Marcadores Podocitários Urinários em Doenças Renais

para mais informações:ali.ma@wecistanche.com

Lingfeng Zeng, et ai

Abstrato

Os podócitos desempenham um papel importante na manutenção da função renal e são o foco principal de muitosrimdoenças. A lesão de podócitos resulta na liberação de fragmentos celulares derivados de podócitos e alvos moleculares específicos de podócitos na urina, que podem servir como biomarcadores derimdoenças. Podócitos intactos, viáveis ​​ou mortos, e microvesículas derivadas de podócitos podem ser quantificados na urina por vários métodos de centrifugação, visualização e cultura. Alvos de proteínas específicas de podócitos do núcleo, citoplasma, diafragma de fenda, membrana basal capilar glomerular e citoesqueleto, bem como seu RNA mensageiro (mRNA) correspondente, na urina, podem ser quantificados por Western blotting, ELISA ou polimerase quantitativa reação em cadeia. Embora algumas dessas técnicas possam ser caras ou trabalhosas no momento, elas podem se tornar amplamente disponíveis no futuro devido ao aprimoramento da tecnologia e da automação. A aplicação deurináriopodócitomarcadores para o diagnóstico e acompanhamento de váriosrimdoençastem sido explorado, mas os dados publicados nesta área não são suficientemente sistemáticos e carecem de validação externa. Mais pesquisas devem se concentrar em padronizar, comparar e automatizar métodos laboratoriais, bem como definir seu valor agregado aos testes clínicos de rotina.

Palavras-chave:Podócito, Biomarcador, mRNA, miRNA, Nefrina, Podocina, Podocalixina, Sinaptopodina,Crônicarimdoença

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1. Introdução

1.1. Epidemiologia da doença renal crônica

Crônicarimdoença(DRC) é uma doença não transmissível importante e onerosa [1]. Com a disponibilidade da terapia renal substitutiva, os gastos com saúde destinados ao tratamento da DRC (Ccrônicorimdoença)aumentou acentuadamente após a década de 1960 [2,3]. Em 2015, havia mais de 2,5 milhões de pacientes recebendo terapia renal substitutiva em todo o mundo, e esse número deve dobrar até 2030 [4]. Meios eficazes para diagnóstico, tratamento e monitoramento derimdoençasão muito necessários.

1.2. Poocyte como o foco da doença renal

A função primária do rim é a excreção de resíduos metabólicos e excesso de água corporal [5], que é alcançada por três processos: (1) filtração do sangue circulante através do glomérulo para formar um ultrafiltrado no espaço de Bowman; (2) reabsorção seletiva de substâncias úteis via túbulo renal; e (3) secreção seletiva de outros resíduos metabólicos do capilar peritubular para o líquido tubular [6]

Embora o rim consista em vários tipos de células que são organizadas em uma delicada 3-arquitetura dimensional, o podócito desempenha um papel fundamental na manutenção da função renal normal e é o foco principal de muitosrimdoenças. Os podócitos são células diferenciadas terminalmente altamente específicas que, juntamente com as células endoteliais e a membrana basal capilar glomerular (GCBM), constituem a barreira de filtração glomerular [7]. Os podócitos têm um corpo celular volumoso que é separado do GCBM por um espaço sub-podócitos [8]. O corpo celular dá origem a longos processos primários que se estendem em direção ao GCBM e são fixados a este por uma extensa gama de processos do pé [8].

Os podócitos têm várias funções fisiológicas. Eles mantêm a morfologia da alça vascular glomerular, regulam a filtração glomerular e participam da resposta imunológica e inflamatória local. Além disso, os podócitos são parcialmente responsáveis ​​pela síntese e renovação do GCBM [9], bem como pela produção de fatores parácrinos como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), que é importante na regulação da permeabilidade e proliferação das células endoteliais [10]. A disfunção podocitária desempenha um papel fundamental na patogênese e progressão de muitosrimdoenças. Mutações de vários genes relacionados a podócitos resultam emrimdoenças, que normalmente se apresenta clinicamente como síndrome nefrótica resistente a esteroides e histologicamente como glomeruloesclerose focal (FGS). Por outro lado, disfunções podócitos adquiridas, incluindo uma redução no número ou densidade de podócitos e fusão dos processos podócitos do pé, levam a lesão secundária do endotélio e do GCBM, perda de carga negativa do GCBM, anormalidade da proteína da membrana hiatal e, finalmente, proteinúria através de vários mecanismos. 11,12].

Uma consequência característica da lesão dos podócitos é a interação enfraquecida com o GCBM, que se acumulou no desprendimento dos podócitos do GCBM. Como os podócitos têm uma capacidade limitada de regeneração e compensação funcional, os podócitos restantes não são capazes de manter as funções mecânicas e de barreira de carga do GCBM, que seriam irreversivelmente danificadas, e o resultado final é a proteinúria [13]. Dependendo da gravidade do insulto, danos aos podócitos podem levar à perda de processos podais, formação de vacúolos e pseudocistos, desdiferenciação e apoptose. Estruturas vizinhas seriam afetadas posteriormente, incluindo a proliferação de células epiteliais parietais, encolhimento do GCBM, perda de tufo capilar glomerular e, finalmente, glomeruloesclerose [14].

