Cistanche para tratar inflamação e doença renal: Qual é a causa do papel patogênico da inflamação no envolvimento renal na cistinopatia?

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A interação entre galectina-3 e cistinose revela um papel patogênico da inflamação no envolvimento renal da cistinose

Tatiana Lobry^1,2 e outros

Inflamaçãoestá envolvido na patogênese de muitos distúrbios. No entanto, os mecanismos subjacentes são muitas vezes desconhecidos. Aqui, testamos secistinose, a proteína envolvidacistinose, é um regulador crítico da galectina^-3, um membro da família de proteínas de ligação de b-galactosidase, duranteinflamação. Cistinoseé um distúrbio de armazenamento lisossomal e, apesar da expressão ubíqua da cistinose, arimé o principal órgão afetado pela doença.Cistinosefoi encontrado para melhorar a localização lisossomal e degradação de galectina-3. Em Ctns^–/–ratos, um modelo de rato decistinose, galectina-3 é superexpressa norim. A ausência de galectina-3 em camundongos cistinóticos melhora a função e estrutura renal patológicas e diminui a infiltração de macrófagos/monócitos no rim dos Ctns^–/–Gal3^–/–ratos em comparação com Ctns^–/– ratos. Esses dados sugerem fortemente que a galectina-3 medeiainflamaçãoenvolvido emrimprogressão da doença na cistinose. Além disso, a galectina-3 interage com a citocina pró-inflamatória MonocyteChemoattractant Protein-1, que estimula o recrutamento de monócitos/macrófagos, e provou ser significativamente aumentada no soro de camundongos Ctns–/– e também pacientes comcistinose. Assim, nossas descobertas destacam um novo papel para a interação da cistinose e galectina-3 na inflamação e fornecem uma explicação mecanicista adicional para arimdoença da cistinose. Isso pode levar à identificação de novos alvos de drogas para retardarcistinoseprogressão.

PALAVRAS-CHAVE:doença renal crônica; cistinose; galectina-3;inflamação; proteína quimioatraente de monócitos-1

cistanche pode tratar doença renal crônica e cistinose

A causa raiz da inflamação é que o óxido nítrico pode levar à produção de células inflamatórias.Cistancheé um valioso remédio herbal chinês. Seus ingredientes ativos podem inibir a secreção de óxido nítrico e desempenhar um papel na prevenção e tratamento de inflamações e doenças renais.

Declaração de tradução

Apesar do tratamento, os pacientes ainda progridem para insuficiência renal terminal. Neste estudo, mostramos que a ausência decistinoseresulta em degradação lisossômica de galectina-3 (Gal-3), levando ainflamaçãoe a progressãodoença renal crônicadentrocistinose. Esses achados abrem novas perspectivas sobre potenciais alvos terapêuticos que podem limitar ou retardar a degeneração renal em pacientes comcistinose. Assim, anti-inflamatórios e inibidores de Gal-3 como anti-inflamatórios não esteroidais ou indometacina podem melhorar a patogênese renal na cistinose.

Inflamaçãoé uma resposta aguda normal de um organismo a lesão ou infecção,¹mas crônicainflamaçãoestá associada a danos nos tecidos. No caso de doenças crônicas, como diabetes, os tecidos danificados ativam o sistema imunológico, levando a uma resposta inflamatória contínua e, eventualmente, à degeneração tecidual.² As citocinas são moduladoresinflamaçãoe são capazes de ativar ou resolver oinflamaçãoprocesso.3 Em pacientes comdoença renal crônica(CKD), concentração plasmática elevada de citocinas (interleucina [IL]-6 e fator de necrose tumoral-a) einflamaçãomarcadores (proteína C-reativa, IL-6, hialuronano e neopterina) estão associados à progressão para doença renal terminal. .

Cistinoseé uma doença metabólica autossômica recessiva que pertence à família dos distúrbios de armazenamento lisossômico e é caracterizada pelo acúmulo de cistina em todos os órgãos.⁵ O gene defeituoso emcistinose, CTNS, codifica o cotransportador lisossomal cistina/próton, cistinose.^6,7 Embora a CTNS seja ubiquamente expressa, arimé o primeiro órgão afetado em pessoas comcistinose. Os pacientes geralmente apresentam no primeiro ano de vida a síndrome de Fanconi, caracterizada por graves distúrbios hidroeletrolíticos, crescimento deficiente e raquitismo.⁸A DRC subsequentemente se desenvolve, que progride para doença renal terminal e requerrimtransplantação. O acúmulo de cistina em todos os tecidos eventualmente leva à disfunção de múltiplos órgãos; os pacientes apresentam fotofobia e cegueira, hipotireoidismo, hipogonadismo, diabetes, miopatia e deterioração do sistema nervoso central.⁹ No fundo do C57BL/6, um modelo de camundongo knockout (Ctns^–/–) 10 replica o fenótipo renal de pacientes cistinóticos,¹¹ bem como deposição de cristais de cistina na córnea¹²e disfunção da tireoide.¹³

