A glicoproteína E truncada do vírus varicela-zóster é um imunogênio ideal para o projeto de vacina baseada em Escherichia Coli

O vírus varicela-zoster (VZV) é um agente altamente infeccioso responsável pela doença varicela e herpes zoster. Apesar da elevada eficácia, continuam a existir preocupações de segurança e acessibilidade relativamente às vacinas licenciadas. Aqui, procuramos produzir um imunógeno gE de VZV usando um sistema de expressão de E. coli. Descobrimos que a expressão solúvel e o rendimento da proteína gE poderiam ser aumentados através de truncamentos no terminal C da proteína, facilitando assim um processo de purificação robusto e escalável para a fabricação de vacinas. O gE truncado de chumbo (aa 31-358), doravante denominado tgE, era um monômero homogêneo em solução e apresentava excelente antigenicidade. Finalmente, avaliamos e comparamos a imunogenicidade da tgE com a vodka comercial LAV e a vacina Shingrix. Descobrimos que o tgE com adjuvante de alumínio era imunogênico em comparação com a vodka LAV. Quando adjuvada com AS01B, uma imunização de duas doses de tgE mostrou potência comparável ou melhor em respostas de anticorpos e imunidade mediada por células com aquelas da vacina Shingrix na mesma dosagem, especialmente em termos da proporção de IFN{{8}que expressa Células T CD4+. Em conclusão, este método de expressão de tgE mediada por E. coli oferece uma estratégia econômica e escalonável para gerar um imunógeno gE de VZV ideal para o desenvolvimento de vacinas contra varicela e zoster.

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INTRODUÇÃO

O vírus varicela-zoster (VZV) é um herpesvírus alfa humano patogênico que induz duas categorias principais de doença: infecção primária por varicela, uma doença altamente contagiosa caracterizada por erupção cutânea semelhante a bolhas na pele e sintomas sistêmicos leves, como febre e mal-estar predominantemente em crianças; e herpes zoster (HZ), a reativação latente do vírus em resposta a um sistema imunológico celular enfraquecido causado pelo envelhecimento que causa uma erupção vesicular (HZ) dolorosa e localizada, com ou sem várias outras complicações (Cohen, 2013; Heininger e Seward, 2006; Zerboni et al., 2014). A varicela e o HZ podem ser prevenidos por vacinas de vírus vivos atenuados (LAV). O primeiro LAV para prevenção da varicela foi desenvolvido por Takahashi et al. (1974) baseado na cepa do vírus vOka e mais tarde foi licenciado como Varivax para uso rotineiro nos Estados Unidos. Seguiu-se o desenvolvimento e licenciamento do Zostavax para a prevenção do HZ (Tseng et al., 2011). Infelizmente, nos 10 anos desde o início das inoculações com Varivax, quase 1/3 dos casos de HZ foram confirmados como associados à cepa vOka (Galea et al., 2008), sugerindo que vOka pode infectar e estabelecer latência, como uma cepa selvagem. -tipo vírus e, em seguida, reativar para causar HZ. Além disso, a eficácia do Zostavax é inversamente proporcional à idade do paciente no momento da administração, com o aumento da idade associado a uma menor eficácia (Oxman et al., 2005). Estudos anteriores demonstraram que a glicoproteína E (gE) do VZV é a glicoproteína viral mais abundante no envelope do virião e na superfície celular infectada. GE também é um dos mais importantes antígenos protetores de VZV, capaz de induzir imunidade celular e humoral durante a infecção natural por varicela, bem como após a vacinação com vOka (Arvin, 1992; Oliver et al., 2016). Recentemente, uma vacina recombinante de subunidade HZ, Shingrix (HZ/su), foi aprovada para a prevenção do HZ e da neuralgia pós-herpética associada (NPH) em adultos com idade igual ou superior a 50 anos (Shah et al., 2019; Syed, 2018). Em ensaios clínicos, Shingrix induziu uma imunidade eficiente, específica do VZV, mediada por células (CMI), com uma eficácia global da vacina de 97,2% entre os participantes com idade igual ou superior a 50 anos e uma taxa de proteção de 91,3% nos participantes com idade igual ou superior a 97,2%. aos 70 anos. Estas descobertas indicam colectivamente um risco significativamente reduzido de HZ em indivíduos vacinados, independentemente da idade, e, portanto, uma opção de vacina mais potente em comparação com ZOSTAVAX (Lal et al., 2015; Shah et al., 2019).

