Efeito da Medicina Chinesa Cistanche no Desenvolvimento Embrio-Fetal Precoce

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Li Yufang 1, Xu Qinwei 2, Zhang Li 2, Zhang Wenchang 2, Feng Shutang 3*

[Abstrato]Usar porcoembriõesda fertilização in vitro para pesquisa e comparação. O efeito de adicionarchinêsmedicamentoingredientesCistanchee Astragalus para o desenvolvimento deembriões iniciaisno meio NCSU{{0}} foi provado. O experimento provou que: (1) A razão de volume de 0,10 por centoCistanchee 0.10 por cento de Astragalus foi adicionado ao caldo de cultura, e oCistanchegrupo de adição A taxa de blastocisto (15,76 por cento ) foi significativamente maior do que a do grupo em branco (9,26 por cento ) (P<0.05). the="" blastocyst="" rate="" of="" the="" astragalus-added="" group="" (10.09%)="" and="" the="" blank="" group="" (9.26%)="" were="" not="" significantly="" different="" (p="">0.05), indicando queCistanchedeserticolapode promover significativamenteembrionário inicialdesenvolvimento. (2) Quando a concentração (V/V) deCistancheé {{0}}.05 por cento e 0,10 por cento , a taxa de blastocisto (17,02 por cento e 16,75 por cento) é significativamente maior do que o grupo em branco (0) (P<0.01) and="" 0.15%="" group="" (8.94%)=""><0.05). (3)="" adding="" 0.10%="" traditional="">chinêsmedicamentoCistancheno meio de cultura no estágio de célula 2-, a taxa de desenvolvimento de blastocisto (13,81 por cento) foi significativamente maior do que no estágio de célula 4- (7,53 por cento) (P<0.05), and="" compared="" with="" the="" addition="" of="">Cistanchebefore cleavage (13.67%) ) Is slightly higher, but the difference is not obvious (P>0.05).

Devido às diferenças no ambiente de desenvolvimento in vivo e in vitro, oembriõesserá danificado por radicais livres durante a cultura in vitro de suínos precocesembriões, causando distúrbios do metabolismo celular ou danos ao DNA, RNA e proteínas [1]. A fim de melhorar ainda mais a taxa de desenvolvimento da fertilização in vitro por sêmen congelado, este experimento explorou a adição de uma certa concentração deCistanchee Astragalus para melhorar aembriãoambiente de desenvolvimento in vitro.

1. Material e métodos

1. 1 Condições de cultura:

A maturação in vitro de oócitos suínos, a fertilização in vitro e o cultivo in vitro de embriões iniciais foram realizados em uma incubadora com 5% de CO2 e umidade saturada máxima de 39 graus.

1.2 Reagentes e meio de cultura:

O líquido basal de maturação do oócito é NCSU{{0}}, o líquido de lavagem do oócito é líquido PVA-TL-HEPES, o líquido de fertilização é tampão Tris (mTBM) contendo 0,1 por cento BSA, e o líquido de lavagem de esperma é da Dubecco com 0,1 por cento BSA. Salina tamponada com fosfato (DPBS), fluido de descongelamento de esperma é BTS, fluido de cumulus é 1 mg/mL de hialuronidase PBS, fluido de operação de oócitos é NCSU tamponado com HEPES-23 e fluido de cultura básica de embriões iniciais é suplementado com 0 0,4 por cento BSA NCSU-23, adicione (V/V) 0,05 por cento ~ 0,15 por cento Cistanche conforme necessário, use BTS para descongelar o sêmen. Antes de usar, pré-aqueça e equilibre por mais de 4 h em uma incubadora contendo 5% de ar de CO2 e uma umidade saturada máxima de 39 graus [2].

1.3 O método de ebulição da medicina chinesa Cistanche:

Solução de Cistanche: Pegue 5 g e coloque em um béquer de 100 ml, adicione água ultrapura e mergulhe em água ultrapura, ferva em fogo alto, e mantenha fervendo por 20 minutos, depois colete a sopa; repita o processo acima, colete 3 vezes seguidas, volume constante para 100 mL, filtro de reposição de 0,22 μm. Solução de astrágalo: Pegue 5 g e coloque em um béquer de 100 ml, adicione água ultrapura e mergulhe, ferva em fogo alto, e mantenha fervendo por 20 minutos, em seguida colete a sopa medicinal; repita o processo acima, colete 3 vezes seguidas, ajuste o volume para 100 mL, filtre 0,22 μm sobressalente.

Medicina chinesaErvas:Cistanche

1.4 Maturação in vitro de oócitos de porco:

Os ovários das porcas foram coletados do Matadouro de Alimentos Pengcheng de Pequim, colocados em 0,9 por cento de solução salina normal contendo antibióticos a cerca de 38 graus, transportados de volta ao laboratório dentro de 4 horas e lavados com solução salina normal três vezes. Use uma seringa de 10 mL com uma agulha 12-calibre para extrair oócitos com folículos de 2-6 mm de diâmetro na superfície do ovário. Lave 3~4 vezes em solução TL-HEPES e 3~4 vezes em NCSU-23 que foi equilibrado em uma incubadora de dióxido de carbono por mais de 4 horas. Transfira 20 ~ 30 oócitos como um grupo para 100 μL, adicione 10% de PFF, 10 UI/mL HCG, 10 UI/mL PMSG, 10 ng/mL EGF NCSU-23 gotículas e cultura por cerca de 22 horas. gotículas de meio para NCSU-23 com 10 por cento de PFF, 10 ng/mL de EGF e continue a cultura por 44~46 h[3].