No presente estudo, revelamos um novo papel paracistinosedentroinflamaçãopor meio de sua interação com Gal-3. Gal-3 é um membro da família de proteínas de ligação a lectinas e b-galactosídeos ²¹ e está envolvido em múltiplas funções biológicas, incluindoinflamação.²²Dentro do contexto derimdoenças, a inibição de Gal-3 mostrou reduzir a expressão de marcadores pró-inflamatórios e fibrose renal e prevenir o declínio da taxa de filtração glomerular em modelos de hiperaldosteronismo, hipertensão ou obesidade.^23–26Aqui nós fornecemos evidências de que, emcistinose, a ausência decistinoseleva à superexpressão de Gal-3 emrins, aumentando a infiltração de macrófagos e a progressão da DRC. Além disso, identificamos a proteína quimioatraente de monócitos-1 (MCP-1) como um mediador potencial, revelando novos alvos gênicos para terapia medicamentosa. RESULTADOS Gal-3 interage com a cistinose por meio de seu domínio de reconhecimento de carboidratos Para identificar interação específica parceiros usando espectrometria de massa quantitativa, Madin-Darby caninorim(MDCK) células foram transduzidas com um construto lentiviral para expressar de forma estável a proteína de fusão cistinose-proteína fluorescente FL verde (GFP). Além das 9 subunidades da adenosina trifosfatase H+ do tipo vacuolar publicadas anteriormente,¹⁹Gal-3 foi identificada como uma das proteínas que interagem comcistinose(Figura 1a). Esta interação foi ainda confirmada por co-imunoprecipitação seguida de Western blotting (Figura 1b e c). Além disso, mostramos que a interação entre Gal-3 ecistinosefoi mediado pelo domínio de reconhecimento de carboidratos Gal-3 (CRD) localizado na cauda C-terminal da proteína. A interação foi inibida pelo tiodigalactosídeo, um potente inibidor das interações galectina-carboidrato (Figura 1d). Como todas as galectinas, Gal-3 tem afinidade por proteínas glicosiladas,21 então é provável que a interação com Gal-3 ocorra através da porção glicosilada de cistinose localizada na cauda N-terminal intralisossomal da proteína.²⁷

A cistinosina melhora a localização e degradação lisossômica de Gal-3

Para verificar a localização lisossomal potencial de Gal-3 ao interagir comcistinose, mostramos que Gal-3, como a catepsina D (uma protease intralisossomal), foi protegida da digestão pela proteinase K, enquanto ambas as proteínas foram digeridas quando os lisossomos foram permeabilizados com Triton X- 100 (Figura 2a e Suplementação Figura S1). Dados semelhantes foram obtidos em lisossomos isolados de fígado de camundongo, confirmando a localização lisossomal de Gal-3 in vivo (Figura 2b ec). Devido à ausência de um anticorpo confiável para detectarcistinose, a imunocoloração foi realizada emcistinoseLinhas celulares MDCK que expressam -GFP com um anticorpo anti-Gal-3. Confirmou a presença de Gal-3 no lúmen dos lisossomos, enquanto cistinose-GFP e Lamp-2 (uma proteína transmembrana lisossomal) foram encontrados apenas na membrana das vesículas (Figura 2d).

Para investigar secistinosinaesteve envolvido no tráfico de Gal-3, analisamos a dinâmica de amboscistinosee vesículas Gal-3-positivas usando microscopia de fluorescência FL de reflexão interna total de células vivas de duas cores em fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) de tipo selvagem (WT) e Ctns^–/–camundongos expressando CTNS-DsRed e Gal-3–GFP. Nossa análise confirmou quecistinosee Gal-3 sofrem colocalização verdadeira em Ctns–/– MEFs conforme validado pela distribuição espaço-temporal semelhante dessas moléculas na zona de microscopia de fluorescência FL de reflexão interna total (Figura 2e). Os dados em WT MEFs foram semelhantes (dados não mostrados). Além disso, quando os MEFs transfectados apenas com Gal- 3–GFP foram analisados, Gal-3–GFP foi encontrado no citoplasma e nenhuma estrutura vesicular distinta foi observada, ao contrário da co-transfecção com CTNS-DsRed ( dados não mostrados).