1.3. Método de revisão de literatura

Realizamos uma revisão da literatura com termos de pesquisa incluindo "podocyte", "podocyte-associated columns" ou "biomarker", juntamente com "crônicarimdoença", "lesão renal aguda", "glomerulonefrite", "nefropatia diabética", ou "diabéticarimdoença", foram usados ​​para pesquisar literatura relevante no Medline, Embase e Cochrane Library. As referências de publicações relevantes foram examinadas para possíveis artigos adicionais. Os estudos elegíveis incluíram estudos em humanos e animais publicados antes de julho de 2020. Publicações com tópicos irrelevantes, como biologia celular podocitária, fisiologia da membrana e manipulação molecular de podócitos, foram excluídos.

1.4. Alvos específicos de podócitos como biomarcadores

A lesão de podócitos leva à liberação de várias moléculas derivadas de podócitos no espaço urinário e pode servir como um biomarcador derimdoenças(Figura 1). Os corpos celulares dos podócitos podem ser divididos em três compartimentos anatomicamente e funcionalmente distintos: a parte da base, a parte superior e a parte do diafragma deslizante (SD) [15]. Proteínas específicas da membrana celular estão presentes em cada parte, e sua interação com o sistema citoplasmático do citoesqueleto é responsável pela estabilidade da estrutura e função do podócito [16]. As principais moléculas derivadas de podócitos que são alvos potenciais para o desenvolvimento de biomarcadores estão resumidas na Tabela 1.

Fig. 1. Lesão de podócitos e potenciais marcadores derivados de podócitos na urina. A lesão de podócitos resulta em 3 processos patológicos inter-relacionados: alteração morfológica, apoptose e descolamento. Os podócitos podem permanecer viáveis, mas se manifestam como alterações morfológicas que têm consequências funcionais a jusante, como proteinúria e fibrose tubulointersticial. A apoptose de podócitos pode se desenvolver como resultado de alterações morfológicas acumuladas ou diretamente de insultos específicos. A perda de podócitos nos glomérulos (ou seja, podocitopenia) leva a alterações arquitetônicas na alça capilar glomerular e resulta em glomeruloesclerose. Os podócitos, sejam apoptóticos ou viáveis ​​devido à perda de 3 1 integrina, podem se desprender para o espaço urinário, ser identificados na urina e servir como marcadores derimdoença. Vesículas, micropartículas ou moléculas específicas de podócitos derivadas de podócitos lesionados ou apoptóticos também podem ser detectadas na urina e servir como biomarcadores. (GCBM, membrana basal capilar glomerular; AgII, angiotensina II; TGF-, fator transformador de crescimento beta; ROS, espécies reativas de oxigênio).

1.5. Alvos nucleares e citoplasmáticos

O gene supressor tumoral de Wilms-1 (WT1) é um fator de transcrição do tipo dedo de zinco no núcleo podócito e é provavelmente o marcador específico de podócitos mais comumente usado para estudo histológico [17]. O gene WT1 consiste em 10 exons, dos quais 7 a 10 exons codificam os 4 dedos de zinco do domínio de ligação ao DNA. WT1 é especificamente expresso em podócitos e provavelmente regula a expressão de nefrina [18]. Mutações heterozigóticas nos exons 8 e 9 do gene WT1 levam à síndrome de Denys-Drash, que se apresenta com síndrome nefrótica, pseudo-hermafroditismo masculino e tumor de Wilms [19].

Outras proteínas nucleares e citoplasmáticas de podócitos são menos estudadas como biomarcadores. A quinase contendo domínio aarF-4 (ADCK4) está especificamente presente nas mitocôndrias dentro dos processos do pé de podócitos de rato [20]. ADCK4 é responsável por estabilizar o complexo CoQ e é necessário para a função normal da homeostase dos podócitos [20]. A ablação de ADCK4 específica para podócitos em camundongos resulta em apagamento do processo do pé, desorganização da fenda de filtração, mitocôndrias aumentadas e disfuncionais e redução da CoQ10 [21], e o tratamento restaurou a CoQ10, função mitocondrial, melhorou a morfologia dos podócitos e impediu o apagamento do processo do pé [21 ,22].

