Novos efeitos da terapia combinada através da inibição de caspase-1/piroptose induzida por gasdermina D na nefrite lúpica

Para mais informações:ali.ma@wecistanche.com

Heng Cao, Junyu Liang, Jing Liu, Ye He, Yini Ke, Yiduo Sun, Song Jiang e Jin Lin

ABSTRATO

Objetivos: A terapia combinada com micofenolato de mofetil, tacrolimus e esteróides é eficaz para alcançar a remissão completa emdoença de Lupus(LN). A terapia de combinação regula a caspase de forma exclusiva-1 em comparação com as monoterapias, que podem clivar a gasdermina D (GSDMD) e foi recentemente identificada como apiroptosecarrasco. Portanto, investigamos se a terapia combinada permitia a supressão de caspase-1/GSDMD mediadapiroptoseem LN (doença de Lupus).

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Métodos: A expressão e a ativação de GSDMD foram detectadas em espécimes renais de humanos e camundongos com LN (doença de Lupus) usando coloração imuno-histoquímica e immunoblotting. Os podócitos primários isolados de camundongos MRLlpr foram incubados com LPS mais ATP e pré-tratados com monoterapia ou terapia combinada. Inibição de caspase-1/induzida por GSDMDpiroptosepor terapia combinada foi avaliada em camundongos MRLlpr e espécimes humanos. Fui examinado usando um kit FAM caspase-1 e citometria de fluxo. A correlao entrepiroptoseno sangue periférico e foi analisado o índice de atividade da doença do lúpus eritematoso sistêmico (SLEDAl).

Resultados: Amostras de tecido renal de LN (doença de Lupus) pacientes e camundongos exibiram níveis de expressão e clivagem de GSDMD muito aumentados. Em podócitos cultivados, o tratamento combinado suprimiu significativamente a ativação de NLRP3 e caspase-1 e reduziu os níveis N-terminais de GSDMD. A terapia combinada reprimiu a progressão da doença através da inibição da caspase-1/mediada por GSDMDpiroptoseem humanos e camundongos MRL/LPR. Os números de células positivas para caspase-1/PI no sangue periférico foram positivamente correlacionados com LES-DAl. LN (doença de Lupus) pacientes com remissão completa e remissão parcial tiveram números de células positivas de caspase-1/PI notavelmente reduzidos em comparação com a linha de base. Ac-FLTD-CMK, um inibidor derivado de GSDMD, impediu o desenvolvimento de LN (doença de Lupus).

Conclusão: A terapia combinada suprimiu a caspase-1/mediada por GSDMDpiroptosein vitro e in vivo e redução da progressão da doença.

Palavras-chave:doença de Lupus, piroptose, caspase-1, gasdermina D, terapia

Terapia de tratamento parapiroptose

INTRODUÇÃO

Doença de Lupus(LN) é a inflamação renal que surge como consequência da doença autoimune lúpus eritematoso sistêmico (LES).LN (doença de Lupus) é uma manifestação importante em pacientes que sofrem de LES. Cerca de 60 por cento dos pacientes desenvolvem esta condição, com aproximadamente 20 por cento progredindo para doença renal terminal (ESRD)(1). A terapia combinada com micofenolato mofetil (MMF), inibidores de calcineurina (CNI) e esteróides produz efeitos complementares e também minimiza a toxicidade (2). Esta terapia é recomendada como tratamento inicial para NL (doença de Lupus) e produz melhor eficácia e remissão mais completa em comparação com ciclofosfamida intravenosa (IVCY) e esteróides (3-5).

Para investigar os mecanismos moleculares e celulares da terapia combinada, a análise transcriptômica abrangente foi empregada em um modelo murino de LN (doença de Lupus). Camundongos MRL/LPR receberam sozinho MMF, tacrolimus ou prednisona como monoterapia ou combinações de drogas triplas. Perfis da expressão de genes nos rins de camundongos com NL (doença de Lupus)revelaram mecanismos potenciais que podem explicar os efeitos aditivos e sinérgicos da terapia combinada em comparação com as monoterapias. Um dos 45 genes regulados negativamente que são modulados exclusivamente pela terapia combinada é a caspase-1 (6). Ela é ativada por inflamassomas, que são oligômeros multiproteicos compostos por NLRP3, pró-caspase-1 e proteína especk-like associada à apoptose (ASC), com um domínio de afinidade de caspase integrado. O inflamassoma NLRP3/ASC/caspase-1 foi reconhecido como um dos principais contribuintes para a patogênese da LN (doença de Lupus). O inflamassoma NLRP3 leva a distúrbios autoinflamatórios ativando a caspase-1, iniciando a geração de citocinas pró-inflamatórias, por exemplo, IL-1, que é conhecida por desencadear disfunção podocitária em LN(7-9).

