Abstrato: A sálvia é amplamente reconhecida por seu potencial terapêutico. No entanto, a relevância biológica de algumas espécies permanece desconhecida, nomeadamente Salvia cacaliifolia Benth. Portanto, este estudo visa desvendar a composição química e propriedades relevantes de seu óleo essencial (OE). O OE foi caracterizado por GC e GC-MS e seu efeito antifúngico foi avaliado de acordo com as diretrizes do CLSI sobre dermatófitos e leveduras. O potencial antiinflamatório foi avaliado em macrófagos estimulados por lipopolissacarídeos, avaliando a produção de óxido nítrico (NO) e o efeito nos níveis de proteína de duas enzimas pró-inflamatórias principais, iNOS e COX-2 por análise de western blot . A capacidade de cicatrização de feridas foi determinada usando o ensaio de cicatrização de feridas por raspagem, e o potencial antienvelhecimento foi avaliado pela avaliação do marcador de senescência -galactosidase. O OE foi caracterizado principalmente por -curcumina, -bisaboleno, biciclo germacreno e curzerenona. É eficaz na inibição do crescimento de dermatófitos e C. neoformans. O OE diminuiu significativamente os níveis de proteína iNOS e COX-2 e concomitantemente reduziu a liberação de NO. Além disso, demonstrou potencial anti-senescência e promoveu a cicatrização de feridas. No geral, este estudo destaca propriedades farmacológicas relevantes do OE de Salvia cacaliifolia, que devem ser mais exploradas visando o desenvolvimento de produtos para a pele sustentáveis, inovadores e ecologicamente corretos.

O glicosídeo de cistanche também pode aumentar a atividade de SOD nos tecidos do coração e do fígado e reduzir significativamente o conteúdo de lipofuscina e MDA em cada tecido, eliminando efetivamente vários radicais reativos de oxigênio (OH-, H₂O₂, etc.) e protegendo contra danos ao DNA causados por radicais OH. Os glicosídeos feniletanóides cistanche têm uma forte capacidade de eliminação de radicais livres, uma capacidade redutora maior do que a vitamina C, melhoram a atividade de SOD na suspensão de esperma, reduzem o conteúdo de MDA e têm um certo efeito protetor na função da membrana espermática. Os polissacarídeos Cistanche podem aumentar a atividade de SOD e GSH-Px em eritrócitos e tecidos pulmonares de camundongos experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactose, bem como reduzir o conteúdo de MDA e colágeno no pulmão e no plasma e aumentar o conteúdo de elastina, têm um bom efeito de eliminação no DPPH, prolongar o tempo de hipóxia em camundongos senescentes, melhorar a atividade de SOD no soro e retardar a degeneração fisiológica do pulmão em camundongos experimentalmente senescentes Com degeneração morfológica celular, experimentos mostraram que Cistanche tem boa capacidade antioxidante e tem potencial para ser um medicamento para prevenir e tratar doenças de envelhecimento da pele. Ao mesmo tempo, o echinacoside em Cistanche tem uma capacidade significativa de eliminar os radicais livres DPPH e tem a capacidade de eliminar espécies reativas de oxigênio e prevenir a degradação do colágeno induzida por radicais livres, e também tem um bom efeito de reparo nos danos causados ​​pelos radicais livres da timina.

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1. Introdução

As infecções fúngicas permanecem negligenciadas pelas autoridades de saúde pública, afetando mais de um bilhão de pessoas com 1,5 milhão de mortes por ano [1]. Indivíduos imunocomprometidos são mais propensos a infecções fúngicas [1], Candida e Cryptococcus dois principais agentes etiológicos para infecções invasivas [1,2]. Os dermatófitos, outro grupo de fungos patogênicos altamente relevantes devido ao seu papel na morbidade associada às micoses superficiais [3], incluem cepas de Trichophyton, Epidermophyton e Microsporum. Além disso, podem causar doenças invasivas em hospedeiros imunocomprometidos [4].

Os dermatófitos podem ativar o sistema imunológico devido à ligação de epítopos fúngicos, como manana [5,6], a receptores toll-like (TLRs), ativando assim a cascata pró-inflamatória associada a essas infecções. Uma dessas cascatas é a via do fator nuclear kappa B (NF-κB), que leva a um aumento na produção de citocinas inflamatórias e nos níveis de proteínas das principais enzimas pró-inflamatórias, como a sintase de óxido nítrico induzível (iNOS) e a cicloxigenase -2 (COX-2) [7]. A enzima iNOS é responsável pela produção de óxido nítrico (NO), que é um conhecido mediador pró-inflamatório superproduzido em várias doenças crônicas relacionadas à inflamação.