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Shingrix é projetado a partir de um antígeno gE recombinante expresso em células de ovário de hamster chinês (CHO) e um sistema adjuvante baseado em lipossomas (AS01B) contendo 3-Odesacil-4′-monofosforil lipídio A (MPL) e Quillaja saponaria Molina, fração 21 (QS21) (Dendouga et al., 2012). No entanto, as células CHO recombinantes requerem um longo ciclo de produção e estão associadas a um processo de purificação complexo que resulta num elevado custo de produção e num fornecimento limitado. Como tal, Shingrix não é uma solução de vacinação ideal para utilização generalizada, particularmente nos países em desenvolvimento (Kim et al., 2012). Os sistemas de expressão microbiana oferecem diversas vantagens sobre os sistemas de expressão de mamíferos, incluindo crescimento rápido, facilidade de cultura e custos de produção mais baixos (Overton, 2014), e são, portanto, amplamente utilizados na expressão e produção de numerosos produtos biofarmacêuticos (Adkins e Wagstaff, 1998; Monie et al., 2008; Wu et al., 2012). No entanto, várias dificuldades durante a produção precisam ser superadas para a expressão bem sucedida de proteínas eucarióticas recombinantes em sistemas procarióticos, tais como dobramento incorreto e falta de modificação pós-tradução (Singh e Panda, 2005). Apesar destas dificuldades, os sistemas de expressão microbiana poderiam oferecer um sistema ideal para a produção generalizada e económica de vacinas e, portanto, justifica a investigação de antigénios de um sistema de expressão de E. coli para o desenho de uma vacina contra o VZV. Em trabalhos anteriores, mostramos a expressão bem-sucedida de uma proteína gE recombinante (rgE) em células de insetos e obtivemos proteínas purificadas para imunização de camundongos e produção de mAb (Liu et al., 2015). Com base neste trabalho, investigamos aqui se a proteína gE pode ser expressa em E. coli. Exploramos a expressão solúvel sem fusão de antígenos candidatos a gE com um truncamento C-terminal (doravante denominado gE truncado (tgE) ou tgE) em E. coli e caracterizamos as proteínas tgE purificadas. Mostramos que o tgE purificado é antigênico semelhante ao gE nativo e capaz de induzir altos títulos de anticorpos com atividade neutralizante de vOka em camundongos. Ao comparar a imunogenicidade do antígeno tgE gerado em nosso estudo com o LAV e o Shingrix, descobrimos que nosso antígeno não apenas exibe uma resposta humoral eficiente, mas também induz um CMI específico do antígeno. No geral, a nossa estratégia de E. coli para a produção de proteína tgE pode abrir caminho para um imunógeno alternativo produzido industrialmente para a vacinação contra varicela e HZ.

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RESULTADOS

Expressão e purificação de tgE recombinante em E. coli

As sequências de ADN que codificam o domínio extracelular gE do VZV foram preparadas como construções com vários truncamentos N ou C-terminais e clonadas no vector pTO-T7 para expressão proteica em E. coli. O domínio extracelular completo de gE tendeu a formar corpos de inclusão em E. coli durante a expressão, e isto poderia ser melhorado com um truncamento C-terminal. Das várias proteínas truncadas, a melhor solubilidade foi alcançada com a construção gE (aa 31-358) (Figura 1A), doravante denominada gE truncada ou tgE. O candidato tgE foi expresso com sucesso como uma proteína recombinante solúvel e purificado a partir do sobrenadante de lisados ​​​​de bactérias usando cromatografia de três etapas em escala laboratorial para avaliação adicional e desenvolvimento como uma vacina potencial. Cromatografia de troca aniônica forte foi utilizada para captura seguida de etapas de hidroxiapatita cerâmica e cromatografia hidrofóbica (Figura 1B). As etapas sucessivas do processo de purificação observaram um aumento na pureza do tgE no SDS-PAGE (Figura 1C). O tgE migrou como uma banda de aproximadamente 40 kD e apresentou boa reatividade com o anticorpo específico 1B11 (Figura 1D). O rendimento global foi de cerca de 500 µg de tgE purificado por grama de bactéria.

