Eficácia de clareamento do ginsenosídeo F1 por meio da inibição da transferência de melanina em melanócitos humanos co-cultivados e queratinócitos humanos e equivalente tridimensional da pele humana

Os ginsenosídeos são os principais ingredientes ativos do ginseng. Na fisiologia da pele, os ginsenosídeos afetam a regulação do pigmento e exibem atividade antienvelhecimento. De acordo com relatórios recentes, o ginsenoside Rg1 aumenta a melanogênese e a atividade da tirosinase em melanócitos humanos [1]. Em contraste, o ginsenoside F1 (GF1) (sFig. 1), um metabólito produzido pela hidrólise de Rg1, é relatado para inibir a pigmentação visível. Um estudo clínico de Han et al demonstrou um efeito de clareamento da pele de GF1 na pele humana bronzeada artificialmente causada pela produção de interleucina 13 a partir de células T gd epidérmicas humanas [2]. Kim et al mostraram que GF1 reduz a secreção de melanina através da retração dendrítica sem efeitos no conteúdo de melanina intracelular e na expressão de tirosinase em células de melanoma murino B16F10 estimuladas por hormônio melanócito (MSH) [3]. Até o momento, no entanto, nenhuma descoberta direta foi obtida sobre os efeitos de clareamento de GF1 no ambiente epidérmico humano consistindo de melanócitos e queratinócitos em um sistema experimental in vitro.

Interpolação, ao mesmo tempo, descobrimos que também há tirosinase em Cistanche deserticola, e o método de oxidação da taxa de tirosinase-dopa realizou a pesquisa de regulação da atividade da tirosinase no extrato de glicosídeo feniletanóide em Cistanche deserticola, os resultados mostram que: feniletanóide total glicosídeos de Cistanche deserticola O extrato pode diminuir significativamente a atividade da tirosinase. O glicosídeo feniletanóide em Cistanche deserticola também pode efetivamente absorver a radiação ultravioleta da luz solar. A estrutura molecular do glicosídeo feniletanóide possui múltiplos sistemas conjugados. Após a varredura ultravioleta, descobriu-se que tem forte absorção entre 280nm e 380nm, e o comprimento de onda máximo de absorção é 281nm e 333nm. , indicando que o glicosídeo feniletanóide de Cistanche deserticola tem um bom efeito de absorção nos raios ultravioleta e pode prevenir e aliviar melhor os danos da radiação ultravioleta na pele.

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Fig. 1. O efeito de GF1 no conteúdo de melanina e na expressão de tirosinase em melanócitos humanos. GF1 (10 mM, 50 mM, 100 mM) foi tratado com células MNT-1 por 24 h, 48 h e 72 h. (A) Os conteúdos de melanina foram então analisados. (B) O nível de expressão da tirosinase foi analisado. Além disso, GF1 (10, 50, 100 uM) foi tratado com células MNT-1 estimuladas com a-MSH (500 nM) por 48 h e 72 h. (C) Os conteúdos de melanina foram então analisados. (D) O nível de expressão da tirosinase foi analisado. Nós tratamos melanócitos epidérmicos humanos normais primários (NHEM) com GF1 (50 mM e 100 mM) na presença ou ausência de estimulação a-MSH por 48 h. (E) Os conteúdos de melanina foram então analisados. (F) O nível de expressão da tirosinase foi analisado. Células MNT-1 foram tratadas com GF1 (50 mM e 100 mM) por 48 h em um meio de cultura contendo 100 mM ou 500 mM de L-tirosina. (G) Em seguida, o conteúdo de melanina foi analisado. GADPH, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase; GF1, ginsenoside F1.

Aqui, investigamos os efeitos anti-melanogênicos de GF1 em células de coculturas MNT-1/HaCaT e equivalente tridimensional (3-D) da pele humana. Além disso, focamos na formação de dendritos em melanócitos e na transferência de melanossomas para queratinócitos após o tratamento com GF1. Coletivamente, nossos achados demonstram pela primeira vez que GF1 apresentou os efeitos clareadores na epiderme humana coexistindo com melanócitos e queratinócitos.

Para este estudo, células MNT-1 foram cultivadas em meio mínimo essencial (MEM) contendo 20 por cento de soro fetal bovino (FBS), 1 por cento de gentamicina e 20 mM de ácido hidroxietil piperazinoetanossulfônico (HEPES). As células HaCaT foram cultivadas em meio Eagle modificado por dulbecco (DMEM) contendo 10 por cento de FBS, 1 por cento de gentamicina e 20 mM de HEPES. Os melanócitos epidérmicos humanos normais (NHEM) foram adquiridos de (Lonza, Basel, Suíça) e foram cultivados em meio de crescimento de melanócitos-4 (MGM-4). As células foram incubadas a 37 C sob uma atmosfera de 5 por cento de CO2.