Esses dados foram confirmados em células 293T, nas quais um forte sinal de GFP no citoplasma foi observado em células expressando apenas Gal-3–GFP, enquanto em células expressando Gal-3–GFP ecistinosina-DsRed, Gal-3–GFP foi localizado principalmente nos lisossomos que expressam cistinose-DsRed (Figura 3a). Além disso, quantificação da expressão da proteína Gal-3 em células transfectadas com Gal-3–GFP sozinho ou Gal- 3–GFP e CTNS-DsRed, e Gal-3–GFP e DsRed como controle, mostrou significativamente menos proteínas Gal-3–GFP em células cotransfectadas com CTNS-DsRed em comparação com células transfectadas com Gal-3–GFP isoladamente ou cotransfectadas com DsRed (Figura 3b). Ao todo, esses resultados sugerem quecistinosinamelhora a localização lisossomal e degradação de Gal-3. A cistinosina mostrou estar envolvida na CMA.28 A proteína de choque térmico de 70 kDa (Hsc70) participa da CMA auxiliando o desdobramento e a translocação de proteínas de substrato através da membrana para o lúmen lisossomal de uma maneira dependente de LAMP2A.29,30 Porque Gal{ {8}} foi proposto para ser degradado por CMA,31 investigamos a localização de Gal-3 em relação a Hsc70 em MEFs cistinóticos. A análise de microscopia confocal confirmou a colocalização de Gal-3-GFP em estruturas positivas de Hsc70- em WT (dados não mostrados) e Ctns^–/–células (Figura 3c), apoiando o co-transporte de Gal-3 com Hsc70 e sugerindo que a internalização lisossomal, mas não o reconhecimento de Gal-3 pela chaperona é defeituoso emcistinose.

Gal-3 está envolvido na inflamação renal em Ctns^–/–ratos

Para estudar o papel de Gal-3 emcistinosein vivo, geramos um modelo de camundongo knockout duplo deficiente em amboscistinosinae Gal-3 (Ctns^–/–Gal-3^–/–ratos). WT, Ctns^–/–, e Gal-3^–/–camundongos foram usados ​​como sujeitos de controle. No C57BL/6 Ctns^–/–camundongos, as anomalias renais aparecem por volta dos 10 meses de idade.11 Portanto, os estudos foram realizados aos 8 a 9 meses, quandorimanomalias começam a ser detectadas, e aos 12 a 15 meses, quando as anomalias renais progrediram. Porque o conteúdo de cistina foi diferente em Ctns masculinos e femininos^–/– rins, eles foram analisados ​​separadamente. Se o conteúdo de cistina aumenta com a idade em ambos os genótipos, nenhuma diferença significativa foi observada nos rins masculinos e femininos entre os camundongos Ctns–/– Gal-3–/– e Ctns^–/– camundongos com 8 a 9 meses e 12 a 15 meses de idade (Figura 4a).

A função renal foi avaliada no soro e na urina e não foi observada diferença significativa entre WT e Ctns^–/–camundongos em 8 a 9 meses (dados não mostrados), mas em 12 a 15 meses, Ctns^–/–camundongos apresentaram níveis séricos de creatinina e uréia significativamente mais elevados em comparação com camundongos WT. Curiosamente, ctns^–/–Gal-3^–/–camundongos exibiram função renal melhorada em comparação com Ctns^–/–camundongos de 12 a 15 meses, com creatinina sérica mais baixa (P < 0.05) e ureia (P < 0,05; Tabela 1).

Estudos histológicos de camundongos de 8- a 9-meses e de 12- a 15-meses de idaderimseções revelaram a presença de anomalias graves em Ctns^–/– rins, incluindo atrofia tubular, glomérulos retraídos e infiltrados mononucleares. A análise cega de cortes renais variou a extensão do dano cortical de 1 (estrutura de tecido preservada) a 6. A pontuação média para Ctns^–/–camundongos foi 2.64 - 0,36 aos 9 meses de idade (n ¼ 7) e 4,12 0.37 aos 12 a 15 meses de idade (n ¼ 16). Nos rins de Ctns^–/–Gal-3^–/–camundongos da mesma idade, essas anomalias foram significativamente menos extensas: 1.62 - 0.11 aos 9 meses (n ¼ 21; P < 0.05,="" mann-whitney="" t-="" teste)="" e="" 3.04="" -="" 0.22="" em="" 12="" a="" 15="" meses="" (n="" ¼="" 33;="" p="">< 0,05,="" teste="" t="" de="" mann-whitney)="" (figura="" 4b="" e="" figura="" suplementar="" s2).="" além="" disso,="" uma="" porcentagem="" de="" atrofia="" tubular="" foi="" atribuída="" a="" cada="" tecido,="" e="" a="" média="" para="">^–/–ratos e ctns^–/–Gal-3^–/–camundongos foram 66 por cento e 42 por cento, respectivamente, em 12 a 15 meses (P ¼ 0.01). Além disso, uma diferença marcante entre Ctns^–/–e Ctns^–/– Gal-3^–/– rimfoi a presença de poucos infiltrados mononucleares nas Ctns^–/–Gal-3^–/–seções, enquanto infiltrados pesados ​​foram consistentemente observados no Ctns^–/– rim(Figura 4b).