1.6. Complexo proteico de diafragma de fenda

Proteínas componentes do diafragma de fenda podocitária têm sido extensivamente estudadas como biomarcadores derimdoenças. As principais proteínas neste grupo incluem nefrina, podocina, proteína associada a CD2-(CD2AP) e podoplanina [23]. A nefrina é uma proteína transmembrana com domínios extracelulares que formam o núcleo do diafragma em fenda. Ele atua tanto como uma barreira de peneira física quanto um andaime de sinalização [24]. Mutações no gene da nefrina foram a primeira causa relatada de síndrome nefrótica congênita em humanos [25]. Podocina e CD2AP são responsáveis ​​por conectar a nefrina ao citoesqueleto de actina sob a membrana celular. A podocina é uma proteína em forma de grampo da família da estomatina e é expressa exclusivamente em podócitos [26]. Ele é codificado pelo gene NPHS2 que consiste em oito éxons e está localizado na região do cromossomo 1q25-q31 [27]. Mutações do gene NPHS2 causam uma síndrome nefrótica autossômica recessiva resistente a esteroides em pacientes pediátricos e adultos [27,28]. CD2AP é uma molécula de andaime que interage diretamente com a actina filamentosa e outras proteínas da membrana celular e está implicada na remodelação dinâmica da actina e no tráfego da membrana [29]. A podoplanina é uma pequena glicoproteína transmembrana com um grande número de cadeias de O-glicosídeos. A perda seletiva de podoplanina em podócitos leva à proteinúria, seguida de alterações na morfologia podocitária em um modelo de rato de proteinúria espontânea [30].

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1.7. Metas vinculadas ao GCBM

Os principais componentes proteicos da região basal do podócito são a 3 1 integrina e -distroglicano (-DG). Essas proteínas ancoram podócitos ao GCBM e desempenham um papel importante na manutenção da posição correta do podócito, bem como na integridade da membrana de filtração [31,32]. A 3 1 integrina é uma proteína transmembrana com o domínio extracelular ligado ao domínio G-like da laminina G (LG) da laminina 521 no GCBM, enquanto sua região citoplasmática está ligada ao citoesqueleto do podócito pela -actinina{{ 9}}. A proteína glicosilada -DG está ligada ao citoesqueleto via utrofina, e ao podócito e GCBM através de sua interação com a laminina 521.

1.8. Alvos na membrana superior

A podocalixina é a principal proteína transmembrana no lado apical do podócito. É uma proteína de ácido siálico carregada negativamente que contribui para a barreira de carga da filtração glomerular [33]. A podocalixina tem três funções: (1) evitar que a proteína com carga negativa vaze para a urina; (2) manter a separação dos podócitos adjacentes; e (3) prevenir a adesão entre células epiteliais e alças capilares [34]. A podocalixina está ligada ao citoesqueleto de actina pela ezrina e pelo fator regulador do trocador de prótons de sódio 2 (NHERF2).

1.9. Alvos relacionados à actina

Várias proteínas específicas de podócitos estão ligadas ao citoesqueleto de actina e mantêm a 3-estrutura dimensional do podócito. Os alvos mais bem estudados deste grupo são sinaptopodina e -actinina-4. Ambos se ligam ao esqueleto de actina interagindo com a guanilato quinase associada à membrana com orientação invertida-1 (MAGI-1) [35]. A sinaptopodina é uma proteína linear rica em prolina codificada pelo gene SYNPO [36] e é expressa em podócitos em diferenciação quando desenvolvem os processos do pé. Como resultado, a sinaptopodina é considerada um marcador de podócitos maduros [37].

2. Métodos de estudo

2.1. Marcadores de podócitos intra-glomerulares

Embora o foco desta revisão sejaurináriopodócitomarcadores, é lógico discutir brevemente a detecção desses marcadores no tecido renal. A depleção de podócitos pode ser absoluta (perda de podócitos) ou relativa (número reduzido de podócitos por volume de glomérulo) [38]. O método padrão-ouro de quantificação de podócitos nos rins são as metodologias estereológicas (microscópios de luz ou eletrônicos, microscópios confocais de varredura a laser, ultra-som, tomografia computadorizada ou ressonância magnética) [39]. No entanto, todos eles são demorados e trabalhosos. Recentemente, Venkatareddy et al. avaliaram o método para a estimativa da densidade de podócitos por cortes únicos fixados em formalina embebida em parafina, nos quais os núcleos dos podócitos foram visualizados por imunofluorescência indireta com anticorpos contra WT1 ou transducina-like potenciador de divisão [40]. Um estudo subsequente mostrou que este método forneceu enumeração precisa de podócitos em um modelo de camundongo transgênico de depleção seletiva de podócitos, confirmando que essa abordagem fornece uma ferramenta quantitativa eficiente para a análise de depleção de podócitos em todo o glomérulo [41]. No entanto, esse método ainda requer biópsia renal e, portanto, não é adequado para monitoramento seriado.

2.2. Quantificação e cultura de podócitos urinários

Uma vez que os podócitos são fixados à sua posição fisiológica apenas pelos processos do pé, eles são vulneráveis ​​a serem perdidos como células viáveis ​​na urina [42]. De fato, podócitos intactos são detectáveis ​​na urina de pessoas saudáveis ​​e pacientes comrimdoenças[43], e a perda urinária é provavelmente o principal mecanismo de depleção de podócitos durante a progressão da DRC(Ccrônicorimdoença)[42]. O método tradicional de identificação de podócitos na urina envolve técnicas de citospin e estudo de imunofluorescência com anticorpos anti-podocalixina específicos [44], para os quais a automação é parcialmente viável. No entanto, a técnica tem sensibilidade e especificidade limitadas por conta dos restos celulares contaminantes no sedimento urinário.