Além disso, os dermatófitos estão associados à formação de lesões cutâneas [8]. Portanto, após a resolução da infecção, devem ocorrer processos de cicatrização de feridas para regenerar o tecido danificado. Esse processo abrange diferentes fases, que devem ocorrer na ordem certa e nos momentos certos, caso contrário, a ferida torna-se crônica [9].

Devido a recidivas, resistências e efeitos colaterais antifúngicos, os tratamentos antifúngicos atuais são muitas vezes ineficientes, com infecções fúngicas permanecendo uma necessidade clínica não atendida [10]. Surpreendentemente, um número crescente de relatos demonstra que várias cepas de fungos já desenvolveram resistência aos agentes antifúngicos atuais [11,12], justificando o desenvolvimento de novas abordagens antifúngicas [13]. Além disso, drogas anti-inflamatórias também são relatadas como causadoras de vários efeitos adversos [14]. Tendo isso em mente, agentes terapêuticos que pudessem tratar concomitantemente infecções fúngicas e diminuir a inflamação associada seriam de extrema importância.

As plantas aromáticas e seus metabólitos possuem características organolépticas interessantes que também contribuem para seu alto valor nas indústrias farmacêutica, agronômica, alimentícia, sanitária, cosmética e de perfumaria [15], e surgem como potenciais candidatos a novos fármacos antiinflamatórios/antifúngicos.

Muitas plantas aromáticas das famílias Asteraceae, Apiaceae e Lamiaceae são ricas em óleos essenciais que demonstraram uma ampla gama de efeitos biológicos, nomeadamente propriedades anti-inflamatórias e antifúngicas [16-22]. O gênero Salvia L., um dos gêneros mais importantes da família Lamiaceae, é cultivado para ser usado como tempero alimentar ou agente aromatizante em cosméticos e perfumaria [23]. Várias espécies são usadas na medicina tradicional para tratar infecções microbianas, malária e inflamação, e para desinfetar casas após doenças [23]. As espécies de sálvia têm atraído pesquisadores por suas propriedades biológicas, mostrando fortes efeitos antibacterianos, antifúngicos, anticancerígenos e anti-inflamatórios, bem como para a melhoria do desempenho cognitivo [24-30]. Embora esse gênero seja amplamente estudado, algumas espécies permanecem desconhecidas quanto à sua composição química e ao seu interesse medicinal, como Salvia cacaliifolia Benth. (syn Salvia atriplicifolia Fernald, Salvia hempsteadiana SFBlake e Salvia mendax Epling). S. cacaliifolia é um arbusto herbáceo perene ereto atingindo 70 cm de altura, com folhas triangulares e grandes racemos de azul profundo, 2-flores labiais de 2 cm de comprimento [31]. Esta espécie cresce em regiões de alta altitude do México, Guatemala e Honduras.

Este trabalho visa caracterizar quimicamente o óleo essencial de S. cacaliifolia (cacália sálvia) e divulgar seu potencial antifúngico/anti-inflamatório. Além disso, a capacidade de cicatrização de feridas do óleo essencial também foi estudada. Para promover ainda mais o interesse por esta espécie, o potencial anti-senescência também foi examinado.

2. Resultados

2.1. Composição Química do Óleo Essencial de S. cacaliifolia

O óleo essencial foi caracterizado por altas quantidades de sesquiterpenos de hidrocarbonetos (70.10 por cento ± 0.119) seguidos por sesquiterpenos oxigenados (11,71 por cento ± 0.{ {21}}32), conforme mostrado na Tabela 1. Com relação aos compostos individuais, o óleo essencial foi rico em -curcumina (27,64 por cento ± 0,195), -bisaboleno (18,01 por cento ± 0,033), biciclo germacreno ( 8,54 por cento ± 0,074) e curzerenona (7,68 por cento ± 0,055).

2.2. Efeito antifúngico da Salvia cacaliifolia 

Foi avaliada a atividade antifúngica do óleo essencial de S. cacaliifolia, principalmente contra dermatófitos e leveduras. Conforme mostrado na Tabela 2, o óleo essencial foi eficaz contra todas as cepas de dermatófitos testadas, sendo T. mentagrophytes e T. rubrum as mais suscetíveis (CIM=00,16 µL/mL). Em relação às leveduras, C. neoformans foi a mais suscetível a um óleo essencial (CIM=00,64 µL/mL).

