Mutações UMOD na doença renal crônica em Taiwan

Abstrato:UMODé o primeiro gene identificado e mais comumente mutado que causa doenças autossômicas dominantesdoença renal tubulointersticial(ADTKD). Estudos recentes mostraram que ADTKD-UMODé uma causa relativamente comum dedoença renal crônica(DRC). No entanto, o status do ADTKD-UMODem Taiwan permanece desconhecido. Neste estudo, identificamos três heterozigotosUMODvariantes missense, c.121T > C (p.Cys41Arg), c.179G > A (p.Gly60Asp) e c.817G > T (p.Val273Phe), em um total de 221 famílias selecionadas com DRC (1,36%). Duas dessas variantes missense, p.Cys41Arg e p.Gly60Asp, não foram relatadas anteriormente. In vitro, estudos mostraram que ambas as variantes da uromodulina apresentam defeitos no tráfego da membrana celular e na excreção para o meio de cultura. O modelo de estrutura previu a formação alterada de ligações dissulfeto em ambas as variantes, mas previu-se que apenas p.Gly60Asp causaria desestabilização da proteína. Nossas descobertas ampliam o espectro de mutação e indicam que o gene ADTKD-UMODcontribuiu para uma causa pequena, mas significativa, de DRC na população de Taiwan.

Palavras-chave: uromodulina;doença renal crônica(DRC); tubulointersticial autossômico dominantedoença renal(ADTKD); insuficiência renal (IC).

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1. Introdução

ADTKD é uma doença de herança dominante rara causada por mutações heterozigóticas em UMOD [1], MUC1 [2], HNF1B [3], REN [4] e SEC61A1 [5]. UMOD é a primeira causa identificada e a mais comum de ADTKD, e tem sido objeto de extensa investigação [1,6]. Embora raro, o ADTKD é o terceiro monogênico mais comumdoença renalapós ADPKD e nefropatia de colágeno tipo IV, mas a prevalência de ADTKD-UMOD permanece obscura, e estudos recentes mostram que ela representa até 2% dos pacientes com KF ou 0,3% de todos os indivíduos com DRC [7, 8]. UMOD codifica a uromodulina e é a proteína mais abundante na urina humana [9]. A uromodulina é uma proteína específica do rim produzida pelas células epiteliais do ramo ascendente espesso da alça de Henle e da parte inicial do túbulo contorcido distal [10], e é formada como um polímero de alto peso molecular através de sua zona domínio pelúcido [11]. Além disso, a uromodulina é uma proteína altamente glicosilada, com sete locais de N-glicosilação e clivagem no final do C-terminal pela serina protease hepsina, antes de ser excretada no lúmen tubular [9,12,13]. A função da uromodulina inclui proteção contra a cristalização de oxalato de cálcio [14], defesa contra infecções no trato urinário por bactérias uropatogênicas [15–18] e regulação do canal de íons Ca2+-K+ [19]. O efeito das mutações UMOD é o atraso na maturação, retenção no retículo endoplasmático (RE), redução da expressão na membrana plasmática e diminuição da excreção urinária, o que leva ao estresse do RE e à resposta proteica desdobrada [20–22].

Os fenótipos clínicos de ADTKD-UMOD são inespecíficos e incluem DRC, gota, hiperuricemia, proteinúria normal a leve, presença ou falta de história familiar e a maioria dos indivíduos afetados que entram em FK entre as idades de 30 e 50 anos [23]. A histologia renal mostra dilatação ou atrofia tubular, cancelamento ou espessamento da membrana basal tubular, fibrose intersticial e acúmulo de uromodulina mutada como materiais polimórficos não estruturados revelados pela coloração PAS [24,25].

Taiwan tem a maior incidência e prevalência de DRC e FK com base em comparações internacionais do relatório USRDS [26]. No entanto, nenhum estudo se concentrou na situação do ADTKD-UMOD na população com DRC em Taiwan. Neste estudo, examinamos a prevalência de mutações ADTKD-UMOD em uma coorte selecionada de DRC em um único centro terciário em Taiwan.

2. Materiais e métodos

2.1. Indivíduos com DRC e preparação de DNA

Este estudo recrutou 221 famílias com DRC (228 indivíduos) do Programa de Cuidados com DRC do Hospital Universitário Médico de Kaohsiung. Os critérios de inclusão incluíram episódios de gota ou hiperuricemia com TFGe inferior a 90 mL/min/1,73 m2 antes dos 40 anos de idade. Amostras de sangue, informações de pedigree e acesso aos resultados de exames laboratoriais foram obtidos dos indivíduos após consentimento informado. O estudo foi conduzido seguindo a Declaração de Helsinque e aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da KMUH (KMUHIRB-G(II)-20160024). O DNA de amostras de sangue periférico foi extraído de acordo com o método padrão.