Caracterização do gE truncado

Cromatografia de exclusão de tamanho de alto desempenho (HPSEC) e ultracentrifugação analítica (AUC) foram utilizadas para analisar a homogeneidade e os coeficientes de sedimentação das proteínas purificadas. A proteína rgE purificada do sistema celular de inseto (Liu et al., 2015) foi utilizada como controle. Em HPSEC, o tgE apareceu um pico acentuado no tempo de retenção predominante de 16,1 min (Figura 2A), refletindo alta homogeneidade para as proteínas tgE purificadas. Em experimentos de AUC, foi observado um pico de sedimentação predominante em ~2,3 S (Figura 2B), o que equivale a ~39,4 kD, indicando que o tgE se apresenta como um monômero em solução. A calorimetria diferencial de varredura (DSC) foi utilizada para testar a estabilidade térmica da proteína tgE monitorando a capacidade térmica durante o processo de desdobramento térmico. Os perfis DSC mostraram apenas uma transição térmica durante o desdobramento da proteína a um valor de temperatura de transição (Tm) de 63,80 graus para tgE, comparável ao de rgE (63,64 graus) (Figura 2C). Para investigar a integridade conformacional das proteínas tgE purificadas, analisamos a antigenicidade da tgE utilizando um ensaio ELISA, com proteínas rgE purificadas expressas em células de insectos servindo como controlos. Nove mAbs que poderiam reconhecer epítopos conformacionais (mAb 1B11, 4G4, 14G1) ou epítopos lineares (4A2, 11B11, 11B12, 6H6, 10H6, 11E3) foram utilizados no teste ELISA (Figura 3). Encontramos valores de concentração efetiva mediana (EC50, ng mL-1) semelhantes para proteínas tgE e rgE para a maioria dos anticorpos, exceto para 1B11, que teve uma reatividade quase 10- vezes menor, sugerindo sua antigenicidade semelhante. Estes resultados sugerem que os epítopos principais na rgE estão bem preservados na proteína tgE.

Figura 1 (Cor online) Expressão e purificação das proteínas. Uma representação esquemática do projeto de construção tgE. Células de E. coli foram transformadas com plasmídeos recombinantes contendo o gene truncado gE (aa 31-358). B, Representação esquemática do processo de purificação de tgE. O tgE foi purificado a partir do sobrenadante lisado utilizando cromatografia em três etapas. C, perfil SDS-PAGE de tgE durante o processo de purificação. O peso molecular do tgE é de aproximadamente 40 kD. M: marcador de peso molecular. Pista 1: sobrenadante separado do lisado celular; pista 2: fração contendo tgE do cromatógrafo Q-FF; pista 3: fração contendo tgE do cromatógrafo CHT; pista 4: fração do cromatógrafo Butil, contendo a proteína tgE com alta pureza. D, Immunoblotting do tgE purificado.

