordância para DMPK ou TBP (apêndice p 30). Os comprimentos dos alelos maiores que o comprimento lido foram subestimados pelo ExpansionHunter, o que afetou a precisão da chamada em DMPK, FMR1 e FXN (figura 2B, apêndice pp 19, 31).

Embora o ExpansionHunter tenha sido capaz de identificar corretamente grandes alelos expandidos em FMR1, DMPK, C9orf72 e FXN (apêndice p 29), as estimativas de tamanho previsto tendiam a ser menores do que aquelas obtidas por PCR à medida que o tamanho da repetição aumentava dentro da faixa patogênica, o que afetou a capacidade de distinguir entre grandes e pequenas expansões em DMPK, C9orf72 e FXN, ou entre expansões completas e permutações em FMR1 (apêndice p 31). Por exemplo, loci com um comprimento de repetição avaliado por PCR maior que 200 repetições em FMR1 e classificado como uma mutação completa tiveram um tamanho médio de repetição estimado pelo ExpansionHunter de 92,6 (SD 17,8; apêndice p 31).

Para testar a capacidade de detecção de expansão repetida por sequenciamento de genoma inteiro para resolver o diagnóstico de pacientes previamente testados e geneticamente não diagnosticados, testamos 11 631 pacientes com suspeita de distúrbio neurológico genético recrutados para o Projeto 100.000 Genomas (figura 1). Os dados de sequenciamento do genoma completo foram avaliados usando quatro painéis de expansão de repetição diferentes de acordo com as características clínicas do paciente. Os números de pacientes testados com cada um dos quatro painéis são mostrados na tabela 2.

No geral, detectamos e confirmamos visualmente expansões repetidas em amostras de 105 pacientes (tabela 2, apêndice pp 20, 33). Destas, 81 amostras estavam disponíveis para testes de confirmação por PCR e 68 foram confirmadas como tendo uma expansão repetida (0·6 por cento de rendimento): 45 (1,2 por cento) de 3.692 no painel A, oito ({ {18}}·3 por cento ) de 2.743 no painel B, cinco (0,6 por cento ) de 860 no painel C e dez (0,1 por cento) de 6.731 no painel D. Treze de 81 chamadas de expansão não foram confirmados como expansões de repetição patogênicas (taxa de falsa descoberta de 16 por cento). Destes, dois eram alelos não expandidos em ATXN1 e ATXN2, quatro eram chamadas de tamanho intermediário de FMR1 (apêndice p 21) e sete eram permutações de FMR1.

Detalhes clínicos dos 68 pacientes com expansões repetidas confirmadas por PCR, incluindo suas apresentações clínicas, a expansão repetida identificada e a contribuição da expansão repetida para as características clínicas do paciente são fornecidas na tabela 3; os termos HPO, o tamanho da repetição estimado pelo ExpansionHunter e se um relatório de diagnóstico foi emitido estão listados no apêndice (p 33).

Expansões foram observadas em pacientes apresentando uma ampla variedade de apresentações clínicas sobrepostas testadas com painel A (tabela 3, apêndice p 22), incluindo uma expansão de repetição ATXN2 em um paciente com doença de Parkinson de início precoce responsiva à levodopa e história de ataxia cerebelar progressiva , e expansões AR em quatro pacientes clinicamente diagnosticados com doença de Charcot-Marie-Tooth, incluindo um com neuropatia desmielinizante geneticamente confirmada (ou seja, doença de Charcot-Marie-Tooth tipo 1, paciente 42; apêndice p 33). Uma ampla gama de diagnósticos clínicos prévios foi observada em pacientes com expansões de repetição patogênicas.

Por exemplo, em sete pacientes com esclerose lateral amiotrófica ou outra doença do neurônio motor, foram identificadas expansões em AR (n=4) e C9orf72 (n=3). Em pacientes com suspeita de ataxia hereditária, identificamos expansões in loci que não haviam sido avaliadas como parte da investigação diagnóstica de rotina no NHS no momento do recrutamento, incluindo ATN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, FXN, TBP e HTT ( Tabela 3). Também detectamos expansões repetidas em pacientes com características clínicas consistentes com distúrbios alternativos de expansão repetida, incluindo uma expansão C9orf72 na doença de Parkinson familiar e de início precoce (paciente 24, Tabela 3) e expansões repetidas na faixa de penetrância reduzida em HTT (38 repetições) em duas irmãs com distúrbio de movimento, demência, depressão e dificuldades de fala (pacientes 44 e 45), ressaltando o desafio diagnóstico apresentado por esses distúrbios de expansão repetida.