Caracterizamos os infiltrados mononucleares observados por exame histológico em Ctns de 8- a 9-meses de idade^–/– rinscomo macrófagos/monócitos por co-imunocoloração com CD68 e CD45 e com CD68 e classe de histocompatibilidade principal II (Figura complementar S3), mas não com CD68 e CD163, sugerindo que esses macrófagos têm um perfil pró-inflamatório semelhante a M1-.32 ,33 A quantificação de células CD68- positivas revelou significativamente menos macrófagos/monócitos em WT, Gal-3^–/–, e Ctns^–/–Gal-3^–/– rinscomparado com Ctns^–/– rins(Figura 4c), confirmando os dados histológicos (Figura 4b).

Em conjunto, esses achados sugerem que Gal-3 está envolvido no recrutamento de macrófagos/monócitos em cistinoserinse que sua ausência melhora a doença renal em Ctns^–/–ratos. Por isso sugere queinflamaçãoé responsável, pelo menos em parte, pela deterioração renal em Ctns^–/– ratos.

Rins deficientes em Ctns exibem superexpressão de Gal-3

Usando a análise de Western blot, descobrimos que a expressão Gal-3 aumentou significativamente emrinsde 12-Ctn de um mês^s–/–camundongos comparados com camundongos WT (Figura 5a e b). Para investigar se esta expressão aumentada de Gal-3 é específica para Ctns^–/– rins, quantificamos a expressão de Gal-3 nos níveis de transcrição e proteína emrinsde camundongos com DRC induzida por operação padrão de nefrectomia em 2-degrau subtotal e de animais que foram submetidos a uma operação simulada. WT e Ctns^–/–camundongos foram usados ​​como sujeitos de controle. As transcrições de Gal-3 foram significativamente aumentadas em Ctns–/– e rins falsos, mas altamente aumentadas em DRCrinscomparado com camundongos WT (Figura 5c). Em contraste, no nível de proteína, Gal-3 foi detectado apenas em Ctns^–/–rins, sugerindo fortemente que apenas Ctns^–/–os rins foram incapazes de degradar a proteína Gal-3 (Figura 5d). Coloração imunofluorescente de Gal-3 no murinorimaos 8 a 9 meses também demonstrou superexpressão de Gal-3 nas Ctns^–/– rinscomparado com WTrins(Figura 5e). Além disso, Gal-3 foi expressa por macrófagos CD68+, bem como por células renais em Ctns^–/– rinsaos 8 a 9 meses (Figura complementar S4). Ao todo, esses dados são consistentes com a diminuição da degradação de Gal-3 na ausência decistinosecomo demonstrado in vitro (Figura 3a e b), levando ao acúmulo de proteína Gal-3 em Ctns^–/– rins.

A ausência de cistinosina leva ao aumento da MCP sérica-1 via regulação positiva de Gal-3

Gal-3 regulainflamaçãoatravés de diferentes mecanismos.34 Assim, para obter mais informações sobre o mecanismo emcistinose, investigamos a expressão de diferentes citocinas pró-inflamatórias ou anti-inflamatórias no soro de 12- a 15-mês de idade WT, Ctns^–/–, Gal-3^–/–, e Ctns^–/–Gal- 3^–/–ratos. Seis níveis de citocinas foram medidos por matriz citométrica de camundongo, MCP-1, interferon-g, fator de necrose tumoral e IL-10, IL-6 e IL-12p70. Apenas a expressão de MCP-1 foi significativamente aumentada no soro de camundongos Ctns–/– em comparação com camundongos WT e Gal-3–/– e também com Ctns^–/–Gal-3^–/–camundongos, cujos níveis séricos de MCP-1 eram comparáveis ​​com camundongos WT (Figura 6a). A MCP-1 é produzida por diferentes tipos de células, sendo a principal fonte de MCP-1 macrófagos e monócitos,35 e atua como quimioatraente para monócitos e macrófagos regulando sua migração e infiltração. Em contraste, na mesma idade, a expressão de Gal-3 foi semelhante no soro de camundongos Ctns–/– (44,33 9,81 ng/ml; n ¼ 5) e camundongos WT (40.{{12} },41 ng/ml; n=7).

A relação entre Gal-3 e MCP-1 foi investigada por co-imunoprecipitação usando Gal-3–GFP e MCP-1–DsRed– ou Gal-3– GFP e CTNS-DsRed– (como controle positivo) expressando células 293T. A interação entre Gal-3 e MCP-1 foi observada (Figura 6b), sugerindo uma indução direta de MCP-1 por Gal-3. A incubação com N-Acetil-D-lactosamina (LacNAc), um inibidor de Gal-3 CRD, mostrou que, em contraste comcistinosinainteração, o CRD não está envolvido na interação entre Gal-3 e MCP-1 (Figura 6c).