2.3. Potencial anti-inflamatório de S. cacaliifolia

O potencial anti-inflamatório do óleo essencial de S. cacaliifolia foi avaliado por macrófagos estimulados por lipopolissacarídeos (LPS). Como esperado, a adição de LPS por 24 h levou a um aumento na secreção de óxido nítrico (NO) para o meio de cultura ([NO]=42,8 ± 7,4 µM). A adição de diferentes concentrações do óleo essencial levou a uma redução dose-dependente nos nitritos detectados (IC50=00,49 µL/mL). Ambos 1,25 e 0,64 µL/mL diminuíram significativamente os nitritos detectados (Figura 1A). Considerando que a 1,25 µL/mL foi observada uma diminuição significativa na viabilidade celular (Figura 1B), a concentração de 0,64 µL/mL foi usada para revelar o mecanismo subjacente por trás do potencial anti-inflamatório de S. cacaliifolia óleo essencial.

Considerando que a ligação do LPS ao Toll-like receptor 4 (TLR4) leva à translocação nuclear de NF-κB que por sua vez causa a expressão de óxido nítrico sintase induzível (Nos2) e ciclooxigenase-2 (Cox2) [ 34], avaliamos então se a presença do óleo essencial poderia modular os níveis de ambas as proteínas. Conforme mostrado na Figura 2A–C, a presença de LPS sozinho causou um aumento significativo nos níveis de proteína de iNOS e COX-2. Na presença do óleo essencial, os níveis de ambas as proteínas diminuíram, principalmente o de iNOS (Figura 2A, B), sugerindo que o óleo prejudicou a ativação do NF-κB e, conseqüentemente, a expressão do mRNA de Nos2, bem como seus níveis de proteína.

2.4. Propriedades de cicatrização de feridas do óleo essencial de S. cacaliifolia

Considerando que várias plantas do gênero Salvia têm sido relatadas como agentes cicatrizantes [27,35,36], levantou-se a hipótese de que S. cacaliifolia poderia promover a cicatrização de feridas. Para tal, recorreu-se ao ensaio da raspagem, avaliando-se o fecho da ferida na presença e ausência do óleo essencial nos fibroblastos. Relatamos que o óleo essencial promoveu significativamente a migração de fibroblastos quando comparado às células controle (Figura 3A, B) a 00,32 µL/mL, uma concentração sem toxicidade para os fibroblastos (Figura 3C).

2.5. Potencial anti-senescência do óleo essencial de S. cacaliifolia

Como se sabe que algumas espécies de Salvia apresentam propriedades anti-senescência [37,38], avaliamos o potencial anti-senescência do óleo essencial de S. cacaliifolia usando o ensaio Senescenceassociated -galactosidase ( -gal) com etoposido como agente indutor de senescência .

Como mostrado na Figura 4, a adição de etoposido (12,5 µM) por 24 h seguida de recuperação por 72 h em meio de cultura sozinho levou a um aumento significativo nas células -gal-positivas, mostrando que o etoposido efetivamente induz a senescência celular. Curiosamente, quando na fase de recuperação o óleo essencial de S. cacaliifolia foi adicionado ao meio de cultura, a porcentagem de células -gal-positivas diminuiu significativamente quando comparada ao meio de cultura sozinho (Figura 4A, B), sugerindo que S. cacaliifolia também poderia apresentam efeitos anti-senescência.

3. Discussão

S. cacaliifolia ainda é amplamente desconhecida quanto à composição química de seu óleo essencial, bem como quaisquer atividades biologicamente relevantes. Para preencher a lacuna no conhecimento, este trabalho descreve, pela primeira vez, as propriedades anti-inflamatórias, antifúngicas, anti-senescência e cicatrizantes desta espécie.