Oito crianças testadas com o painel B apresentaram grandes expansões de repetição CAG (figura 3), sete das quais explicaram completamente as características clínicas do paciente. Seis pacientes não tinham um histórico familiar informativo e não foram oferecidos testes de expansão repetidos como parte de sua avaliação clínica no momento do recrutamento (pacientes 48-53; tabela 3, apêndice p 33). Duas dessas crianças carregavam grandes expansões HTT (90-100 repetições CAG). É importante notar que uma criança herdou a repetição de um pai não afetado, sem histórico familiar de doença de Huntington. O teste familiar está em andamento, mas um alelo de penetrância reduzida foi identificado na família estendida, indicando que a repetição foi expandida em mais de 60 unidades repetidas em uma única geração (paciente 52). No momento da redação deste artigo, ninguém na família apresentava quaisquer sinais da doença de Huntington, e aconselhamento e testes genéticos estão em andamento para os pais. Duas crianças menores de 5 anos apresentavam grandes expansões repetidas em ATXN7 e apresentavam doença multissistêmica complexa. Para uma dessas crianças (paciente 50), seus pais apresentaram problemas de marcha 2 anos após a inscrição no Projeto 100.000 Genomas. Da mesma forma, uma menina de 10 anos com deficiência intelectual apresentou uma 99-expansão repetida em ATXN2, apesar do fato de que ambos os pais foram designados como não afetados, e uma menina de 18 anos com demência foi identificada como portadora de { {19}}repita a expansão em ATN1 (apêndice p 33).

Cinco expansões em DMPK (painel C) foram detectadas, inclusive em uma criança e uma mãe com diagnóstico clínico de distrofia muscular, em dois irmãos com suspeita de miopatia distal e em um adolescente com miopatia congênita (pacientes 54-58). Expansões de FMR1 (painel D) foram detectadas em nove meninos e uma menina, e um diagnóstico de síndrome do X frágil explicou total ou parcialmente as características clínicas apresentadas (pacientes 59-68).

Discussão

O diagnóstico de distúrbios de expansão de repetição é um desafio na área da saúde devido às características clínicas heterogêneas e sobrepostas e achados clínicos inespecíficos, que podem aumentar em gravidade com a idade e em cada geração subsequente. Os distúrbios de expansão repetida estão entre as causas mais comuns de doenças neurológicas hereditárias.4 No entanto, os pacientes podem ser subdiagnosticados, seja porque testes genéticos insuficientes foram realizados ou porque as variantes genéticas causadoras ainda não foram descobertas. As abordagens de teste estão atualmente fragmentadas e os pacientes podem ter o locus de expansão repetido incorreto testado29 ou receber um teste molecular para uma classe diferente de variante devido à sobreposição de características clínicas com outros distúrbios genéticos neurológicos.30

O sequenciamento do genoma completo tem sido usado em vários contextos como um teste de diagnóstico de primeira linha para distúrbios neurológicos raros, mas anteriormente se pensava ter uma baixa capacidade de detectar expansões repetidas.16 Várias ferramentas foram desenvolvidas para identificar expansões repetidas do genoma completo sequenciamento no cenário de pesquisa,31 mas nenhuma dessas abordagens foi aplicada a dados de sequenciamento de genoma completo coletados de um grande número de pacientes em um único serviço de saúde. Apresentamos evidências de que um algoritmo projetado para detectar expansões repetidas do sequenciamento de todo o genoma pode avaliar de forma confiável as expansões repetidas causadoras de doenças mais comuns e resolver casos previamente não diagnosticados geneticamente em uma grande coorte de pacientes com distúrbios neurológicos. Nossos resultados indicam que o sequenciamento de todo o genoma pode distinguir entre alelos não expandidos e expandidos com alta sensibilidade e especificidade em 13 loci de expansão de repetição (que podem ser melhorados ainda mais por inspeção visual), pode calcular com precisão o tamanho de alelos menores que o comprimento lido , e pode subestimar o tamanho de grandes expansões em FMR1, DMPK, FXN e C9orf72.

Quando a detecção de expansões repetidas por sequenciamento de genoma inteiro foi avaliada em relação a resultados positivos e negativos obtidos anteriormente em laboratórios genômicos de diagnóstico clínico usando métodos padrão-ouro, encontramos um mínimo de 97,3% de sensibilidade e 99,6% de especificidade. Além disso, mostramos que tanto a especificidade quanto a sensibilidade podem ser melhoradas pela curadoria manual do pileup lido, permitindo a detecção de resultados falso-positivos e a reclassificação de alelos falso-negativos em amostras com expansões bialélicas. Dos 6.731 pacientes testados para FMR1 (painel D), 124 chamadas foram previstas para serem expandidas. Conseguimos excluir 97 por inspeção visual como prováveis ​​falsos positivos. Isso indica que 1 em cada 54 testes de sequenciamento de genoma completo teria uma chamada FMR1 que precisaria ser inspecionada visualmente para descartar uma possível chamada falso-positiva. O trabalho está em andamento para melhorar o método de genotipagem ExpansionHunter para reduzir o número de chamadas falso-positivas para FMR1.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 repetições) causam doença mais grave, e ataxia espinocerebelar tipo 36 (NOP56), para a qual expansões maiores que 650 repetições são consideradas patogênicas e tamanhos de repetição de 15 a 650 são considerados intermediários e variantes de significado incerto.