Para avaliar se esse achado é relevante em humanos, medimos os níveis de Gal-3 e MCP-1 em pacientes comcistinoseque não estavam em terapia imunossupressora ou em uso de medicamentos anti-inflamatórios. Embora o nível de Gal-3 esteja ligeiramente aumentado no soro de pacientes com cistinose em comparação com doadores saudáveis, a diferença não foi significativa (Figura 6e), confirmando nossos resultados obtidos em Ctns^–/–ratos. Apenas 2 pacientes apresentaram alto nível de Gal-3 (25,34 e 39,54 ng/ml); eles foram considerados outliers e, portanto, não foram incluídos na Figura 6e. Em contraste, usando um ensaio imunossorvente enzimático direcionado contra MCP humano-1 (Figura 6d), os níveis séricos de MCP-1 foram significativamente aumentados em pacientes comcistinose(252.1 - 18,4 pg/ml; n ¼ 19; faixa etária de 1 a 23 anos) apesar do tratamento com cisteamina em comparação com indivíduos controles saudáveis ​​(166.9 -13,5 pg/ml; n ¼ 1 0; faixa etária de 8 a 63 anos) (P < 0,001).="" nenhuma="" correlação="" foi="" encontrada="" entre="" idade="" e="" nível="" de="" mcp{14}}="" em="" ambos="" os="" pacientes="">cistinosee doadores saudáveis ​​(dados não mostrados).

Cistanchetemanti-inflamatóriopropriedades

DISCUSSÃO

Apesar do fato de que a cistina se acumula em todos os tecidos em pacientes afetados comcistinose, os rins são os órgãos mais vulneráveis ​​a danos. Assim, acreditamos que o acúmulo de cistina não é o único responsável pela degeneração renal. Aqui, descrevemos um novo papel paracistinosinana regulamentação deinflamaçãoenvolvidos na progressão da doença renal crônica emcistinose. Este estudo pode explicar por que os pacientes evoluem para insuficiência renal em estágio final apesar de serem submetidos à terapia com cisteamina.

O estudo dos parceiros moleculares da cistinose revelou uma interação direta com Gal-3, que pode ser inibida por inibidores de Gal-3 CRD. Estudos recentes mostraram que Gal-3 pode interagir com glicanos localizados no lúmen lisossomal após danos lisossômicos, como acúmulo de cristais.36 Em nosso estudo, a interação entre Gal-3 ecistinosinafoi estudado em células saudáveis ​​expressandocistinosinae, portanto, não acumulando cristais de cisteína ou cistina. Além disso, a superexpressão de Gal-3 e cistinosina em células saudáveis ​​modificou a localização subcelular de Gal-3, que foi então localizada nos lisossomos, em comparação com a superexpressão de Gal-3 apenas, que estava localizado no citoplasma. Esses resultados sugerem fortemente que a interação entre Gal-3 e cistinosina está ocorrendo independentemente do dano lisossomal e que a cistinosina é ativamente responsável pela localização lisossômica de Gal-3. Anteriormente Gal-3 mostrou ser degradado através de proteólise dependente de lisossomas na ausência de Abl e Arg, 2 tirosina quinases.³¹

Além disso, mostramos quecistinosee Gal-3 co-localizam em estruturas vesiculares dinâmicas e são mobilizados juntos de maneira espaço-temporal.Cistinosinaanteriormente foi associado aos mecanismos de tráfico do LAMP2A lisossomal, o único receptor CMA conhecido, que está mal localizado emcistinose.²⁸Demonstrou-se que a degradação de Gal-3 é mediada por CMA.³¹A análise de microscopia confocal confirmou a colocalização de Gal-3 em Hsc70-estruturas positivas em ambas as Ctns^–/– e células WT, apoiando o co-transporte de Gal-3 com Hsc70 para apresentação no lisossomo e degradação por CMA como Hsc70 auxilia a translocação de proteínas substrato através da membrana para o lúmen lisossomal.^29,30Uma possível interpretação de nossos resultados é quecistinosinaregula o tráfico e a entrega de Gal-3 aos lisossomos ativos de CMA para degradação.

Este novo caminho decistinosinaA localização e degradação lisossômica dependente de Gal-3 é suportada in vivo, pois camundongos deficientes em Ctns exibem superexpressão de Gal-3 dentro dorim. Além disso, enquanto o aumento de Gal-3 mRNA foi limitado em Ctns^–/–rins em comparação com outro modelo de DRC, uma grande quantidade de proteína Gal-3 foi detectada apenas em Ctns^–/– rins. Esses dados apoiam fortemente a conclusão de quecistinosinaestá envolvido na degradação da proteína Gal-3, que pode controlar a superexpressão de Gal-3 mRNA em condições de estresse, como DRC.