Análise de respostas imunes induzidas por tgE em camundongos

Para comparar a imunogenicidade de tgE com rgE, formulamos as proteínas com dois adjuvantes comumente usados ​​em trabalhos de pesquisa: adjuvante à base de alumínio Al-001 e adjuvante de Freund. Os ratos foram imunizados três vezes nas semanas 0, 2 e 4 com uma dosagem de 1 ug para tgE e rgE com adjuvante. Os títulos de anticorpos específicos para gE e as respostas das células T na semana 5 após a primeira imunização foram utilizados para determinar a imunogenicidade de diferentes formulações adjuvantes. Camundongos imunizados com a vacina tgE formulada com Al-001 apresentaram perfis de anticorpos semelhantes aos camundongos do grupo rgE, e o adjuvante de Freund apresentou melhor efeito de estimulação quando formulado com tgE do que com rgE (Figura 4A). Os títulos de neutralização não mostraram diferenças em camundongos imunizados com a vacina tgE ou rgE, com títulos neutralizantes de ~103 para tgE formulados com os diferentes adjuvantes (Figura 4B). No entanto, na análise de células T CD4+ de esplenócitos por coloração intracelular de citocinas (ICS), ambas as vacinas tgE e rgE provocaram níveis semelhantes de IFN- específico para gE em comparação com o grupo salino (Figura 4C, ~{ {22}},1% para grupos de vacinas ou grupo de solução salina) e apenas uma simulação moderada de IL específica de gE{{20}} (Figura 4D, ~0,2% para grupos de vacinas vs. ~0,1 % para grupo salino). Tomados em conjunto, estes resultados mostram que tgE/Al-001 e o adjuvante tgE/Freund provocam respostas imunitárias específicas de gE comparáveis ​​às provocadas por rgE, com uma resposta humoral particularmente forte.

Avaliação da vacina candidata tgE contra varicela em comparação com LAV

Em seguida, avaliamos a produção de anticorpos e a persistência de proteínas tgE com adjuvante de alumínio em camundongos BALB/c. Dois grupos de camundongos (n=5 por grupo) foram imunizados três vezes nas semanas 0, 2 e 4 com diferentes dosagens de 0,5 ug e 5 ug de tgE/Al{{ 8}} (Figura 5A e B). Os perfis de resposta de anticorpos mostraram que a inoculação primária da proteína tgE provocou altos títulos de anticorpos, com um aumento sustentado após as duas imunizações de reforço nas semanas 2 e 4, e atingindo um nível máximo na semana 6 antes de cair lentamente para mais de 1{{ 20}}4 durante o período de monitoramento. Diferentes grupos de dosagem compartilharam perfis de títulos de anticorpos semelhantes durante o período de monitoramento, com altos títulos neutralizantes semelhantes na semana 6. A imunogenicidade da tgE foi avaliada e comparada com a vodka. A dosagem semi-eficaz (ED50) em camundongos foi usada como medida de soroconversão, com um ED50 mais baixo indicativo de melhor imunogenicidade. Camundongos Balb/c foram separados em grupos e imunizados intraperitonealmente com tgE com adjuvante de alumínio (1, 0,5, 0,25, {{50}},125, {{ 54}}.0625, ou 0.03125 ug; n{{30}}) ou vacina vOka (1,000, 500, 250, 125 ou 62,5 pfu; n=6) em diluições em série. Os soros foram coletados após 4 semanas e testados usando ELISA. A soroconversão foi analisada pelo método de Reed e Muench (Figura 5C). Nas faixas etárias, os camundongos apresentaram taxas de soroconversão de 83%, 100%, 100%, 100%, 50% e 17% para dosagens de 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625 e 0,03125 ug, respectivamente. Nos grupos de vodka, os ratos tiveram taxas de soroconversão mais baixas de 67%, 50%, 33%, 17% e 0% para dosagens de 1, 000, 500, 250, 125 ou 62,5 pfu, respectivamente. Os valores de ED50 foram 0,063 ug para tgE e 449,425 pfu para vOka, indicando que a imunogenicidade de tgE em uma dosagem mais baixa de 0,3 ug foi equivalente àquela alcançada com uma dose única de vacina contra varicela contendo vOka (geralmente acima de 2,{{78} } pfu por dosagem).

Figura 2 Caracterização das proteínas tgE e rgE. A, perfis HPSEC do tgE purificado. O tempo de retenção do gE é indicado. B, Análise da velocidade de sedimentação da proteína tgE purificada. O coeficiente de sedimentação e o peso molecular do tgE foram determinados pelos métodos c(s) e c(M) independentemente. Em (A) e (B), tgE é mostrado em preto e vermelho em azul. C, Perfis de calorimetria de varredura diferencial da proteína tgE e rgE purificada.