Para medir o conteúdo de melanina, as células (2 105 ) foram cultivadas em uma 6-placa de poços por 24 h. As células foram tratadas com as concentrações indicadas de GF1. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e então destacadas com tripsina/EDTA. As células foram lisadas por incubação em 200 mL de 1 N NaOH a 80 C por 2 h. Os lisados ​​celulares foram transferidos para uma placa de poços 96- e a absorbância foi medida a 405 nm.

Para realizar o Western blotting, as células foram lavadas duas vezes com PBS frio e depois lisadas em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) modificado gelado (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 por cento Nonidet P-40 , 0,5 por cento desoxicolato de sódio, 150 mM NaCl) contendo inibidores de protease e conjunto de coquetel inibidor de fosfatase (Calbiochem, San Diego, CA, EUA). As proteínas foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e transferidas para membranas de nitrocelulose. As membranas foram incubadas com anticorpos primários a 4 C por 24 h, depois lavadas com solução salina tamponada com tris incluindo 0,1 por cento de Tween-20, expostas a anticorpos secundários conjugados com peroxidase por 1 h em temperatura ambiente, lavadas e depois visualizadas usando um sistema de imagem Odyssey.

Para analisar a transferência de melanossoma, células MNT{{0}}/HaCaT foram cultivadas em uma 12-placa de poços na proporção de 1 para 10 por 24 h e, em seguida, GF1 foi tratado com a concentração indicada. As células foram lavadas duas vezes com PBS frio e fixadas com 3,5 por cento de paraformaldeído por 10 min. As células foram lavadas e tratadas com 0,1 por cento de Triton X-100 por 10 min e, em seguida, 0,5 por cento de albumina de soro bovino (BSA) por 1 h. Anticorpos contra a proteína 1 relacionada à tirosinase (1:200, Vermelho) e citoqueratina-18 (1:200, Verde) foram utilizados para a detecção de melanócitos e queratinócitos.

MelanoDerm Skin Tissue Model (TM) é um equivalente de pele humana {{0}}D reconstituído viável contendo melanócitos e queratinócitos normais (MatTek Corp., Ashland, MA). Usamos MelanoDerm TM (MEL-300-A) que é derivado de doadores asiáticos. Eles foram mantidos no novo meio de manutenção-113 conforme recomendado pelo fabricante. GF1 foi aplicado ao MelanoDerm TM nos dias 0, 4, 6, 8, 11, 13 e 15. Antes do tratamento com GF1, os tecidos foram lavados com 1 mL de PBS para remover qualquer composto residual. Os tecidos foram fixados no dia 18 para análise histológica. A avaliação histológica foi realizada em microscópio de luz (Bx-41; Olympus, Tóquio, Japão) e as fotomicrografias foram feitas com câmera digital (DP72; Olympus). Melanoderm foi fixado em uma solução de formaldeído tamponado a 4 por cento para a coloração. As amostras foram embebidas em parafina, cortadas na espessura de 3 mm e coradas com Hematoxilina e Eosina e solução de coloração de Fontana e Mason. Todos os dados são expressos como valores médios DP (desvio padrão), e o teste t de Student foi usado para comparações estatísticas. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo (valores de p individuais são dados nas legendas das figuras).

Para estabelecer o efeito de GF1 em melanócitos humanos, tratamos células de melanoma humano altamente pigmentadas (MNT-1) com GF1 por 24, 48 e 72 h, seguido por uma análise do conteúdo de melanina intracelular e expressão da proteína tirosinase . Conforme mostrado na Fig. 1A, GF1 não teve efeito inibitório no conteúdo de melanina dentro de uma faixa de concentração de 10e100 mM. Além disso, a expressão da tirosinase não foi diminuída por GF1 em células MNT-1 (Fig. 1B, sFig. 2A). O tratamento de células MNT-1 estimuladas com a-MSH com GF1 por 48 h e 72 h não resultou em supressão do conteúdo de melanina (Fig. 1C) ou expressão de tirosinase (Fig. 1D, sFig. 2B). Para confirmar ainda mais o efeito de GF1 em melanócitos humanos, tratamos NHEM primário com GF1 na presença ou ausência de estimulação a-MSH por 48 h. Semelhante aos dados obtidos com células MNT-1, GF1 não afetou o conteúdo de melanina (Fig. 1E) ou a expressão de tirosinase (Fig. 1F, sFig. 2C) em NHEM. Finalmente, avaliamos se o nível de L-tirosina no meio de cultura afeta a atividade de GF1 porque a L-tirosina é o substrato da tirosinase para a síntese de melanina. Assim, as células MNT-1 foram tratadas com GF1 por 48 h no meio de cultura contendo 100 mM ou 500 mM de L-tirosina. Conforme mostrado na Fig. 1G, GF1 não inibiu o conteúdo de melanina nas células MNT-1, independentemente da concentração de L-tirosina.