Alternativamente, podócitos podem ser identificados pela detecção de peptídeos trípticos específicos de podócitos com cromatografia líquida acoplada com espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS). Embora o custo do equipamento desta técnica seja alto, ela tem as vantagens de ser independente do operador e altamente reprodutível [45], e provavelmente terá crescente aplicabilidade na prática clínica laboratorial.

Estudos anteriores mostraram que, com a técnica de imunofluorescência de citospin, pessoas saudáveis ​​excretam menos de 0,5 podócitos/mg de creatinina, enquanto pacientes com doença glomerular ativa excretam até 400 podócitos/mg de creatinina [43]. A maioria deurináriopodócitossão viáveis ​​quando testados com exclusão de iodeto de propídio e coloração TUNEL [43]. Em teoria, a cultura de podócitos viáveis ​​ex vivo, portanto, melhoraria a especificidade da identificação de podócitos removendo células mortas e inespecíficas. No entanto, podócitos normalmente não proliferam in vivo, e condições experimentais especiais são necessárias para sua cultura ex vivo [46]. Relatórios anteriores mostraram que os podócitos podem ser cultivados primeiro em condições permissivas de crescimento, onde os podócitos imortalizados se replicam [46]. O meio de cultura de células para este propósito geralmente consiste de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ou meio de Eagle modificado por Dulbecco, com 10 por cento de soro fetal bovino suplementado com 20-100 U/ml de interferon-gama de camundongo (INF-), e o placas de cultura são geralmente revestidas com colágeno tipo I para promover a proliferação de podócitos [46]. Este método tem grande valor no estudo translacional e na identificação de alvos terapêuticos, mas é muito complicado para uso clínico de rotina.

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2.3. Fragmentos derivados de podócitos urinários

As vesículas extracelulares (EVs) são corpos membranosos esféricos liberados por vários tipos de células. No sistema urinário, EVs contendo membrana apical e líquido intracelular são eliminados de todos os segmentos de néfrons, incluindo podócitos, células epiteliais tubulares renais e células uroepiteliais para a urina. Os EVs urinários contêm marcadores proteicos de disfunção e lesão estrutural do rim. Estudos recentes sugerem ainda que os EVs podem ser relevantes para a comunicação intercelular [48]. Além disso, estudos anteriores também mostraram que fragmentos de membranas celulares apicais são derramados de podócitos feridos na urina [49], e podem ser identificados como estruturas granulares positivas para podocalixina (PPGS) por microscopia eletrônica [49]. Em modelos de camundongos diabéticos, exossomos urinários de podócitos podem ser isolados por centrifugação em série e as micropartículas podem ser quantificadas por citometria de fluxo usando anticorpo anexina V (que detecta todas as micropartículas), seguido de anticorpo para podocalixina ou podoplanina (que identifica especificamente micropartículas derivadas de podócitos) [50,51]. A análise adicional de espalhamento de luz pode ser usada para determinar ainda mais o tamanho das micropartículas [52]. Com essas técnicas sofisticadas, foi demonstrado que as micropartículas derivadas de podócitos são aumentadas em camundongos após exposição a glicose alta [51], bem como em camundongos diabéticos antes do início da albuminúria [52]. No primeiro caso, a anormalidade foi suprimida por um inibidor da Rho-quinase, indicando que a reorganização do citoesqueleto é o principal gatilho da liberação de micropartículas [51]. No entanto, a aplicação dessas técnicas em humanosrimdoençanão foi explorado.

Em vez de medir o número e o tamanho de EVs e micropartículas derivadas de podócitos na urina, há recentemente um interesse crescente em medir moléculas específicas de podócitos em exossomos urinários. Por exemplo, fatores de transdução de sinal derivados de podócitos (PDSTFs) em EVs urinários foram propostos como um candidato potencial para a avaliação de lesões de podócitos [52]. No entanto, suas aplicações clínicas permanecem em desenvolvimento.

2.4. Alvos de proteínas específicas de podócitos urinários

Os níveis urinários de vários alvos proteicos específicos de podócitos são prontamente medidos e seu papel como biomarcadores derimdoençafoi estudado. O nível de podocalixina urinária pode ser medido por imunofluorescência indireta, ELISA ou citometria de fluxo [53], e foi proposto como um marcador paraurináriopodócitocontar. No entanto, um estudo anterior mostrou que a podocalixina urinária originou-se principalmente da membrana apical de podócitos lesados, em vez de intactos triturados na urina, e seu nível é aumentado na lesão renal precoce [49]. A podocalixina e a nefrina, outro importante alvo proteico específico de podócitos na urina, não são detectáveis ​​na urina de pessoas saudáveis ​​por Western blotting tradicional [54], mas são detectáveis ​​por ELISA convencional em pacientes com pré-eclâmpsia [55]. Além disso, o nível de nefrina urinária se correlaciona com a gravidade da proteinúria [56] e função renal [57]. O nível de nefrina no plasma também pode ser medido [57], mas sua relevância biológica ou clínica não foi determinada. O principal problema do uso dos níveis urinários de alvos proteicos específicos de podócitos como biomarcador clínico é a baixa concentração (geralmente na faixa de ng/ml) e o efeito de confusão da concentração-diluição da urina.