Gal-3 tem vários papéis biológicos, incluindo papéis em doenças agudas e crônicasinflamaçãoatraindo monócitos e macrófagos.^37,38Em Ctns^–/– camundongos, observamos infiltrados mononucleares pesados ​​principalmente norimcomo descrito anteriormente,^11,39que foram caracterizados como monócitos/macrófagos. Em contraste, os rins do duplo knockout Ctns^–/–Gal-3^–/–camundongos exibiram muito poucos infiltrados de monócitos/macrófagos, sugerindo fortemente que Gal-3 está envolvido eminflamaçãonos rins de Ctns^–/–ratos. No contexto de lesão tecidual repetitiva, Gal-3 pode desencadear a transição para doença crônicainflamaçãoe fibrose.³⁴Consistente com esses achados, nossos dados demonstram o envolvimento de Gal-3 na progressão da DRC emcistinose. De fato, o duplo nocaute Ctns^–/– Gal-3^–/–camundongos apresentaram melhorrimfunção e estrutura em comparação com Ctns^–/–ratos. Da mesma forma, camundongos deficientes em Gal-3 exibem menos fibrose renal norimem comparação com camundongos WT após obstrução ureteral unilateral,⁴⁰ e camundongos knockout Gal-3 submetidos à lesão de isquemia-reperfusão tiveram uma função renal melhor em comparação com camundongos WT submetidos à lesão de isquemia-reperfusão.⁴¹

Embora tenha sido encontrada uma correlação entre os níveis de Gal-3 no plasma e o desenvolvimento de DRC,42 não foi observada diferença na expressão de Gal-3 no soro de camundongos e humanos afetados porcistinosee controles saudáveis. Ao medir diferentes níveis de citocinas no soro, encontramos um aumento significativo de MCP-1 em Ctns^–/–camundongos, enquanto Ctns^–/–Gal-3^–/–camundongos tinham níveis comparáveis ​​aos de camundongos WT. MCP-1 é uma citocina que pode ser liberada no soro e forma um gradiente para atrair monócitos e macrófagos para o local da lesão.35 O aumento de MCP-1 nos soros de Ctns^–/–camundongos em comparação com Ctns^–/–Gal-3^–/–camundongos foi independente do acúmulo de cistina porquerimo conteúdo de cistina foi semelhante em ambos os genótipos. Além disso, apesar do tratamento com cisteamina que permitiu a saída da cistina dos lisossomos, MCP-1 foi significativamente aumentado nos soros de pacientes comcistinoseem comparação com doadores saudáveis. Esses dados sugerem fortemente que a ausência decistinosina, em vez do acúmulo de cistina, é responsável pelo aumento de MCP-1 no soro. Além disso, mostramos uma interação direta entre Gal-3 e MCP-1, que foi recentemente sugerida por Gordon-Alonso et al.43, mas não foi mais estudada. O mecanismo de ativação de MCP mediado por Gal-3-1 não foi estudado aqui. Uma hipótese é a presença de um peptídeo sinal no MCP humano-1, que pode ser clivado para aumentar sua secreção.44 Além disso, a plasmina pode clivar o terminal C do MCP-1, o que aumenta seu quimioatrativo Além disso, correlacionando com nossos dados, a inibição de MCP-1 em um modelo de camundongo de nefropatia diabética preveniu a infiltração de macrófagos renais e melhorou a função renal.46,47 Emcistinose, nossos dados sugerem fortemente que a ausência decistinosinaleva ao aumento de Gal-3, que ativa a mobilização sanguínea de MCP-1, aumentando ainflamaçãoe a progressãodoença renal crônica.

Esses achados abrem novas perspectivas sobre potenciais alvos terapêuticos que podem limitar ou retardar a degeneração renal em pacientes comcistinose. De fato, drogas anti-inflamatórias não-esteróides, como aspirina e indometacina, inibem a expressão de Gal-3 ao inibir sua transcrição.48 A indometacina é realmente usada para regular a poliúria e a polidipsia emcistinose,49 e um estudo recente de 307 pacientes europeus com cistinose mostrou uma melhora do resultado renal em pacientes tratados com indometacina.50 À luz de nosso estudo, o uso de indometacina ou anti-inflamatórios não esteróides paracistinosepacientes podem ser reconsiderados.

MÉTODOS

Experimentos com animais

O C57BL/6 Ctns^–/–camundongos foram fornecidos pelo Dr. Antignac (Inserm U1163, Paris, França). C57BL/6 galectina-3 nula (Gal-3^–/–) foram fornecidos pelo Dr. Fu-Tong Liu (Universidade da Califórnia, Davis) e Dr. Jerrold M. Olefsky (Universidade da Califórnia, San Diego). A estratégia de melhoramento para gerar WT, Ctns^–/–, Gal-3^–/–, Ctns–/– e Gal- 3^–/–camundongos é descrito em Métodos Suplementares.