A caspase ativa-1 cliva a gasdermina D(GSDMD) dentro da ligação de seus domínios N e C-terminal. Então, o domínio N-terminal facilita a formação de poros na membrana celular, estimula apiroptosee produção de citocina IL-1 e IL-18(10). Estudos emergentes têm mostrado que mediadas por GSDMDpiroptoseparticipa na progressão de doenças, incluindo encefalomielite autoimune (11), esclerose múltipla(12), hepatite alcoólica(13) e doença inflamatória intestinal(14). demonstrou proteger os rins de lesão em modelos murinos de doença renal diabética(15, 16) e também após lesão renal aguda(17-19). No entanto,piroptoseem LN (doença de Lupus)ainda está mal definido até o momento(20). Nós hipotetizamos que a terapia combinada conferiu efeitos benéficos em LN (doença de Lupus)) ao inibirpiroptoseinduzida por caspase-1/GSDMD.

No presente estudo, a ativação de caspase-1 e GSDMD em tecidos renais foi investigada, bem como os efeitos da terapia combinada em caspase-1/GSDMD-dependentepiroptoseinibição em camundongos MRL/LPR e pacientes com LN (doença de Lupus). Correlações potenciais depiroptosecom o índice de atividade da doença do LES (SLEDAI) e as respostas ao tratamento também foram avaliadas.

Tratamento parapiroptose

MATERIAIS E MÉTODOS

População do estudo

A coorte do estudo foi composta por pacientes diagnosticados por biópsia com NL (lúpusnefrite) Inferior ou igual a 6 meses antes da inscrição. A faixa etária do paciente era de 18-65 anos e todos atendiam aos critérios de classificação do American College of Rheumatology for SLE (2l, 22) e da International Society of Nephrology/Renal Pathology Society (2003). Os pacientes foram recrutados da Escola de Medicina da Universidade de Zhejiang e da Escola de Medicina da Universidade de Nanjing que apresentavam proteinúria (maior ou igual a 1,5 g/d) e concentrações séricas de creatinina menores ou iguais a 265,2 umol/L. Os critérios de exclusão incluíram: paciente ter sido tratado previamente com altas doses de metilprednisolona; biológicos (direcionamento de moléculas patogênicas específicas) ou terapia de combinação; plasmaférese atual ou tratamento com globulina intravenosa dentro de 12 semanas da triagem; funções anormais do fígado; infecções ativas atuais; e um tumor maligno dentro de 4 semanas do início do estudo. LN (lúpusnefrite) os pacientes receberam pulsoterapia com metilprednisolona por 3 dias na dose de 0,5 g/d. Uma vez que a pulsoterapia com metilprednisolona foi concluída, o grupo de combinação com prednisona (0,6 mg/kg/d), MMF (0,5 g, duas doses/d) e tacrolimus (2 mg, duas doses/d) foram administradas por um total de 4 semanas. Em seguida, as doses de prednisona, que ainda eram combinadas com MMF(0,5 g, duas doses/d) e tacrolimus (2 mg, duas doses/d), foram reduzidas em 5 mg/d a cada 2 semanas até uma dose de manutenção de 10 mg/d foi alcançada(4). A remissão completa (RC) foi considerada como uma concentração de proteína urinária 24-h menor ou igual a 0,4 g, a ausência de sedimentos urinários ativos, uma concentração de albumina sérica maior ou igual a 35 g/L e creatinina normal (23). A remissão parcial (PR) foi considerada como uma diminuição maior ou igual a 50 por cento na concentração de proteína urinária 24-h para menor ou igual a 3,5 g, uma concentração de albumina sérica maior ou igual a 30 g/ L, e um aumento normal ou menor ou igual a 25% na concentração de creatinina sérica em relação à linha de base. Nosso Conselho de Revisão Institucional aprovou o estudo (nº IIT20200410A) e todos os pacientes forneceram consentimento por escrito antes da inscrição.