2.5. mRNAs específicos de podócitos urinários

Medição deurináriopodócitoO nível de mRNA específico foi proposto como um método alternativo para a determinação da contagem de podócitos urinários. A quantidade de mRNA específico de podócitos na urina geralmente não é suficiente para o estudo tradicional de Northern blot, mas é prontamente medido pela reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-QPCR). Dois estudos anteriores mostraram que os níveis de mRNA de nefrina urinária tinham uma estreita correlação com a contagem de podócitos urinários [56,58]. Em um modelo de camundongo de doença antimembrana basal glomerular com uma biópsia renal em série,urináriopodócitoNíveis de mRNA específicos correlacionados com a taxa de perda de podócitos glomerulares [52].

Estudos recentes, no entanto, mudaram o foco para índices de mRNA urinários derivados como marcadores substitutos para estresse podocitário ou lesão podocitária relativa. Em um modelo de rato, a doença glomerular progressiva foi associada à diminuição dos níveis de nefrina em comparação com os níveis de mRNA de podocina, e a proporção de mRNA de podocina-nefrina urinária correlacionada com a gravidade da progressão histológica [59]. Em um estudo subsequente, a pressão arterial média de pessoas saudáveis ​​mostrou se correlacionar com a razão mRNA de podocina para creatinina urinária (um marcador de desprendimento de podócitos), razão de mRNA de podocina para nefrina (um marcador de estresse podocitário) e podocina urinária -to-aquaporin-2 razão de mRNA (um marcador de lesão podocitária relativa versus lesão tubular) [60]. A lesão glomerular está especificamente associada ao aumento das proporções urinárias de podocina-aquaporina-2 e nefrina-aquaporina-2mRNA [61].

2.6. Marcadores de miRNA urinários específicos para podócitos

Micro-RNAs (miRNAs) são RNAs não codificantes curtos que regulam muitas vias biológicas visando mRNAs específicos [62]. Semelhante ao mRNA, o miRNA urinário é prontamente quantificado por RT-qPCR [63]. Do ponto de vista do desenvolvimento de biomarcadores, o miRNA tem a vantagem de ser resistente à degradação, o que facilita seu uso clínico, bem como o estudo de amostras de arquivo [63]. Uma série de mudanças específicas de miRNA foram observadas emrimdoenças[9]. Por exemplo, a perda específica de podócitos de miRNAs funcionais, incluindo miR-23b, miR-24 e miR-26a, resultou em lesão glomerular e tubular rápida [64]. Especificamente, miR-27b regula a sobrevivência de podócitos através do direcionamento do receptor de adenosina 2B [65]. Da mesma forma, os níveis urinários de miR-21, miR-124 e miR-192 foram relatados como correlacionados com a gravidade da disfunção renal (albuminúria e TFG estimada) eurináriopodócitomarcadores (nefrina, sinaptopodina e podocalixina) em pacientes diabéticos [66]. Estudos recentes identificaram ainda vias específicas a jusante para vários miRNAs que podem ser relevantes para a patogênese ou progressão derimdoenças. Notavelmente, miR-193a suprime a expressão de WT- 1, que afeta a diferenciação podocitária [67] e pode desempenhar um papel na patogênese da doença glomerular [68]. Por outro lado, miR-21 inibe a expressão do inibidor tecidual da metaloproteinase 3 (TIMP3) [69,70], miR-26a inibe o fator transformador de crescimento beta-1 (TGF{{ 11}}) expressão [71,72], miR-23b tem como alvo a proteína 2 de ligação ao domínio SH3 da proteína ativadora de Ras GTPase (G3BP2) [73], miR-29c tem como alvo o homólogo 1 do Sprouty (Spry1 ) [74]; todos os quais estão envolvidos na progressão da nefropatia diabética.

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No entanto, o podócito contribui para apenas uma pequena proporção do miRNA urinário. Quaisquer alterações específicas de miRNA observadas nos podócitos podem não ser facilmente discerníveis na urina, enquanto qualquer alteração nos níveis de miRNA urinário pode refletir a mudança patológica em outros tipos de células renais [75,76]. Por exemplo, embora os níveis urinários de miR-155, miR-663 e miR-1915 sejam significativamente diferentes entre pacientes com FGS ou nefropatia de alteração mínima (MCN) e controles saudáveis ​​[77], não foi demonstrado que miR-155, miR-663 ou miR-1915 se originam especificamente de podócitos. Correlações significativas entre muitos níveis de miRNA e marcadores de lesão tubular, incluindo níveis urinários de N-acetil- -D-glucosaminidase (NAG) e molécula de lesão renal-1 (KIM-1) [66], também foram relatados. Em outras palavras, é difícil confirmar sua especificidade como marcadores de lesão podocitária. A exceção notável a esta regra é miR-26a. Um estudo recente mostrou que os níveis exossômicos de miR-26a foram significativamente maiores na nefrite lúpica do que no controle saudável, miR-26a foi o miRNA mais abundantemente expresso no glomérulo de camundongo C57BL/6 normal, e miR-26a foi responsável pela regulação da diferenciação podocitária e integridade do citoesqueleto [78]. No entanto, o papel do miR-26a urinário como marcador específico de podócitos precisa ser validado.