Figura 3 Reatividades de tgE e rgE com mAbs. Os mAbs foram diluídos em série e reagiram com proteínas tgE ou rgE revestidas num ensaio ELISA. As reações foram detectadas utilizando anticorpos anti-murganho marcados com HRP. Poços duplicados foram medidos na mesma placa para cada diluição. Os valores de EC50 foram calculados por ajuste de tendência sigmóide usando o software GraphPad Prism.

Figura 4 Imunogenicidade de tgE e rgE testada em camundongos BALB/c 1 semana após a imunização com três doses. A, Produção de anticorpos em camundongos para tgE e rgE formulados com diferentes adjuvantes. B, Títulos de anticorpos neutralizantes em camundongos para tgE e rgE formulados com diferentes adjuvantes. C e D, Avaliações de respostas específicas de IFN- e IL -2 gE induzidas por vacinas tgE ou rgE.

Figura 5 Testes de imunogenicidade da vacina tgE formulada com alumínio em camundongos BALB/c. A e B, Persistência de anticorpos e resposta de anticorpos neutralizantes de tgE/Al-001. Os títulos foram monitorados por até 16 semanas. C, ED50 em camundongos para tgE formulado com alumínio e vodka.

Avaliação da vacina candidata tgE Zoster em comparação com Shingrix

Para comparar a imunogenicidade da nossa vacina tgE com Shingrix, a proteína tgE liofilizada foi formulada com o adjuvante Shingrix, AS01B. Camundongos C57BL/6 foram imunizados com duas doses de tgE/AS01B ou Shingrix por via intramuscular no músculo tibial nas semanas 0 e 4. Os níveis de anticorpos após a primeira imunização sugeriram que a imunização com Shingrix foi suficiente para induzir altos níveis de anticorpos anti-gE, significativamente superiores aos produzidos por tgE/AS01B; após a segunda imunização, no entanto, não houve diferença significativa na produção de anticorpos entre os dois grupos (Figura 6A). Quanto aos níveis de anticorpos neutralizantes, uma imunização com dose única de tgE/AS01B levou à produção de quantidades insignificantes de anticorpos neutralizantes, significativamente inferiores às produzidas por Shingrix. Contudo, novamente, após a imunização de reforço, não pudemos ver nenhuma diferença significativa em termos de produção de anticorpos neutralizantes entre os dois grupos (Figura 6B). Para verificar como a imunização afeta o CMI, os níveis de IFN- e IL específicos de gE-2 foram detectados após a primeira e a segunda imunizações usando o ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISPOT) e coloração de citocinas intracelulares. A imunização tgE/AS01B induziu uma resposta imune humoral fraca em comparação com uma dose única de Shingrix, mas mostrou potência comparável em termos de indução de esplenócitos produtores de IFN- - e IL-2-(Figura 6C). De facto, após a segunda imunização, foi detectado um número significativo de células produtoras de citocinas específicas para gE no grupo tgE/AS01B em comparação com o grupo de controlo de solução salina, que também foram comparáveis ​​ou melhores do que as do grupo Shingrix (Figura 6D ). Resultados semelhantes foram observados na análise de citometria de fluxo, com observações de proporções semelhantes de células T CD4+ que expressam IFN- -(Figura 6E), IL-2-que expressam CD4+ T células T (Figura 6F) e células T IFN- -CD8+ (Figura 6G) entre os camundongos imunizados com tgE/AS01B e Shingrixi, independentemente de uma imunização com dose única ou dose de reforço. Estes resultados demonstram que a proteína tgE derivada do sistema de expressão bacteriano pode induzir respostas imunitárias tanto humorais como celulares quando formulada com adjuvantes apropriados, e assim pode ser considerada como um antigénio candidato para a geração de uma vacina contra o VZV.