Modelos de animais

Camundongos fêmeas MRL/emoji-FasPr(MRL/LPR) foram fornecidos pelo SLAC Laboratory Animal Co.Ltd (Xangai, China), todos os camundongos foram divididos aleatoriamente com a ajuda de um gerador de números aleatórios, 5 camundongos em cada grupo e cada gaiola . Eles foram tratados com 8 semanas de idade por via oral, com uma combinação de 0,5 mg/kg de tacrolimus (MCE HY-13756), 50 mg/kg de MMF (MCE HY-B0199) e 1 mg/kg kg de prednisona (MCE HY-B0214) ou veículo diariamente por um total de 8 semanas conforme descrito anteriormente(6). Ac-FLTD-CMK foi sintetizado por MCE e 10 mg/kg foram injetados ip diariamente. Todos os tratamentos foram cegos para os participantes responsáveis ​​pela detecção a seguir. A razão albumina-creatinina na urina (UACR) foi determinada usando Albuwell M e o Creatinina Companion (Excell, Phil, EUA). Amostras de rim foram fixadas em paraformaldeído a 4 por cento antes da coloração histológica e imuno-histoquímica e os córtices renais extraídos para análise de immunoblotting. O uso de camundongos foi aprovado por nosso Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (Nº2019-883).

Isolamento de glomérulos de camundongos e cultura de podócitos

Os glomérulos foram purificados dos rins de camundongos fêmeas C57 e MRL/LPR de 12-semanas de idade, conforme descrito anteriormente(24). Os camundongos anestesiados foram perfundidos com esferas magnéticas pré-aquecidas a 37 graus C. Os rins foram removidos e picados em gelo em 1 mm³. Em seguida, os tecidos renais foram digeridos a 37 graus com 1 mg/ml de colagenase e 100 U/ml de DNase I por 30 minutos e, em seguida, filtrados duas vezes com 100-µm coadores de células Falcon（431752, BD). Após várias lavagens com solução HBSS de 4 graus (H1025, Solarbio) e centrifugação suave a 200g por 5 minutos, os grânulos contendo glomérulos foram coletados usando o suporte magnético (HY-K0200, MCE) e lavados com solução HBSS três vezes. Os glomérulos isolados foram cultivados em placas cultivadas revestidas com colágeno tipo I (C3867, Sigma-Aldrich) em 5 por cento de CO, a 37 graus, de acordo com o método descrito por Jeffrey (25). Os podócitos da passagem 2 foram usados ​​no experimento in vitro.PiroptoseIndução, citotoxicidade e detecção de secreção de IL-1

Podócitos de camundongos MRL/LPR foram iniciados com 1 mg/ml de LPS (tell-pb5lps, In InvivoGen) resolvido em Opti-MEM por 4 h, seguido de estimulação 5 mM ATP (tlrlatpl, gene In Vivo). Podócitos de camundongos C57 foram cortados como controle normal. Monoterapias tacrolimus (10μM), MMF (luM) e prednisona (10μM), ou terapia combinada foi pré-incubada com as células por 1 h antes do priming LPS. A citotoxicidade após estimulação foi determinada usando um kit de detecção de citotoxicidade (11644793001, Roche) de acordo com as instruções do fabricante. O sobrenadante após a estimulação foi coletado e medido usando o kit de ELISA de camundongo IL{12}} (BMS6002, Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.

Anticorpos e Reagentes

Os níveis de caspase-1(sc-398715, Santa Cruz Biotech), GSDMDC1 (sc-81868, Santa Cruz Biotech) foram avaliados de acordo com as instruções do fabricante.Piroptoseno sangue periférico foi medido usando o Kit FAM FLICAMCaspase-1 (Bio-Rad, EUA) por citometria de fluxo.

Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas usando GraphPad Prism (vers. 8.0) e os dados são dados como média ± SD. Duas comparações de grupos foram realizadas usando o teste t de Student e análises de correlação usando a correlação de Pearson. P de duas caudas<0.05 was="" considered="" statistically="">

Tratamento parapiroptose emnefrite lúpica (NL)

RESULTADOS

Mediado por GSMDPiroptoseÉ Ativado em Rins Afetados por LN (lúpusnefrite)

Investigar se o GSDMD contribuiu para a patogênese da NL (lúpusnefrite), testamos primeiro o nível de expressão da proteína de GSDMD em amostras de rim retiradas de LN (lúpusnefrite) pacientes. A análise imuno-histoquímica revelou níveis de expressão notavelmente aumentados de GSDMD em amostras de biópsia renal retiradas de LN (lúpusnefrite) pacientes com tipo IV, V, I mais Van e IV mais V, e comparados a indivíduos saudáveis. GSDMD foi universalmente expresso em podócitos glomerulares, células tubulares e células intersticiais infiltradas em LN.lúpusnefrite) pacientes. A área com coloração positiva (setas vermelhas) e negativa (setas pretas) estava aumentada (Figura 1A). A porcentagem de área GSDMD-positiva no rim foi então estimada (Figura 1B). Resultados semelhantes foram encontrados nos rins de camundongos MRL/LPR e controles do tipo selvagem. A análise de imunotransferência confirmou a expressão e clivagem muito aumentada de GSDMD em amostras de rim de camundongos MRL/LPR (Figura 1C). O GSDMD em podócitos glomerulares, células tubulares e células intersticiais infiltradas foi elevado em camundongos MRL/LPR em comparação com camundongos controle (Figura 1D). Esses dados sugeriram que o GSDMD mediado foi ativado no tecido renal afetado por LN.lúpusnefrite).

FIGURA 1|GSDMD é fortemente elevado e clivado nos rins de pacientes e camundongos afetados por LN (nefrite lúpica).

(A) Coloração imunoquímica de GSDMD em amostras renais retiradas de indivíduos saudáveis ​​e LN (lúpusnefrite), a coloração positiva (setas vermelhas) e negativa (setas pretas) foi aumentada.

(B) A quantificação de áreas positivas para GSDMD é mostrada no tipo III mais V, IV, IV mais V, V LN (lúpusnefrite) pacientes e indivíduos saudáveis.

(C) Análise de imunotransferência do domínio N-terminal clivado e do domínio C-terminal GSDMD no córtex renal de três pares de camundongos controle e MRL/LPR.

(D) Coloração imunoquímica de GSDMD em amostras de rim retiradas de controles e camundongos MRL/LPR.

*p < {{0}},05,="" **p="">< 0,01.="" ln="">lúpusnefrite), lúpusnefrite; FL, corpo inteiro; NT, domínio N-terminal; CT, domínio C-terminal.

O tratamento combinado suprime o mediado por GSDMDPiroptoseAtivação em Podócitos Primários In Vitro

Investigar os efeitos inibitórios da terapia combinada empiroptose, aplicamos o método de estimulação LPS mais ATP para induzirpiroptoseem podócitos de camundongos MRL/LPR, tomando podócitos de camundongos C57 de tipo selvagem como controle normal. Podócitos de camundongos MRLlpr foram iniciados por 4h com LPS e posteriormente tratados por 4h com ATP, um estímulo comumente usado para o tratamento mediado por GSDMD.piroptoseativação(26). Em comparação com o controle normal, os podócitos exibiram posteriormente características morfológicas piroptóticas, como inchaço e borbulhamento das células. O pré-tratamento com terapia combinada melhorou significativamente as características morfológicas piroptóticas e a citotoxicidade (Figura 2A). Citotoxicidade em podócitos induzida por LPS mais ATP. Comparativamente, a terapia combinada diminuiu significativamente a citotoxicidade e a secreção de IL-1 no sobrenadante induzida por LPS mais estimulação de ATP (Figuras 2B, C). Para verificar ainda mais a ativação do GSDMD-mediadopiroptose, analisamos inflamassomas canônicos e ativação de GSDMD usando immunoblotting. Consistente com alterações morfológicas piroptóticas e citotoxicidade, LPS mais ATP ativou significativamente NLRP3, caspase-1 e GSDMD clivado em podócitos (Figura 2D). O tratamento combinado suprimiu marcadamente a ativação de NLRP3 e caspase-1 e reduziu o nível de GSDMD N-terminal. Notavelmente, monoterapias com tacrolimus, MMF ou prednisona suprimiram a citotoxicidade celular estimulada por LPS mais ATP e secreção de L-1, mas a terapia combinada mostrou um efeito inibitório mais significativo sobre Caspase-1 e GSDMD. Esses resultados forneceram evidências que apoiaram a visão de que o tratamento combinado melhorou a mediada por GSDMDpiroptosesuprimindo a ativação de NLRP3 e caspase-1.