Fig. 2. O efeito de GF1 na formação de dendritos e transferência de melanossomas em células MNT-1/HaCaTcocultivadas e um equivalente de pele humana 3-D. Células MNT-1/HaCaT cocultivadas foram tratadas com 100 mM GF1 na presença ou ausência de estimulação a-MSH (500 nM) por 48 h. (A) Após a fixação, observamos a formação de dendritos nos melanócitos por meio de microscopia óptica (barra de escala; 50 mm). (B) Para imunocoloração, coramos melanossomas com anticorpo TRP-1 (cor vermelha) e queratinócitos com citoqueratina-18 (cor verde). As setas brancas indicam melanossoma transferido para HaCaT de células MNT-1 (barra de escala; 20 mm). Equivalente de pele humana (MelanoDerm; n ¼ 3) foi tratado com ácido kójico a 1 por cento como um composto clareador de referência e GF1 (10 e 50 ug/ml) por 18 dias. (C) Após o tratamento, os equivalentes de pele foram fotografados. (D) O valor de 6 L (grau de leveza em comparação com o controle tratado com veículo) para cada amostra de teste foi calculado. (E) Coloração de hematoxilina e eosina (H&E) de seções de tecido. (F) Coloração Fontana-Mason (F&M) de seções de tecido. As lâminas foram fixadas em solução de formaldeído e embebidas em parafina para a coloração (barra de escala; 50 mm). As setas pretas indicam o melanossoma transferido dos melanócitos na camada basal para os queratinócitos na camada superior. As setas azuis indicam os melanócitos formando os dendritos estendidos. (*p < 0,05, **p < 0,01, *p < 0,001). CON, controle; GF1, ginsenoside F1; KA, ácido kójico.

Após a descoberta de que o GF1 não exerce um efeito anti-melanogênico em melanócitos humanos monocultivados, analisamos ainda se o GF1 afeta a síntese de melanina em melanócitos em um sistema experimental contendo queratinócitos e melanócitos com a possibilidade de comunicação célula-célula. Células MNT-1 e HaCaT (uma linha celular de queratinócito normal humano imortalizado) foram cocultivadas com GF1 100 mM na presença ou ausência de irradiação UV-B. Após 48 h (sFig. 3A) ou 72 h (sFig. 3B), avaliamos o conteúdo de melanina de MNT isolado-1 e células cocultivadas. Nossos dados mostraram que GF1 não inibe a síntese de melanina tanto em MNT isolado-1 quanto em grupos de células cocultivadas.

Além da síntese de melanina, focamos na eficácia inibitória de GF1 na transferência de melanossomas de melanócitos para queratinócitos. Especificamente, células MNT-1/HaCaT cocultivadas foram tratadas com 100 mM de GF1 na presença ou ausência de estimulação a-MSH (Fig. 2A), seguidas por um exame da formação de dendritos em melanócitos, que é necessário para a transferência de melanossomas . Curiosamente, os dendritos esticados induzidos por aMSH foram retraídos após o tratamento com GF1. Em seguida, coramos melanossomas TRP-1-positivos (vermelho) para células MNT1 e citoqueratina-18 (verde) para células HaCaT em coculturas. Como mostrado na Fig. 2B, TRP-1-melanossomas positivos em células MNT-1 foram transferidos para células HaCaT após estimulação a-MSH, que foi significativamente inibida por GF1. Esses resultados indicam que o GF1 suprime a transferência de melanossomas, causando retração dendrítica dos melanócitos.

Para estender esta investigação a um sistema mais fisiológico, examinamos a capacidade de clareamento de GF1 em um equivalente de pele humana 3-D, que é uma camada epidérmica composta por melanócitos e queratinócitos. Na Fig. 2C, o tecido tratado com GF1-parecia mais claro que o tecido de controle, e o valor L (um índice de claridade/escuridão) foi alterado após o tratamento com GF1 (Fig. 2D). Além disso, a coloração de hematoxilina e eosina das seções de tecido não revelou colapso ou toxicidade do tecido (Fig. 2E). Experimentos de coloração de Fontana e Mason mostraram que GF1 inibe a formação de dendritos de melanócitos na camada basal e simultaneamente suprime a transferência de melanossomas de melanócitos da camada basal para queratinócitos da camada superior diferenciada (Fig. 2F). Essas descobertas suportam coletivamente a eficácia inibitória do GF1 na transferência de melanossomas, levando à promoção do clareamento no modelo de tecido da pele humana.