Linhas de celular

a bagunça foi gerada a partir de biópsias de pele de recém-nascidos de WT e Ctns^–/–ratos. As linhas celulares MEF, 293T e MDCK tipo II (ATCC, Manassas, VA) foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco contendo 10 por cento de soro fetal de vitela ou soro fetal de bovino, 100 unidades/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina e L-glutamina 2 mM.

Co-imunoprecipitação e análise de espectrometria de massa

Para estudar as interações proteína-proteína, as células MDCK foram transduzidas usando a cadeia principal do vetor lentiviral pRRL.SIN.cPPT.PGK/WPRE para expressar de forma estávelcistinosina-GFP.⁵¹A co-imunoprecipitação foi realizada conforme descrito em Métodos Suplementares. As proteínas co-imunoprecipitadas foram resolvidas por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e analisadas por espectrometria de massa, LTQ Orbitrap como já descrito.¹⁹

Células 293T expressando Gal-3–GFP e MCP-1–DsRed ou Gal-3– GFP e CTNS-DsRed foram usadas para co-imunoprecipitação conforme descrito em Métodos Suplementares. As proteínas co-imunoprecipitadas foram resolvidas por SDS-PAGE e o MCP de ligação a Gal-3-1 foi detectado usando um anticorpo anti-DsRed (Clontech Laboratories, Mountain View, CA).

Fracionamento Subcelular

Oito fígados foram obtidos de camundongos C57BL/6 e preparados como descrito anteriormente.52 As condições do gradiente foram essencialmente as mesmas descritas na publicação original,52 exceto que Nycodenz foi usado em vez de metrizamida.

Tratamentos com inibidor de Gal-3 e proteinase K

Lisados ​​decistinosinaAs células -GFP MDCK e 293T expressando Gal-3–GFP e CTNS-DsRed ou Gal-3–GFP e MCP-1–DsRed foram incubadas com ou sem 5 mM de tiodigalactosídeo ou 5 mM de N -Acetil-D-Lactosamina, respectivamente, 2 inibidores de Gal-3 CRD. Após 30 minutos de incubação a 4 - C com agitação constante, os lisados ​​foram incubados com 50 ml de microesferas anti-GFP e a imunoprecipitação foi realizada conforme mencionado anteriormente. As proteínas precipitadas foram resolvidas por SDS-PAGE em gel a 10 por cento.

Lisados ​​decistinosina-Células MDCK GFP e frações enriquecidas com lisossomo de fígado de camundongo foram incubadas com ou sem 2 por cento de Triton X-100 por 10 minutos a 4 - C e depois incubadas 30 minutos com ou sem 2,5 mg/ml e 25 mg /ml de proteinase K, respectivamente. Após a inativação da enzima com fluoreto de fenilmetilsulfonil 1 mM por 5 minutos a 4 - C, as proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE em gel a 10 por cento.

Análise de imunofluorescência

As células MDCK fixas foram incubadas com anticorpo anti–Lamp-2 (OriGeneTechnologies, Rockville, MD) e anti–Gal-3 (CedarlaneLaboratories, Burlington, Ontario, Canada) 2 horas à temperatura ambiente, seguido por Alexa Fluor 555 anticorpo secundário (Invitrogen, Carlsbad, CA) por 1 hora à temperatura ambiente. As imagens confocais foram obtidas usando um microscópio Zeiss LSM 700 (Carl ZeissMicroscopy, Jena, Alemanha).

Células 293T expressando transitoriamente Gal-3–GFP sozinho, Gal-3–GFP e DsRed ou Gal-3–GFP ecistinosina-DsRed foram cultivados em uma lamela antes de serem montados em uma lâmina. As células foram fotografadas usando um instrumento Keyence BZ-X700 (Keyence Corp., Osaka, Japão).

Fixorimas seções foram incubadas durante a noite a 4 - C com anticorpo anti-CD68 (BioLegend, San Diego, CA) ou anticorpo anti-Gal-3 (BioLegend), seguido por anticorpo secundário Alexa Fluor 488 (Invitrogen), 1 hora à temperatura ambiente. As imagens foram adquiridas usando um instrumento Keyence BZ-X700. A quantificação da expressão de CD68 é descrita em Métodos Suplementares.

MEFs expressando Gal-3–GFP foram corados usando um anticorpo anti-Hsc70 (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) e fotografados conforme descrito anteriormente.⁵³

Microscopia de fluorescência FL de reflexão interna total

WT e Ctns^–/–MEF expressando Gal-3–GFP e CTNS-DsRed foram semeados em uma placa de fundo de borossilicato de 4-câmara 35- mm (Cellvis, Mountain View, CA). Após 2 dias em cultura, os MEFs foram analisados ​​por microscopia de fluorescência FL de reflexão interna total, conforme descrito anteriormente⁵⁴e em Métodos Suplementares. As imagens foram analisadas usando o software ImageJ.