2.2. Sequenciamento de Exoma e Análise Bioinformática

O painel Nextera Flex for Enrichment and Exome (CEX V2, Illumina, San Diego, CA, EUA) foi utilizado para a criação da biblioteca exoma. A seleção de tamanho, captura de sequência, enriquecimento e eluição foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante. A distribuição de tamanho das bibliotecas de DNA foi então medida usando TapeStation 4150 (Agilent, Santa Clara, CA, EUA), seguido de sequenciamento em um Illumina NovaSeq 6000 com leituras de pares de 150 pb. Os dados fastq resultantes foram alinhados à sequência do genoma humano de referência (GRCh37/hg19) e realizamos a chamada de variantes de nucleotídeos usando a plataforma DRAGEN Bio-IT (Illumina). O arquivo VCF foi analisado no CLC Genomics Workbench (Qiagen, Germantown, MD, EUA). As variantes identificadas foram rotuladas como patogênicas/provavelmente patogênicas, variante de significado incerto (VUS) ou benignas, de acordo com a classificação do American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG), usando o software VarSome, e comparamos variantes que existiam no ClinVar , bancos de dados HGMD e dbSNP. As variantes patogênicas, provavelmente patogênicas e VUS detectadas foram confirmadas pelo sequenciamento Sanger. Para o sequenciamento Sanger, os produtos de PCR foram purificados por tratamento com fosfatase alcalina/exonuclease I de camarão (78390, USB Products, Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA) e depois submetidos ao sequenciamento de ambas as extremidades por sequenciamento por termociclador usando o sequenciamento BigDye® terminator 3.1 kit (4337458, Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) após análise em um analisador de DNA ABI 3730XL (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). A análise de segregação foi realizada se o DNA estivesse disponível em membros da família. Os exons 2, 3, 4 e 5 do UMOD foram triados pelo sequenciamento Sanger no probando de 221 famílias de DRC, exceto a família DY5, que recebeu sequenciamento do exoma. A sequência NCBI Ref NM_003361.4 é usada para UMOD. A nomenclatura padrão recomendada pela Human Genome Variation Society (http//www.hgvs.org/; acessado em 18 de julho de 2022.) foi usada para numerar nucleotídeos e nomear mutações ou variantes.

2.3. Cultura Celular e Transfecção Transitória

Células HEK293 (CRL-1573, ATCC, Manassas, VA, EUA) foram cultivadas na modificação de Kaighn do meio F-12 de Ham (F-12K) (N3520, Merck/Millipore Sigma, Burlington , MA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (10437028, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA), 100 unidades/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina (10378016, Gibco, Thermo Fisher Scientific ) e 10 unidades/mL de interferon (IF002, Merck/Millipore Sigma). As células foram mantidas a 37 ◦C em atmosfera umidificada de 5% de CO2.

A transfecção transitória de células HEK293 foi realizada utilizando Lipofectamine 2000 (11668027, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Resumidamente, 2,5 µL de Lipofectamine 2000 foram adicionados diretamente em 100 µL de meio Optimum (31985062, Gibco, Thermo Fisher Scientific) e incubados durante 5 min à temperatura ambiente. Um total de 1 µg de DNA foi adicionado à mistura Lipofectamine 2000 – Optimum e incubado por mais 20 min. A mistura de DNA foi adicionada a placas de cultura celular com meio isento de soro, gota a gota, no final da incubação. Para o estado de saúde das células após a transfecção transitória, utilizamos o contador automatizado de células LUNA-II™ (Aligned Genetics, Anyang-si, Gyeonggi-do, Coreia) para detectar a viabilidade celular com coloração azul de tripano em um ponto de tempo diferente, e mais as células transfectadas permaneceram vivas após diferentes superexpressão de uromodulina (dados não mostrados).

2.4. Mutagênese dirigida ao local

O vetor de uromodulina de tipo selvagem marcado com HA foi obtido do Dr. Rampoldi [27]. As construções de mutação de p.Cys41Arg e p.Gly60Asp foram criadas usando o kit de mutagênese dirigida ao local QuikChange II (200523, Agilent) de acordo com as instruções do fabricante. As mutações foram confirmadas pelo sequenciamento Sanger