FIGURA 2|O tratamento combinado melhora a piroptose em podócitos in vitro.

(A) Características piroptóticas foram exibidas em podócitos primários cultivados após incubação com LPS mais ATP e pré-tratamento com tratamento combinado. As setas indicavam células exibindo características semelhantes a piroptóticas.

(B) Os sobrenadantes das células desafiadas foram analisados ​​quanto à morte celular, conforme medido pela secreção de LDH.

(C) Os sobrenadantes das células desafiadas foram analisados ​​quanto à liberação de IL-1b.

(D) Análise de imunotransferência da expressão de NLRP3, caspase-1, GSDMD-NT e ASC após tacrolimus, MMF, prednisona ou tratamento combinado após a ativação do inflamassoma NLRP3.

*p <{{0}}.05; **p=""><0.01; ***p="">< 0,001;="" ****p="">< 0,0001.="" ldh,="" lactato="">

DSMO, dimetilsulfóxido, FK506, tacrolimus; MMF, micofenolato mofetil; PNS, prednisona; COM, terapia combinada; ASC, proteína do tipo speck associada à apoptose.

Tratamento combinado de caspase suprimida-1/induzida por GSDMDPiroptoseem camundongos MRL/LPR

Camundongos MRL/LPR de oito semanas de idade receberam uma combinação de MMF, tacrolimus e prednisona ou controle de veículo. Consistente com um estudo anterior (6), após o tratamento por 8 semanas, não foi encontrada diferença na mortalidade ou peso corporal entre os grupos de tratamento com veículo e combinação. Em contraste com o grupo do veículo, a terapia de combinação foi muito eficaz na prevenção de proteinúria, glomeruloesclerose e infiltração de células imunes intersticiais renais (Figura 1 complementar).

Em seguida, examinamos os níveis de expressão de caspase-1 e GSDMD em grupos de terapia combinada e controle de veículo. A análise imuno-histoquímica revelou que a expressão de caspase intersticial glomerular e renal-1 e GSDMD foi marcadamente diminuída no grupo de terapia combinada (Figura 3A). A análise de immunoblotting também encontrou uma expressão diminuída e clivagem de caspase-1 e GSDMD nos córtices renais do grupo de tratamento combinado (Figura 3B). Além disso, células duplamente positivas de caspase-1/iodeto de propídio (PI) foram contadas usando citometria de fluxo e umpiroptoseFAM Caspase-1kit. Os resultados revelaram uma redução acentuada no número de células sanguíneas periféricas de caspase-1*/PI' em camundongos MRL/LPR que receberam o tratamento de combinação em comparação com camundongos MRL/LPR tratados com veículo. (Figuras 3C, D). Além disso, o tratamento combinado também reduziu significativamente a concentração sérica de Ii (Figura 3E). Concluímos assim que o tratamento combinado suprimiu a caspase-1/GSDMD induzidapiroptosenos rins e células sanguíneas de LN (lúpusnefrite) ratos.

FIGURA 3|O tratamento combinado atenuou a caspase-1/piroptose mediada por GSDMD em camundongos MRL/LPR.

(A) Coloração imunoquímica de GSDMD e caspase-1 em amostras de rim de camundongos MRL/LPR. Em comparação com o controle do veículo, a expressão de caspase-1 e GSDMD foi marcadamente inibida no grupo de tratamento combinado.

(B) Análise de imunoblot de GSDMD e caspase de comprimento total e clivada-1 em espécimes de córtex renal de camundongos MRL/LPR; comparação dos resultados dos grupos de tratamento com veículo e combinação.