Mais de 40 loci de expansão repetida foram identificados; muitos desses loci só foram identificados recentemente e agora estão associados a condições anteriormente inexplicáveis, incluindo ataxia cerebelar com neuropatia e síndrome de arreflexia vestibular (RFC1) 32 e epilepsia mioclônica (SAMD12).33 Os loci de expansão repetida causadores de doenças neurológicas mais comuns foram selecionados para nosso estudo com base na disponibilidade de amostras de controle positivo e negativo.

As descobertas apresentadas aqui sugerem que o ExpansionHunter deve ser capaz de classificar alelos não expandidos e expandidos com precisão em qualquer locus de expansão repetida se os alelos não expandidos forem menores que o comprimento lido (ou seja, 150 bp). Embora a maioria dos loci de expansão repetida tenha alelos menores que 150 bp quando não expandidos, alguns loci para os quais o tamanho do alelo não expandido é próximo a 150 bp (por exemplo, NOTCH2NLC)34 podem ser mais difíceis de genotipar usando essa abordagem. Para loci onde a repetição expandida é significativamente maior que o comprimento de leitura, o sequenciamento do genoma inteiro pode detectar expansões patogênicas (por exemplo, NOP56,35 RFC120,32). As tecnologias emergentes de sequenciamento de leitura longa podem oferecer abordagens complementares ao genotipar grandes expansões.36

A avaliação de expansões repetidas usando sequenciamento de genoma completo em 11 631 pacientes não diagnosticados recrutados para o Projeto Genomas 100 000 rendeu 68 pacientes com achados explicativos. Os pacientes foram recrutados para o Projeto Genomas 100 000 após testes genéticos padronizados; portanto, a proporção de expansões repetidas identificadas nesta coorte representa um aumento do rendimento diagnóstico do teste padrão do NHS, que inclui testes específicos de locus para distúrbios de expansão repetida, como FXN ou DMPK. É importante notar que alguns diagnósticos não foram suspeitos com base nas características clínicas do paciente, incluindo seis pacientes pediátricos que não tinham histórico familiar conhecido de distúrbio de expansão repetido. Os tamanhos médios de expansão de repetição previstos pelo sequenciamento do genoma completo em pacientes pediátricos descritos neste estudo são substancialmente maiores do que a média em adultos, consistente com a expectativa de que expansões maiores estão associadas a um início mais precoce e grave, mesmo em crianças. Mais trabalho é necessário, mas este achado sugere que uma avaliação de patogenicidade dependente da idade e dependente do tamanho da repetição pode apoiar um diagnóstico pediátrico, reduzindo o risco potencial de identificar alelos de risco de início na idade adulta, levando a testes preditivos não solicitados em crianças.

Nossas descobertas permitem o estabelecimento de um fluxo de trabalho de diagnóstico clínico para o sequenciamento do genoma completo (apêndice p 23). Propomos que a inspeção visual seja feita para todas as chamadas classificadas como expandidas para detectar falsos positivos e para expansões bialélicas para as quais apenas um alelo expandido foi detectado (por exemplo, FXN). Recomendamos que os laboratórios usem o ExpansionHunter para avaliar a presença de uma expansão sem aderência à estimativa de tamanho e realizar testes de PCR confirmatórios como um componente padrão do fluxo de trabalho de teste.

Doenças hereditárias raras incluem uma ampla gama de características clínicas, tornando os testes genômicos específicos de locus ineficientes, árduos e caros. Apresentamos evidências de que o sequenciamento de genoma completo de nível clínico com potencial para diagnosticar uma série de doenças neurológicas raras que normalmente se apresentam com uma única base, indel ou variantes de número de cópias pode agora ser estendido para repetir expansões. Como o sequenciamento de todo o genoma fornece um único teste que pode identificar as expansões repetidas mais comuns, além de permitir o teste de mutações pontuais e variantes de número de cópias em genes associados a essas condições simultaneamente, oferece a oportunidade de identificar a maioria dos pacientes com esses distúrbios heterogêneos que não foram diagnosticados usando testes específicos do locus. Na era das terapias emergentes para esses distúrbios, a detecção precoce pode se tornar crucial.37 Esses resultados apoiam a implementação do sequenciamento do genoma completo para detecção de expansões repetidas em laboratórios de diagnóstico clínico, uma abordagem que já foi incluída no NHS England National Genomic Test Directory,38 para investigação de doença neurológica rara não diagnosticada.

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