Relatamos que o óleo essencial de S. cacaliifolia é predominantemente caracterizado por sesquiterpenos, particularmente -curcumina, -bisaboleno, biciclo germacreno e curzerenona. Da mesma forma, os óleos essenciais de S. scabra e S. aurea também eram ricos em sesquiterpenos (92,4 e 75 por cento, respectivamente) [39], com -cariofileno, epi- -cardinal, δ-cadineno sendo os principais compostos em S. aurea enquanto S. sabra foi caracterizado por germacreno D, -cariofileno, germacreno B e -copaeno. S. ceratophylla, S. verbenaca, S. stenophylla, S. runcinata e S. repens são outros exemplos de óleos essenciais de Salvia predominantemente ricos em sesquiterpenos [40-42]. No entanto, nenhum óleo essencial de Salvia apresenta quantidades elevadas de -curcumina, -bisaboleno e curzerenona como o óleo essencial de S. cacaliifolia. Outras espécies de Salvia apresentam uma composição química muito distinta, com predominância de monoterpenos, como S. officinalis com altas quantidades de cis-tujona e cânfora [43,44], ou 1,8-cineol e cânfora [45] e S. rosmarinus rico em 1,8-cineol, -pinene, cânfora [46].

Considerando que algumas espécies de Salvia foram relatadas como agentes capazes de tratar infecções de pele [36,47], nosso objetivo foi avaliar se o óleo de S. cacaliifolia poderia ter o potencial de controlar a infecção fúngica. O óleo essencial mostrou efeitos inibitórios contra todas as cepas de dermatófitos e Cryptococcus neoformans, sugerindo assim que poderia ser usado para tratar infecções fúngicas, particularmente dermatofitoses e criptococose. O óleo essencial de outras espécies como S. officinalis tem um efeito inibitório contra dermatófitos com MIC variando de 0,63 a 2,5 µL/mL [43,45], apresentando assim uma atividade mais fraca do que a relatada para S cacaliifolia. Dois óleos essenciais de S. multicaulis apresentaram relevante atividade antidermatofítica, particularmente o quimiotipo rico em nerolidol [48]. Quanto à atividade dos principais compostos de S. cacaliifolia, não foram realizados estudos. No entanto, alguns estudos avaliaram a atividade antifúngica de óleos essenciais ricos nesses compostos. De fato, um estudo relatou a atividade de vários óleos essenciais de Helichrysum microphyllum subsp. Tyrrhenian mostrou que aqueles com maior teor de -curcumina apresentaram a melhor atividade antifúngica [49]. Outros estudos relataram atividade antifúngica moderada para óleos essenciais ricos em -bisaboleno [50,51], biciclo germacreno [51,52] e curzerenona [53]. Considerando o fraco antifúngico dos óleos essenciais relatados anteriormente, levantamos a hipótese de que a atividade de S. cacaliifolia pode ser atribuída ao efeito sinérgico entre todos os compostos da mistura. Os mecanismos de ação subjacentes à atividade antifúngica do óleo essencial de S. cacaliifolia e compostos isolados ainda são desconhecidos. No entanto, considerando sua natureza lipofílica, levantamos a hipótese de que eles podem induzir a inibição do crescimento fúngico, integrando-se a estruturas de membrana que aumentariam a permeabilidade e promoveriam o vazamento de componentes intracelulares e a inativação de enzimas [15,54].