(C) FACS de células duplamente positivas de caspase-1/PI no sangue periférico de camundongos MRL/LPR que receberam ou não tratamento combinado.

(D) Quantificação de células duplamente positivas de caspase-1/PI no sangue periférico de camundongos MRL/LPR que receberam ou não terapia de combinação.

(E) Quantificação das concentrações séricas de IL{{0}}b em camundongos MRL/LPR que receberam ou não o tratamento combinado. ####P < 0,0001.="" facs,="" classificação="" de="" células="" ativadas="" por="" fluorescência;="" tc,="" terapia="">

Terapia de Combinação Suprimida de Caspase-1/Induzida por GSDMDPiroptoseem LN (lúpusnefrite) Pacientes

Entre janeiro de 2020 e junho de 2020,47 pacientes com NL (lúpusnefrite) foram inscritos e 43 completaram 24-semanas de terapia combinada. A doença de base e os dados demográficos da coorte inscrita estão listados na Tabela Suplementar 1. Quantificação de caspase-1/iodeto de propídio (células duplamente positivas de PI foram conduzidas em pacientes com NL (lúpusnefrite) tipo III, IV, V, III mais V, IV mais V e em controles saudáveis ​​usando umpiroptoseKit FAM Caspase-1 e citometria de fluxo. Em comparação com os controles saudáveis, o número de células duplamente positivas de caspase-1/PI no sangue periférico aumentou (Figuras 4A, B). Também examinamos células duplamente positivas de caspase-1/PI após 24-semanas de terapia e na linha de base. Após 24-semanas de terapia de indução, a incidência de RC e PR foi de 39,5 por cento (17/43) e 32,6 por cento (14/43), respectivamente. Os números de células duplamente positivos de caspase-1/PI no sangue periférico de pacientes com RC e PR foram notavelmente reduzidos em comparação com a linha de base (Figura 4C). Também identificamos uma correlação entre a caspase-1 induzidapiroptosee o SLEDA; os dados mostraram claramente que a razão positiva de caspase-1/PI no sangue periférico foi positivamente correlacionada com SLEDAI (Figura 4D). Ac-FLTD-CMK, um inibidor derivado de GSDMD, impediu o desenvolvimento de LN (lúpusnefrite).

FIGURA 4|A terapia combinada atenuou a piroptose mediada por caspase-1-em pacientes com NL (nefrite lúpica).

(A) FACS de células duplamente positivas de caspase-1/PI no sangue periférico de LN (lúpusnefrite) pacientes tratados com ou sem terapia combinada.

(B) Quantificação de células duplamente positivas de caspase-1/PI no sangue periférico do tipo III, IV, V, III mais V e IV mais V LN (lúpusnefrite) pacientes e indivíduos saudáveis.

(C) Quantificação de células duplamente positivas de caspase-1/PI no sangue periférico de LN (lúpusnefrite) pacientes no início do estudo, RC, PR e não remissão após a terapia combinada.

(D) Análise de correlação das proporções de células duplamente positivas de caspase-1/PI com SLE-DAI.

**p < 0.01.="" facs,="" classificação="" de="" células="" ativadas="" por="" fluorescência;="" ln="">lúpusnefrite), lúpusnefrite; RC, remissão completa; PR, remissão parcial; LES-DAI, índice de atividade da doença do lúpus eritematoso sistêmico.

Um estudo recente descobriu que o GSDMDhmice desenvolveu aumento da deposição renal de C3 e IgG, lesão renal mais grave e aumento da mortalidade em um modelo de LES induzido por imiquimod.17 Para esclarecer melhor o papel do GSDMD na NL (lúpusnefrite), camundongos MRL/LPR foram tratados com Ac-FLTD-CMK21 a partir de 8-semanas de idade, com o veículo como controle. Após 8-semanas de tratamento, nenhuma diferença foi encontrada na mortalidade ou peso corporal entre o veículo e o grupo tratado com Ac-FLTD-CMK. Em comparação com os camundongos de controle do veículo, os camundongos MRL/LPR tratados com Ac-FLTD-CMK tinham uma razão albumina-creatinina na urina mais baixa (Figura 5A), uma concentração de creatinina sérica mais baixa (Figura 5B), glomeruloesclerose reduzida (Figura 5C) e CD3 , infiltração de células positivas para CD4 e CD68 (Figura 5D). Os resultados de imunohistoquímica mostraram uma expressão reduzida de GSDMD (Figura 5D) e secreção sérica de IL-1 suprimida determinada por ELISA (Figura 5E). Coletivamente, os dados sugeriram que Ac-FLTD-CMK inibiupiroptoseem rins afetados por NL (lúpusnefrite).