2.7. Marcadores de podócitos circulantes

Muitos dos marcadores de podócitos mencionados acima, principalmente alvos de proteínas específicos de podócitos e mRNAs, podem ser medidos na circulação sistêmica [56,79,80], e seus níveis plasmáticos como um biomarcador derimdoençasforam explorados [55,81-84]. No entanto, uma discussão completa sobre este tópico está além do escopo desta revisão. As principais vantagens e desvantagens das metodologias acima mencionadas estão resumidas na Tabela 2.

3. Marcadores de podócitos urinários em doenças renais específicas

3.1. Doença renal diabética

Diabéticorimdoença(DKD) é a causa mais comum de DRC(Ccrônicorimdoença)em todo o mundo, e há uma riqueza de literatura sobre o uso de váriosurináriopodócitomarcadores para o diagnóstico e acompanhamento da DKD. Por exemplo, Jim et al [14] relataram que os níveis de nefrina urinária foram detectáveis ​​em todos os pacientes com DKD com albuminúria, mas apenas 54% naqueles sem albuminúria. Os níveis de nefrina urinária correlacionaram-se com o nível de albuminúria e inversamente com a função renal [14]. Ma et al relataram que o nível urinário semelhante à angiopoietina -4 (Angptl4) estava aumentado na DKD [85]. O nível de podocalixina na urina estava aumentado em pacientes diabéticos antes do início da microalbuminúria e provavelmente era mais sensível do que a microalbuminúria para a detecção precoce de DKD [86]. Na DKD estabelecida, o nível de podocalixina na urina correlacionou-se positivamente com o nível de HbA1c e a razão albumina/creatinina [87,88]. Em conjunto, os resultados disponíveis indicam que os níveis urinários de vários alvos específicos de podócitos são indicadores precoces de DKD, e o nível urinário de podocalixina é o marcador mais promissor a esse respeito [54].

Os níveis do alvo específico de podócitos em componentes individuais da urina também foram explorados.Urináriopodócitoos níveis de micropartículas, determinados por citometria de fluxo, foram maiores no diabetes tipo 1 do que nos controles saudáveis, e o nível aumentou ainda mais com o clamp hiperglicêmico [89]. Níveis de WT exossomal urinário-1 correlacionaram-se com a gravidade da proteinúria, função renal, dano glomerular e a taxa de declínio da função renal em pacientes diabéticos [58,90]. Em outro estudo, os níveis de glicogênio sintase quinase (GSK)3 em células esfoliadas urinárias foram mais precisos do que a albuminúria na discriminação de pacientes diabéticos com e sem insuficiência renal progressiva [91]. No entanto, a metodologia deste ensaio é complicada e pode não ser aplicável à prática clínica de rotina.

Quanto aos marcadores de mRNA específicos de podócitos na urina, um estudo anterior mostrou que os níveis de mRNA urinário de nefrina, podocina, sinaptopodina, WT-1 e -actina-4 foram maiores em pacientes com DKD do que em controles normais [92]. Houve uma diferença significativa nos níveis de mRNA urinário de nefrina, podocina, -actinina-4 e proteína associada a CD2-em pacientes diabéticos com várias gravidades de albuminúria [93]. Os níveis de mRNA urinário de nefrina, podocina, sinaptopodina, WT-1 e -actina-4 também se correlacionaram comurináriopodócitocontagem, nível de nefrina urinária, albuminúria e a gravidade da insuficiência renal [93]. Mais recentemente, os níveis de mRNA específico de podócitos na urina precederam o início da microalbuminúria em pacientes com diabetes tipo 2 [94], e a relação mRNA-creatinina da podocina urinária, um marcador de descolamento de podócitos, correlacionou-se significativamente com a taxa subsequente de declínio da função renal [94]. Além disso, o nível de mRNA da sinaptopodina urinária foi menor após 12 semanas de terapia combinada com inibidor da enzima conversora da angiotensina (ECA) e bloqueador do receptor da angiotensina (BRA) em comparação com a monoterapia com inibidor da ECA [95]. Em conjunto, as evidências disponíveis sugerem que a medição dos níveis de mRNA específico de podócitos na urina pode ser valiosa para a estratificação de risco e monitoramento da resposta terapêutica na DKD.