Considerando que infecções fúngicas levam à ativação do sistema imunológico [55], o potencial antiinflamatório de S. cacaliifolia também foi destacado no presente estudo, uma vez que uma diminuição na liberação de NO foi alcançada quando os macrófagos foram pré-tratados com o óleo essencial antes da estimulação com LPS. Desvendar os mecanismos subjacentes do potencial anti-inflamatório de S. cacaliifolia, o efeito do óleo essencial nos níveis de proteína de iNOS e COX-2, duas proteínas pró-inflamatórias associadas à sinalização de TLR4/NF-κB caminho, foi avaliado. Foi observada uma diminuição em ambos os níveis de proteína, sugerindo que a diminuição na liberação de NO pode ser devido a uma inibição da via NF-κB. De fato, um dos principais mecanismos moleculares que contribuem para a perpetuação da inflamação crônica é a ativação da cascata de sinalização NF-κB, que surgiu como o principal regulador da inflamação e da homeostase imune inata. A ativação do fator de transcrição NF-kB causa a indução de COX-2, iNOS e também uma expressão aberrante das citocinas inflamatórias fator de necrose tumoral (TNF)- , IL-1 , IL-6 , que pode danificar as células vizinhas saudáveis ​​e, por um longo período, pode levar a doenças crônicas. Mais estudos precisam ser conduzidos para entender melhor o mecanismo por trás do potencial anti-inflamatório do óleo essencial de S. cacaliifolia, como a translocação nuclear de p65. Em relação a outras espécies de Salvia, foi demonstrado que o óleo essencial de S. officinalis em 00,64 µL/mL foi capaz de diminuir a produção de NO em 30–40 por cento [45], enquanto o óleo essencial de S. cacaliifolia no a mesma dose diminui a produção de NO em 70%. Em oposição, o óleo essencial de S. ceratohyal inibe fortemente a produção de NO (IC50=90 µg/mL) [40]. A capacidade das espécies de Salvia em modular a via NF-kB já foi relatada. De fato, S. officinalis foi capaz de diminuir a expressão de NF-kB [44]. S. ceratophylla inibe fortemente o NF-κB com um IC50 de 38 µg/mL [40]. Foi demonstrado que o óleo essencial de Helichrysum italicum rico em -curcumina, principal composto do óleo de S. cacaliifolia, foi capaz de diminuir a produção de NO, dependente do teor deste composto, o que foi corroborado pelo fracionamento do óleo essencial onde o a fração rica em curcumina induziu a maior inibição [56]. Efeitos semelhantes foram descritos para o quimiotipo -curcumina de H. italicum [57]. Foi demonstrado que óleos essenciais com quantidades significativas de -bisaboleno [58] e biciclo germacreno [59] exerceram efeitos anti-inflamatórios promissores. Em relação à curzerenona, não foram realizados estudos avaliando seu potencial anti-inflamatório. No entanto, foi relatado que dois óleos essenciais ricos em curzerenona têm propriedades antioxidantes relevantes [60,61], o que também pode contribuir para a atividade anti-inflamatória de S. cacaliifolia, permitindo a eliminação de NO. Diante disso, é possível que a -curcumina, principal composto do óleo essencial, seja o principal responsável pela atividade antiinflamatória de S. cacaliifolia, porém não se pode descartar a contribuição dos demais compostos majoritários.

Considerando que a infecção por dermatófitos pode levar à formação de lesões cutâneas [8], avaliamos se S. cacaliifolia poderia promover a cicatrização de feridas. Nossos resultados mostraram que este óleo essencial promove a migração de fibroblastos, sugerindo assim que ele pode desempenhar um papel no processo de cicatrização de feridas. O óleo essencial de H. italicum rico em -curcumina promoveu a cicatrização de feridas em ratos diabéticos [62], portanto, levantamos a hipótese de que a capacidade de cicatrização de feridas de S. cacaliifolia pode ser atribuída à alta quantidade desse composto.

Considerando que várias espécies de Salvia podem atuar como agentes anti-senescência [37], buscamos descobrir se S. cacaliifolia também poderia reverter a senescência. De fato, foi observada uma redução na atividade da -galactosidase dependente de pH induzida por senescência. Esta atividade pode ser atribuída principalmente à presença de -bisaboleno, uma vez que um óleo essencial rico neste composto também apresentou um forte efeito anti-senescência em fibroblastos [63].

4. Conclusões

Este trabalho destaca a composição química de uma espécie de Salvia, que permanece amplamente desconhecida, e demonstra que esta planta possui várias atividades biologicamente relevantes. O óleo essencial de S. cacaliifolia apresenta composição química distinta, sendo predominantemente rico em -curcumina, -bisaboleno, biciclo germacreno e curzerenona. Além disso, este é o primeiro relato que mostra as propriedades antifúngicas, anti-inflamatórias, antissenescentes e cicatrizantes do óleo essencial de S. cacaliifolia, sugerindo seu uso potencial como ingrediente para o desenvolvimento de produtos cosméticos para prevenção de inflamações da pele, bem como como para o tratamento de dermatofitose e inflamação associada.

5. Materiais e Métodos

5.1. Material vegetal

As mudas de Salvia cacaliifolia foram cultivadas a partir de sementes na estufa "Planta Medica" no Laboratório de Biologia Vegetal e Botânica Farmacêutica da Universidade de Cagliari (UNICA). As sementes de sálvia Cacalia, de origem mexicana, foram compradas em uma loja especializada italiana. Após 5 semanas, as mudas foram transplantadas para estufa "Planta Medica" para as necessidades ecofisiológicas da espécie. Após 2 anos de crescimento, as plantas foram colhidas (período de floração) e secas em laboratório por dois dias. Uma amostra (6/23.9/V1) foi depositada no Herbário Karalitanum (CAG), Universidade de Cagliari, Viale S. Ignazio, 13 Cagliari, Itália.

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