FIGURA 5|Ac-FLTD-CMK, um inibidor derivado de GSDMD, preveniu o desenvolvimento de LN (nefrite lúpica).

(A) A razão albumina-creatinina na urina foi calculada em camundongos MRL/LPR que receberam ou não um inibidor de GSDMD.

(B) Creatinina sérica em camundongos MRL/LPR que receberam ou não um inibidor de GSDMD.

(C) Imagens representativas de espécimes renais coradas com ácido periódico de Schiff (PAS) e quantificação da porcentagem de glomeruloesclerose.

(D) Coloração imunoquímica de CD3, CD4, F4/80 e GSDMD. (E) Quantificação das concentrações séricas de IL-1b em camundongos MRL/LPR que receberam ou não um inibidor de GSDMD.

Os dados são mostrados como a média ± SEM. #p < {{0}},05,="" ##p=""><>

DISCUSSÃO

A terapia combinada é uma estratégia promissora devido à maior RC e taxas de resposta geral, menor tempo de remissão e menos efeitos colaterais. Até agora, os mecanismos moleculares subjacentes da terapia combinada não eram conhecidos. Recentemente, Fu et al.(6) trataram camundongos MRL/LPR com monoterapias ou terapia combinada e realizaram uma análise transcriptômica abrangente em rins inteiros. Curiosamente, eles descobriram que a terapia combinada, mas não as monoterapias, suprimiam especificamente e exclusivamente a expressão de caspase-1.

O inflamassoma NLRP3/ASC/caspase-1 é agora reconhecido como um dos principais contribuintes para a patogênese da LN (lúpusnefrite). Os inflamassomas NLRP3 em podócitos são ativados em camundongos propensos ao lúpus e também em pacientes com NL.lúpusnefrite). Quando os inflamassomas NLRP3 foram suprimidos com um inibidor de caspase-1, proteinúria, lesões histológicas renais e apagamento do processo podócito foram melhorados em camundongos propensos ao lúpus(8). Huang et ai. (27) relataram que NLRP3 foi expresso em células tubulares de LN (lúpusnefrite) classe IV e que a ativação do NLRP3 foi positivamente correlacionada com o escore do índice de atividade para pacientes com NL. A caspase-1 provou desempenhar um papel vital no lúpus e na disfunção vascular e, portanto, é um alvo potencial para novas intervenções terapêuticas(28). Drogas experimentais emergentes, como RIP3(29), antagonistas do receptor P2X7(30), inibidores de GSK-3 (31) e um agonista de Nrf2 (32) inibiram o desenvolvimento de LN (lúpusnefrite) em camundongos MRL/LPR modulando a atividade do inflamassoma NLRP3/ASC/caspase-1, o que destaca a importância e a criticidade do inflamassoma NLRP3/ASC/caspase-1 no LN. Concentrações séricas elevadas de IL-18 estão correlacionadas com a gravidade da doença e o grau de lesão/envolvimento renal em pacientes com LES(33). Até onde sabemos, parece que a família gasdermin pode ser essencial para o desenvolvimento depiroptose, mas há uma escassez de evidências para a presença de GSDMD/GSDME em pacientes com LES.