Figura 6 Imunogenicidade de tgE em camundongos C57BL/6. Foram administradas doses de 5 ug de tgE formuladas com 50 μL de adjuvante AS01B. Isto foi 1/10 da dose da vacina Shingrix. A imunização foi realizada nas semanas 0 e 4. A, Comparação da produção de anticorpos induzida pela vacina tgE/AS01B em comparação com Shingrix. Os títulos séricos foram determinados por ensaio ELISA utilizando placas revestidas com rgE. B, Comparação da resposta de anticorpos neutralizantes à vOka após vacinação com vacina tgE/AS01B ou Shingrix. Os títulos de neutralização do anti-soro na semana 2 (painel da esquerda) e na semana 6 (painel da direita) são expressos como o inverso da diluição do soro, resultando em 50% de inibição. C, Avaliação de respostas de IFN- e IL-2 específicas de gE induzidas pela vacina tgE/AS01B ou Shingrix na semana 2. Os números de esplenócitos produtores de IFN- - e IL-2- foram calculados a partir do Ensaio ELISPOT após reestimulação com um conjunto de peptídeos gE. D, Avaliação de respostas de IFN- e IL-2 específicas de gE induzidas pela vacina tgE/AS01B ou Shingrix na semana 8. Os números de esplenócitos produtores de IFN- - e IL-2- foram calculados a partir do Ensaio ELISPOT após reestimulação com um conjunto de peptídeos gE. E – G, Ensaios de citometria de fluxo para células CD4+ e CD8+ que expressam citocinas específicas de gE. A proporção de células T CD4+produtoras de IFN, células T-2-produtoras de IL4+ e células T CD- -produtoras de IFN8+ células entre os esplenócitos foi determinada.

DISCUSSÃO

O gE do VZV é um alvo importante da resposta imune humoral e mediada por células durante a infecção natural pela varicela e após a vacinação contra o VZV Oka. Shingrix (GSK) é uma vacina de subunidade recombinante que compreende um gE do VZV expresso em células CHO e o adjuvante AS01B à base de lipossomas. Outros trabalhos procuraram investigar vacinas de subunidades contra HZ usando proteínas gE geradas a partir de CHO ou células de insetos formuladas com novos adjuvantes (Cao et al., 2021; Lee et al., 2020; Luan et al., 2022a, Luan et al., 2022b; Wang et al., 2021; Wui et al., 2019; Wui et al., 2021). Aqui, investigamos e mostramos que a proteína gE poderia ser expressa de forma solúvel e purificada a partir de E. coli, e então formulada como uma vacina candidata de subunidade com um adjuvante apropriado para obter não apenas um título neutralizante robusto, mas também uma forte resposta CMI.

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E. coli como sistema de expressão oferece diversas vantagens: rápida taxa de crescimento celular, condições de cultura baratas e uma ferramenta eficiente e versátil para a produção de proteínas recombinantes. A pesquisa de antígenos associados ao vírus herpes teve vários sucessos usando o sistema de expressão baseado em E. coli. Um epítopo linear neutralizante gE (aa 121-135) foi fundido com 149 aa da proteína central do vírus da hepatite B (HBc) para produzir VLPs quiméricas que poderiam induzir anticorpos neutralizantes específicos de VZV em camundongos (Zhu et al., 2016). Em outro estudo, uma proteína gE homóloga do vírus da varicela símia (SVV) foi expressa em E. coli utilizando um marcador de fusão GST para gerar anti-soro gE (Gray et al., 2001). Até o momento, não houve relatos de uma proteína gE do VZV sem um marcador de fusão purificada de E. coli como candidata a vacina.