3.2. Alteração mínima na nefropatia e glomeruloesclerose focal

MCN e FGS são muitas vezes considerados como doenças podócitos, e o papel daurináriopodócitoalvos foi testado. Zhou et ai. [96] relataram que o nível exossomal de WT-1 urinário, medido pela técnica de immunoblotting, foi significativamente maior em pacientes com FGS do que naqueles com síndrome nefrótica sensível a esteroides (SSNS) ou voluntários saudáveis. Os níveis de WT exossomal urinário-1 diminuíram significativamente após o tratamento com corticosteróides e remissão de FGS ou SSNS [96]. Em outro estudo, o nível de nefrina urinária, medido por um ensaio ELISA convencional, foi significativamente maior em adultos com FGS do que em outras causas de síndrome nefrótica [97].

Os níveis urinários de mRNA específico de podócitos também foram estudados. Um estudo inicial mostrou que os níveis urinários de mRNA de nefrina e podocina não eram significativamente diferentes entre pacientes com MCN e voluntários saudáveis, e seus níveis eram significativamente menores do que os pacientes com DKD [98]. Um estudo subsequente mostrou que os níveis urinários de mRNA de nefrina e podocina eram mais baixos em pacientes com MCN do que em FGS ou controles saudáveis, e a magnitude da redução correlacionada com o grau de proteinúria [99]. Neste estudo, os níveis de mRNA da sinaptopodina urinária foram correlacionados com a taxa subsequente de declínio da função renal em pacientes com FGS [99], sugerindo que uma alteração qualitativa nos podócitos FGS poderia ser identificada na urina.

3.3. Nefropatia membranosa

Embora a principal alteração patológica da nefropatia membranosa (NMG) seja a deposição de um imunocomplexo no espaço subepitelial, que resulta na alteração da barreira de filtração glomerular, estudos sobreurináriopodócitomarcadores em MGN são escassos. Os níveis de mRNA do sedimento urinário de nefrina, podocina e sinaptopodina foram significativamente elevados em MGN, mas os níveis diferenciaram MGN de ​​forma confiável de outras causas de síndrome nefrótica [98]. Mais recentemente, Lu et al [100] relataram que o número deurináriopodócitoas micropartículas derivadas diminuíram simultaneamente com a melhora nos parâmetros clínicos após a terapia imunossupressora, sugerindo um papel no monitoramento da MGN.

3.4. Nefropatia por IgA

Embora a nefropatia por imunoglobulina A (IgAN) seja primariamente uma doença mesangial, o papel daurináriopodócitocontagem como um biomarcador tem sido explorada. Notavelmente, Shen et al [101] descobriram que os pacientes com IgAN tiveram um aumento na perda urinária de podócitos, menos podócitos nos glomérulos e fusão mais grave do processo do pé nas amostras de biópsia renal. Neste estudo, o podócito urinário foi identificado pelo estudo de imunofluorescência indireta da podocalixina, e ourináriopodócitocontagem correlacionada com creatinina sérica e proteinúria [101]. Um estudo subsequente mostrou que o número de podócitos urinários em pacientes com NIgA com esclerose segmentar era maior do que naqueles sem esclerose segmentar [102]. Em crianças com nefrite púrpura por IgAN ou Henoch-Sch¨ online, Hara et al [103] mostraram que a perda cumulativa de podócitos na urina se correlacionou com a gravidade do dano histológico e o grau de glomeruloesclerose na biópsia renal, e pacientes comurináriopodócitoexcreção teve rápida progressão histológica.

Os estudos sobre moléculas específicas de podócitos na urina como biomarcadores de IgAN são fragmentados e incompletos. O nível de podocalixina urinária correlacionou-se significativamente com a gravidade das lesões extra-capilares agudas em IgAN adulto [102]. Foi relatado que o nível de mRNA de podocina na urina reflete a gravidade da lesão glomerular ativa na biópsia renal e fornece informações prognósticas complementares ao nível de proteinúria [104]. Como a IgAN é a glomerulonefrite primária mais comum em todo o mundo, certamente são necessários mais estudos nessa área.

Além do IgAN, o papel dourináriopodócitomarcadores tem sido explorados em outras glomerulopatias mesangiais. Por exemplo,urináriopodócitoa perda é marcadamente aumentada em ambas as formas hereditárias e adquiridas de esclerose mesangial difusa [102]. No entanto, esta área é menos estudada, provavelmente devido à heterogeneidade na sua classificação patológica.

3.5. Doença de Lupus

UrináriopodócitoA excreção na nefrite lúpica foi estudada. Um relatório anterior mostrou que a maiorurináriopodócitosem pacientes com nefrite lúpica ativa eram viáveis, mas indiferenciados, e a proporção de podócitos apoptóticos na urina foi significativamente menor do que em controles saudáveis ​​[105]. Neste estudo, os níveis urinários de podocalixina, sinaptopodina, podocina, nefrina e WT-1 (medido por Western blotting) foram significativamente aumentados no lúpus sistêmico, especialmente na nefrite lúpica ativa, e seus níveis correlacionaram-se significativamente com a gravidade da proteinúria e atividade histológica [105]. Um estudo subsequente relatou ainda que os níveis urinários de mRNA de nefrina, podocina e sinaptopodina foram significativamente maiores em pacientes com nefrite lúpica ativa do que em lúpus quiescente [106]. Especificamente, o nível de mRNA de nefrina urinária se correlacionou com proteinúria e atividade sistêmica da doença, mas não com a classe histológica de nefrite lúpica, enquanto o nível de mRNA de podocina urinária foi um preditor independente de declínio da função renal subsequente [107].