No geral, examinamos a ativação e expressão de GSDMD em amostras de biópsia renal retiradas de LN (lúpusnefrite) e camundongos MRL/LPR. O GSDMD foi fortemente induzido e clivado em podócitos glomerulares e células tubulares e células intersticiais infiltradas. Subsequentemente, camundongos MRL/LPR receberam uma combinação de MMF, tacrolimus e prednisona ou veículo. Comparado com o grupo de controle do veículo, a ativação de caspase-1 e GSDMD foi reduzida no grupo de tratamento combinado. O grau depiroptoseno sangue periférico também foi muito menor em LN (lúpusnefrite) pacientes após administração de terapia combinada. Além disso,piroptoseno sangue periférico correlacionou-se positivamente com o SLEDAI, o que sugeriu quepiroptoseno sangue periférico poderia atuar como um marcador significativo para a atividade do LES. Assim, levantamos a hipótese de que a terapia combinada pode conferir efeitos benéficos na NL (lúpusnefrite) ao inibirpiroptoseinduzida por caspase-1/GSDMD. Estudos prévios de estruturas cristalinas de caspase-1 em um complexo com Ac-FLTD-CMK revelaram muitas interações enzima-inibidor que impediram o reconhecimento de GSDMD por caspase-1. No entanto, descobrimos que Ac-FLTD-CMK, que atua como um inibidor derivado de GSDMD, inibiupiroptoseem LN (lúpusnefrite), que pode ser induzida por um mecanismo diferente.

Recentemente, em um modelo murino de LES induzido por TLR7-(34), camundongos GSDMD-/- desenvolveram um grau maior de dano renal e aumento da mortalidade, o que inicialmente sugeriu que a deleção de GSDMD teria um efeito protetor e estaria associada a inflamação sistêmica e produção de autoanticorpos com aumento da mortalidade associado. Camundongos deficientes em GSDMD desenvolvem uma deposição mais proeminente de um complexo imune glomerular em amostras de rim e proteinúria mais alta em comparação com camundongos do tipo selvagem. A secreção aumentada de HMGB1 extracelular também foi encontrada em GSDMD-/linfócitos sugerindo que necrose/piroptoseocorreu quando o GSDMD estava ausente.

Acionadores de caspase-1piroptosepela clivagem GSDMD. Em contraste, em células GSDMD-deficientes ou GSDMD-low, caspase-1 desencadeia apoptose e, em seguida, necrose secundária dependente de GSDME epiroptose. Quando a atividade do GSDMD está ausente após a terapia, o GSDME também pode mudar a apoptose mediada por caspase-3-parapiroptose(35,36). Além disso, a ativação de caspase-8 foi muito aumentada em macrófagos que eram deficientes em GSDMD. Ativação significativa de caspase-8 também foi encontrada em LN deficiente em GSDMD induzido por TLR7- (lúpusnefrite) camundongos(34). Assim, na ausência de GSDMD, é provável que a caspase-1 coopere com a caspase-8 para causar a apoptose mediada por caspase-3-GSDME para mudar parapiroptoseem LN (lúpusnefrite), uma hipótese que demanda mais investigação experimental.

Existem várias limitações no estudo atual. Primeiro, com base nos dados atuais, verificamos que a terapia combinada pode suprimirpiroptose, mas outros tratamentos, como terapia dupla de esteróides e MMF, esteróides e tacrolimus, ou anticorpo anti-CD20 também podem ter efeitos comparáveis. Em segundo lugar, o mecanismo molecular exato do efeito de inibição da terapia combinada na caspase-1 não foi bem explorado. Por último, mas não menos importante, observamos a relação de células duplamente positivas de caspase-1/PI no sangue periférico com LES-DAI e a mudança antes e após o tratamento de terapia combinada em um LN retrospectivo (lúpusnefrite) coorte de pacientes. O valor preditivo clínico das células duplamente positivas de caspase-1/PI para atividade de doenças e resposta ao tratamento precisa ser mais investigado em uma coorte prospectiva maior.

No geral, identificamos que a terapia combinada conferiu seus efeitos benéficos ao suprimir a caspase-1/induzida por GSDMDpiroptoseem LN (lúpusnefrite), que forneceu uma nova visão sobre os mecanismos celulares envolvidos. De fato, a terapia combinada suprimiu a expressão de caspase-1 específica e exclusivamente. A inibição farmacológica ou genética de NLRP3 e caspase-1 melhorou a função renal e suprimiu a autoimunidade em LN (lúpusnefrite). O papel fisiopatológico da caspase-1 em LN (lúpusnefrite) é digno de um estudo mais aprofundado, e terapias visando GSDMD em pacientes com LN (lúpusnefrite) precisam ser avaliados com muito cuidado.

Método de tratamento parapiroptose

REFERÊNCIAS

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