Análise de expressão Gal-3

Células 293T expressando Gal-3–GFP, Gal-3–GFP e DsRed, ou Gal-3–GFP e CTNS-DsRed e explantadasrinsforam lisados ​​em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação contendo um coquetel de inibidores de proteinase. As proteínas foram separadas em um gel de 4% a 15% e reveladas usando anticorpo anti-Gal-3 (Abcam, Cambridge, UK) ou anti-gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) .

Rinsforam homogeneizados em tampão RLT contendo b-mercaptoetanol usando Precellys 24 (Bertin Instruments, Montigny-le-Bretonneux, França). O RNA foi isolado e a reação em cadeia da polimerase digital de gotículas específicas de Gal-3– foi realizada conforme descrito em Métodos Suplementares. A expressão do transcrito Gal-3 foi expressa como uma razão em comparação com o controle endógeno 18S. Um ensaio imunoenzimático (Abcam) foi usado para detectar o nível de Gal-3 em camundongos e soros humanos, de acordo com as instruções do fabricante.

Função renal

Os níveis séricos e urinários de fosfato, creatinina sérica e ureia foram estimados usando o QuantiChrom Phosphate Assay Kit, Quanti Chrom Creatinina Kit e QuantiChrom Urea Assay Kit (BioassaySystems, Hayward, CA). Os níveis de proteína na urina foram medidos usando o kit Pierce BCA Protein Assay (Rockford, IL).

Histologia

No momento em que os ratos foram mortos,rinsforam coletados, fixados em formol e incluídos em parafina. Os cortes corados com hematoxilina e eosina foram revisados ​​de forma cega pela Dra. Marie Claire Gubler conforme descrito nos Métodos Suplementares.

Medição do conteúdo de cistina

A medição da cistina tecidual foi realizada por espectrometria de massa (LC-ESI-MS/MS) conforme descrito anteriormente.³⁹

Nefrectomia padrão e operação simulada

A DRC de camundongos foi induzida pela operação padrão de nefrectomia em estágio subtotal 2-como descrito anteriormente.^55,56O grupo sham de camundongos foi submetido ao mesmo procedimento, mas sem cortar nenhumrimtecido.

Nível de citocinas no soro

Para medir os níveis de citocinas no soro do camundongo, um camundongoinflamaçãokit citometric bead array (BD Biosciences, San Jose, CA) foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de MCP-1 no soro humano foi determinada usando um ensaio imunoenzimático dirigido contra MCP-1 (Abcam, Cambridge, UK) de acordo com as instruções do fabricante.

Análise estatística

Os valores são expressos como média - SEM. A significância do resultado foi avaliada pelo teste t de 2-cauda não pareado ou teste t de 2-cauda não pareado com correção de Welch. As comparações de grupo de 3 condições ou mais foram feitas com análises paramétricas de variância, seguidas pelo teste de comparações múltiplas de Tukey para comparações pareadas. Os escores histológicos foram comparados pelo teste de Mann-Whitney. As análises foram realizadas usando o software Prism 6 (GraphPad, San Diego, CA). Um valor P menor que 0.05 foi considerado significativo.

Aprovação do estudo

Os experimentos com camundongos foram conduzidos em conformidade com os protocolos do InstitutionalAnimal Use Committee. O uso de tecido humano neste estudo foi aprovado pela Universidade da Califórnia, San Diego, HumanResearch Protections Program.

DIVULGAÇÃO

SC é membro do Conselho Científico e membro do Conselho de Curadores dacistinoseFundação de Pesquisa. SC é cofundador, acionista e membro do conselho científico e do conselho de administração da GenStem TherapeuticsInc. Os termos deste acordo foram revisados ​​e aprovados pela Universidade da Califórnia-San Diego de acordo com suas políticas de conflito de interesses. Todos os outros autores declararam não haver interesses conflitantes.

fornecendo a Gal-3^–/–ratos. Agradecemos a Lou Devanneaux e NicholeFlerchinger pela ajuda técnica e a Elizabeth Souter pela revisão do manuscrito. Agradecemos a Christopher Alfonso da BDBioscience por fornecer o mouseinflamaçãoarranjo de esferas citométricas e por sua ajuda na interpretação dos resultados. Este trabalho foi apoiado por subsídios do National Institutes of Health RO1-DK090058e R01-DK110162, oCistinoseResearch Foundation e o Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM, CLIN-09230). TL é apoiado por uma bolsa de pós-graduação da Vaincre Les MaladiesLysosomales. AB e JZ são apoiados por uma bolsa docistinoseFundação de Pesquisa. O UCSD Neuroscience MicroscopyShared Facility foi financiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NINDS) concedendo P30-NS047101.

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