3.6. Vasculite associada ao anticorpo anticitoplasma de neutrófilos (ANCA)

Embora os podócitos não sejam o alvo primário da lesão renal na glomerulonefrite associada ao ANCA, a densidade de podócitos intra-glomerular é caracteristicamente reduzida [108]. Zou et al [108] descobriram que a taxa de descolamento de podócitos da urina prediz a perda subsequente da função renal na glomerulonefrite associada a ANCA, e Minakawa et al [109] relataram que a proporção de mRNA de podocina para nefrina na urina, um marcador substituto de podócitos intra-glomerulares estresse, correlacionado com o percentual de formação crescente [109]. Neste último estudo, pacientes com altos níveis deurináriopodócitoO mRNA derivado teve um resultado renal favorável, presumivelmente devido à melhor reserva de podócitos glomerulares e ao potencial de reversibilidade [109].

3.7. Outros CKD

A utilidade deurináriopodócitomarcadores em específicorimdoençasestá resumido na Tabela 3. Vários marcadores específicos de podócitos na urina também foram explorados como marcadores genéricos de DRC(Ccrônicorimdoença). Por exemplo,urináriopodócitomicrovesículas extracelulares derivadas, quantificadas por citometria de fluxo, foram significativamente aumentadas em pacientes hipertensos com função renal prejudicada do que naqueles sem insuficiência renal [110]. Nível de sinaptopodina na urina, conforme determinado por Western blotting, correlacionado com a função renal na DRC diabética e não diabética(Ccrônicorimdoença), independentemente do grau de albuminúria, sugerindo que a sinaptopodina na urina é um marcador genérico de dano podocitário [110]. Entre um painel de alvos de mRNA urinário específico de podócitos, o nível de mRNA do fator neurotrófico derivado do cérebro urinário (BDNF) teve a melhor correlação com a molécula de lesão renal urinária-1 (KIM-1), que é um marcador genérico de dano renal [111]. Para alvos de miRNA, os níveis exossomais de miR-21 urinários foram aumentados em modelos animais de lesão de podócitos, bem como em DRC(Ccrônicorimdoença)pacientes [112], mas a origem celular de miR-21 não foi determinada neste estudo.

No entanto, é importante notar que nem todosrimdoençasapresentam lesão podocitária. Um aumento deurináriopodócitoperda foi relatada em várias doenças glomerulares, mas não em doenças policísticas autossômicas dominantes.rimdoença(ADPKD) [113]. Mais importante, a associação entre podocitúria e proteinúria variou acentuadamente entre as diferentes doenças glomerulares, sugerindo queurináriopodócitomarcadores devem ser melhor considerados como específicos da doença [113].

4. Conclusão

A lesão de podócitos desempenha um papel importante na patogênese e progressão de muitosrimdoenças. Fragmentos celulares derivados de podócitos e alvos moleculares específicos de podócitos na urina têm grande potencial para serem desenvolvidos como biomarcadores para o diagnóstico e monitoramento derimdoenças. O processo de desenvolvimento de biomarcadores inclui a identificação de marcadores específicos, determinação da metodologia de medição e decisão sobre o contexto clínico para aplicação (Fig. 2). Com o avanço em nossa compreensão da biologia podocitária e a disponibilidade de novas tecnologias,urináriopodócitoespera-se que os marcadores tenham um escopo de aplicação cada vez maior, tanto pela identificação de novos alvos quanto pelo desenvolvimento de novos métodos para sua quantificação. Em contrapartida, a validação de marcadores podocitários urinários pode esclarecer nossa compreensão da fisiopatologia darimdoenças. Existe uma grande variedade de métodos para a quantificação de podócitos e vários marcadores específicos de podócitos na urina. Na próxima década, os esforços de pesquisa devem se concentrar em padronizar, comparar e automatizar métodos laboratoriais, bem como definir seu valor agregado aos testes clínicos de rotina.

Fig. 2. Aspectos a serem considerados para o desenvolvimento de biomarcadores relacionados a podócitos urinários pararimdoenças. (GCBM, membrana basal capilar glomerular; DRC,crônicarimdoença; DKD, diabéticorimdoença; FGS, glomeruloesclerose focal).

Declaração de Interesse Concorrente

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes ou relações pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Reconhecimento

Este estudo foi apoiado pelo Richard Yu Chinese University of Hong Kong (CUHK) PD Research Fund e as contas de pesquisa CUHK 6905134 e 8601286. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito. Os autores declaram não haver outro conflito de interesse. Os resultados apresentados neste artigo não foram publicados anteriormente no todo ou em parte.

Melhorar a doença renal--Cistanche acteoside

De: 'Marcadores de podócitos urinários emrimdoenças' porLingfeng Zeng, et ai

---Clínica Chimica Acta 523 (2021) 315–324