gE consiste em três regiões: um ectodomínio hidrofílico 544-aa com um peptídeo sinal (aa 1–30), uma região transmembranar hidrofóbica 17-aa e uma região de cauda citoplasmática 62-aa. Nós investigamos várias moléculas candidatas com diferentes truncamentos nas regiões N ou C-terminais do ectodomínio gE e descobrimos que a expressão exógena dessas proteínas em E. coli foi melhor usando a porção truncada (dados não mostrados). Um ectodomínio gE intacto sem etiqueta de fusão tende a formar corpos de inclusão quando expresso por E. coli e é difícil de purificar. Entre os candidatos de truncamento testados, a proteína gE (aa 31-358) apresentou alta expressão solúvel com dificuldades mínimas em sua purificação, bem como alta pureza e alta homogeneidade (Figura 1). Assim, esta construção de truncamento foi considerada uma vacina candidata ideal antígeno. Esta estratégia de truncamento poderia ter tido um efeito potencial nas propriedades da proteína, particularmente na sua antigenicidade. Anteriormente expressamos gE recombinante em células de inseto e purificamos esta construção para imunizar camundongos BALB/c, obtendo 70 gE de anticorpos monoclonais para análise de epítopos (Liu et al., 2015). Através da nossa análise, identificamos aa 1–194 como a região imunodominante (dados não mostrados). Resultados semelhantes foram obtidos em outros lugares, com mAbs específicos de gE apontando para as regiões aa 109-123 e 160-316 sendo as regiões responsáveis ​​pela ligação estável de anticorpos entre isolados variantes (Vafai, 1994). Em outro estudo, usando VLPs de fragmentos gE híbridos recombinantes, os autores identificaram os resíduos 1-134 como a região mais antigênica da proteína gE e mostraram que o terminal C de gE (resíduos 303-623) contendo vários resíduos de cisteína não conseguiu produzir partículas em levedura (Fowler et al., 1995), sugerindo que a expressão heteróloga de gE deveria considerar não apenas a antigenicidade, mas também a facilidade de expressão. Aqui, otimizamos o comprimento da proteína gE para sua expressão solúvel eficiente com reduções mínimas na antigenicidade. O tgE mostrou reatividade semelhante à maioria dos anticorpos na Figura 3, assim como o rgE produzido em células de insetos, sugerindo que os epítopos principais estão bem preservados na proteína tgE purificada de E. coli. No entanto, um estudo mostrou que os epítopos de células T CD4+ imunodominantes reconhecidos pelos doadores da vacina Shingrix estavam dispersos por toda a proteína gE (Voic et al., 2020). A imunogenicidade do tgE em nosso estudo foi idêntica àquela encontrada para gE derivado de células CHO em Shingrix quando o antígeno foi combinado com o adjuvante AS01B, com respostas humorais e respostas CMI igualmente eficientes, como mostrado na Figura 5. Esses resultados indicaram que o gE truncado derivado do sistema procariótico foi tão bom quanto o ectodomínio gE intacto do sistema eucariótico em termos de antigenicidade.

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Existem diferenças consideráveis ​​entre proteínas gE derivadas de diferentes sistemas de expressão. As diferenças mais proeminentes são observadas nas modificações pós-tradução, particularmente na glicosilação. Os glicanos ligados a O de glicoproteínas de membrana têm relevância em termos de reconhecimento de células T e anticorpos de epítopos de glicopeptídeos virais, e este reconhecimento tem o potencial de alta significância biomédica em nossas tentativas de mediar a proteção imunológica contra vírus usando vacinas de subunidades. A remoção dos glicanos em gE produzidos em células CHO-K1 resultou numa redução de 17% na reactividade com soros positivos para VZV. Em contraste, a O-glicosilação pode interferir com a imunorreatividade dos epítopos das células B: alguns epítopos importantes são bloqueados por glicanos ligados ao O adicionais (Nordén et al., 2019). Em nosso estudo, o tgE gerado a partir de E. coli parece se comportar tão bem quanto o rgE derivado de células de inseto em termos de sua imunorreatividade e imunogenicidade, sugerindo que a proteína tgE "nua" é promissora como candidata a vacina. As vacinas com tgE como antigénio são susceptíveis de induzir não só títulos elevados de IgG, indicativos do seu potencial como vacina de subunidade contra a varicela sem um risco potencial de latência do vírus, mas também elevados CMI, sugestivos do seu potencial também como vacina contra o zoster. Globalmente, o antigénio gE derivado do sistema de expressão bacteriano neste estudo oferece uma estratégia muito mais económica para o desenvolvimento de vacinas contra o VZV.

Referências

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Cao, H., Wang, Y., Luan, N. e Liu, C. (2021). Imunogenicidade da glicoproteína E do vírus varicela-zoster formulada com nanopartículas lipídicas e imunoestimuladores nucleicos em camundongos. Vacinas 9, 310.

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