No presente estudo, GF1 não inibiu a síntese de melanina e a expressão de tirosinase; em vez disso, GF1 aumentou ligeiramente o conteúdo de melanina intracelular e a expressão de tirosinase em células MNT-1 e células cocultivadas (Fig. 1A e 1B e sFig. 3A). No entanto, simultaneamente, descobrimos que GF1 inibiu a transferência de melanossomas através da diminuição da formação de dendritos de melanócitos. Suspeitamos que o aumento do conteúdo intracelular de melanina por GF1 pode ser causado pelo acúmulo de melanossomas devido ao bloqueio da transferência do melanossomo e indução da expressão da tirosinase. A pigmentação visível da pele é determinada pela quantidade de dispersão de melanossomas das várias áreas de dendritos estendidos de melanócitos para os queratinócitos circundantes [4]. Vários compostos, como a centaureidina e a metilofiopogonanona B, mostraram eficácia clareadora, levando à retração dos dendritos dos melanócitos, sem influenciar a expressão de enzimas melanogênicas ou a síntese de melanina [5]. Portanto, o bloqueio da transferência de melanossomas para os queratinócitos a partir dos melanócitos é considerado uma abordagem eficaz para induzir um efeito de clareamento, embora a biossíntese de melanina não seja inibida. Portanto, consideramos que o aumento do conteúdo de melanina pelo GF1 tem pouco impacto na eficácia clareadora do GF1. Além disso, os melanossomas acumulados seriam degradados pela autofagia para a homeostase da pele, embora o destino dos melanossomas não seja claro [6].

Demonstramos pela primeira vez que GF1 suprime a formação de dendritos induzida por a-MSH, resultando na inibição da transferência de melanossomas para queratinócitos em coculturas de células humanas. Além disso, o GF1 interrompeu a transferência de melanina dos melanócitos na camada basal para os queratinócitos na camada superior, exercendo um efeito clareador no equivalente da pele humana. Experimentos recentes de cocultura indicam que os melanócitos fornecem pigmento aos queratinócitos por meio de alterações na morfologia dendrítica, como a desorganização dos microfilamentos de b-tubulina no citoesqueleto intracelular [7,8]. O monofosfato de adenosina cíclico, um indutor da melanogênese, medeia a formação de dendritos através da regulação positiva de Rac e regulação negativa da atividade Rho [9,10]. Portanto, estudos futuros do nosso grupo focarão em uma avaliação abrangente das proteínas-alvo do GF1, como moléculas envolvidas na via de sinalização do monofosfato cíclico de adenosina.

Coletivamente, nossos resultados fornecem evidências preliminares de que o GF1 tem potencial para desenvolvimento como um reagente clareador eficaz para o tratamento de distúrbios pigmentares e clareamento da cor escura da pele como ingrediente cosmético.

Conflitos de interesse

Todos os autores contribuintes declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada e financiada pelo Amorepacific R&D Center.

Referências

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[2] Han J, Lee E, Kim E, Yeom MH, Kwon O, Yoon TH, Lee TR, Kim K. Papel da interleucina 13 derivada de células T gd epidérmicas no efeito de clareamento da pele do Ginsenoside F1. Exp Dermatol 2014;23:860e2.

[3] Kim JH, Baek EJ, Lee EJ, Yeom MH, Park JS, Lee KW, Kang NJ. Ginsenoside F1 atenua a hiperpigmentação em células de melanoma B16F10 induzindo a retração dendrítica e ativando a sinalização Rho. Exp Dermatol 2015;24:150e2.

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[6] Katsuyama Y, Taira N, Yoshioka M, Okano Y, Masaki H. A interrupção do transporte de melanossomas em melanócitos tratados com teofilina causa sua degradação por autofagia. Biochem Biophys Res Commun 2017;485: 126e30.

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[10] Ma HJ, Ma HY, Yang Y, Li PC, Zi SX, Jia CY, Chen R. hormônio estimulador de a-melanócitos (MSH) e prostaglandina E2 (PGE2) conduzem a transferência de melanossoma promovendo a entrega de filopódios e derramamento de grânulos esferoides: evidências da observação de microscopia de força atômica. J Dermatol Sci 2014;76: 222e30.

Chang-Seok Lee 1,3, Gibaeg Nam 1, Il-Hong Bae 1, Junseong Park 1,2,*

1 Amorepacific CO R&D Center, Yongin-si, República da Coreia

2Departamento de Engenharia Química, Universidade Nacional de Chungbuk, Cheongju-si, Chungbuk, República da Coreia

3Departamento de Beleza e Ciência Cosmética, Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade Eulji, Seongnam-si, República da Coreia

For more information:1950477648nn@gmail.com