2.5. ELISA e fracionamento

As construções de expressão de vetor vazio, uromodulina de tipo selvagem, p.Cys41Arg uromodulina e p.Gly60Asp uromodulina foram transfectadas transitoriamente para células HEK293. Após a transfecção transitória, o meio de cultura foi coletado às 8, 24 e 32 horas e depois armazenado a -80 ◦C antes da medição. Para imunotransferência, o meio de cultura foi condensado por Centri con (YM3, icon, Merck/Millipore Sigma) antes da eletroforese SDS-PAGE. O ELISA foi utilizado para realizar dosagens da uromodulina no meio de cultura de acordo com as instruções do fabricante (EHUMOD, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). Resumidamente, o meio de cultura e os padrões foram diluídos num diluente de ensaio fornecido no kit e adicionados aos poços em duplicado. Após 2,5 horas de incubação à temperatura ambiente, os poços foram lavados com PBS e foi adicionado o anticorpo uromodulina biotinilado. Após 1 h de incubação à temperatura ambiente, os poços foram lavados novamente e um anticorpo secundário estreptavidina-peroxidase de rábano foi adicionado. Após 45 min de incubação em temperatura ambiente, os poços foram lavados novamente e a cor foi desenvolvida pela adição de solução de substrato TMB e incubação no escuro em temperatura ambiente por 30 min. A reação foi interrompida pela adição da solução de parada fornecida no kit, seguida da leitura imediata em DO450 e DO550. A concentração de uromodulina no meio de cultura foi determinada por interpolação na curva padrão.

Após a coleta do meio de cultura, as células fixadas na placa de cultura foram fracionadas utilizando um kit de fracionamento de proteínas subcelulares (78840, Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, coletamos quantidades iguais de três tipos diferentes de lisado celular de uromodulina e removemos todo o sobrenadante até o mais seco possível. Adicionamos tampão de extração citoplasmática gelado contendo inibidores de protease ao sedimento celular, incubado a 4 ◦C por 10 min com mistura suave e depois centrifugado a 500× g por 5 min. Removemos imediatamente o sobrenadante (extrato citoplasmático) para um tubo limpo pré-resfriado em gelo e adicionamos ao pellet um tampão de extração de membrana gelada contendo inibidores de protease. A porção da membrana foi agitada em vórtex por 5 s na configuração mais alta e incubada a 4 ◦C por 10 min com mistura suave. Transferimos o sobrenadante (extrato de membrana) para um tubo limpo pré-resfriado em gelo após centrifugação a 3000× g por 5 min. A membrana subcelular e a proteína citoplasmática foram analisadas por western blotting.

2.6. Análise de imunotransferência

As amostras de proteínas foram coletadas das células com tampão RIPA (R0278, Merck/Millipore Sigma) ou etapa de fracionamento. Posteriormente, a concentração de proteína foi determinada usando um corante de ensaio de proteína (5000006, BIO-RAD, Hercules, CA, EUA) e acesso a igual quantidade de proteína, depois separada por eletroforese em SDS-PAGE. Após as proteínas terem sido transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (1620177, BIO-RAD), a membrana de PVDF foi imersa em leite desnatado a 5% a 1X TBST, bloqueando por 1 h em temperatura ambiente, e lavada três vezes com 1X TBST para 5 minutos. Em seguida, incubamos a membrana de PVDF com o anticorpo primário a 4 ◦C durante a noite, lavamos três vezes com 1X TBST por 5 min e incubamos com o anticorpo secundário por 1 h em temperatura ambiente. Ele foi lavado três vezes com 1X TBST por 5 min após a incubação do anticorpo secundário, então adicionamos o kit de substrato de quimiluminescência aprimorada (ECL) (GERPN2134, Merck/Millipore Sigma) e detectamos o sinal da proteína usando um processador de raios X (MXP{{ 19}}, KODAK, Rochester, NY, EUA) em filme de raios X (Super RX, FUJIFILM, Minato-ku, TKY, JPN). Anticorpos primários e secundários foram diluídos com 5% de leite desnatado em 1X TBST, e as informações detalhadas são as seguintes 1:2000 para uromodulina (sc-20631, Santa Cruz, Dallas, TX, EUA) e 1:20.000 para coelho 2º anticorpo HRP (GTX213110-01, GeneTex, Irvine, CA, EUA).

2.7. Predição da estrutura proteica

A dinamite foi aplicada para a previsão da estrutura 3D da uromodulina de tipo selvagem e mutante (//biosig.unimelb.edu.au/dynamut/; acessado em 15 de junho de 2022.) usando a estrutura completa da uromodulina humana nativa (Proteína Banco de dados: 7PFP) [28]. DiANNA foi usado para a previsão da ligação dissulfeto (//clavius.bc.edu/~clotelab/ DiANNA/; acessado em 16 de junho de 2022.) do tipo selvagem e da uromodulina mutante [29–31].

2.8. Análise Estatística

O software de análise ImageJ analisou e quantificou as bandas de western blot. As análises estatísticas e os gráficos foram realizados e elaborados no software GraphPad Prism8 (GraphPad Software Incorporation, San Diego, CA, EUA), e a média ± SEM foi apresentada. Um teste t não pareado foi aplicado para comparação entre dois grupos. Os resultados estatísticos foram marcados da seguinte forma: * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001. Cada experimento foi repetido pelo menos três vezes.

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