1.5 Capacitação espermática e fertilização in vitro:

Prepare a solução de mTBM sem cafeína e BSA e equilibre-a por 48 horas em uma incubadora com 5 por cento de CO2 e umidade saturada máxima de 39 graus, ajustando o valor do pH na faixa de 7,2~7,8; adicione cafeína e BSA 44 horas antes do uso e continue a equilibrar. O sêmen foi testado quanto à qualidade e 10 mL foi centrifugado a 900 r/min por 3 min, 10 mL de solução de DPBS contendo 0,1 por cento de BSA foi adicionado para suspensão e centrifugado a 900 r/min por 3 min [3]; depois que 1 mL de solução de TBM foi suspenso, foi inclinado a 60 graus O tratamento de coleta de energia a montante é realizado em uma incubadora com 5% de ar de CO2 e uma umidade saturada máxima de 39 graus por 1 h [3 ~ 5]. O complexo de células oócito-cúmulo que amadurece para 44~46 é colocado na solução de lavagem do oócito contendo 0,1 por cento de hialuronidase, e as células do cúmulo são removidas por pipetagem e, em seguida, os oócitos são expostos. Lave 3 vezes no TBM balanceado e, finalmente, coloque cada 10-15 pedaços em um grupo de 50 μL TBM e espere o esperma [6, 7]. Injetar 50 mL de sêmen a montante da capacitação em uma gota de oócitos contendo TBM e realizar a fertilização por 6 h em uma incubadora com 5 por cento de CO2 e uma umidade saturada máxima de 39 graus.

1.6 Desenvolvimento precoce e detecção de ovos fertilizados:

Após 6 horas de fertilização, os oócitos foram tratados com NCSU-23 tamponado com o fluido operacional HEPES ou NCSU- 23 com 0,4 por cento BSA no fluido de cultura de embriões. 23 Enxágue 3 vezes, troque o meio para uma gota balanceada de 0,4 por cento BSA NCSU-23 e incube por mais de 8 dias. Verifique a taxa de divisão de ovos fertilizados hipotéticos no 2º dia, verifique a taxa de mórula (mais taxa de blastocisto) no 6º dia e verifique a taxa de blastocisto no 8º dia [8]. Todos foram examinados e registrados sob o espelho corporal.

1.7 Desenho experimental:

1.7.1 O efeito dos ingredientes da medicina tradicional chinesa Cistanche no desenvolvimento inicial do embrião.

Porco Wuzhishan[8] Após a capacitação, a fertilização in vitro, a fertilização é concluída e, após a clivagem, os embriões são trocados até serem adicionados a 0,1 por cento (V/V). Cistanche, 0,1 por cento astrágalo e NCSU-23 (0,4 por cento BSA) sem ingredientes importantes (grupo em branco) foram cultivados para observar o desenvolvimento de ovos fertilizados e embriões iniciais , e julgar os efeitos dos dois componentes da medicina tradicional chinesa no início do desenvolvimento embrionário in vitro Influência.

1.7.2 O efeito da concentração de Cistanche no desenvolvimento inicial dos embriões.

O sêmen de porco Wuzhishan é capacitado e passa por fertilização in vitro. Após a conclusão da fertilização, o fluido é alterado para {{0}} por cento (grupo em branco), 0.05 por cento , 0,1 por cento e 0,1 por cento, respectivamente. Em 15% Cistanche NCSU-23 (0,4% BSA), observe o desenvolvimento de óvulos fertilizados e julgue a influência de diferentes concentrações do componente da medicina chinesa Cistanche no desenvolvimento inicial do embrião in vitro.

1.7.3 O efeito do período de adição de Cistanche no desenvolvimento inicial do embrião.

O sêmen de porco Wuzhishan é capacitado e passa por fertilização in vitro. Após o término da fertilização, o óvulo fertilizado se divide para o estágio de célula {{0}}e o óvulo fertilizado se divide para o estágio de célula 4-, o fluido é trocado e adicionado separadamente. 0.1% Cistanche NCSU-23 (0,4% BSA), observe o desenvolvimento de óvulos fertilizados e julgue o efeito da adição de cistanche no desenvolvimento inicial do embrião in vitro em diferentes estágios.

1.8 Análise estatística:

Use SPSS13.0 teste qui-quadrado (χ2) e análise de variância unidirecional.

Efeitos do extrato de cistancha

2. Resultado na análise

2. 1 A influência dos ingredientes da medicina tradicional chinesa no desenvolvimento embrionário inicial

As shown in Table 1, in the Cistanche and Astragalus group, the morula rate was not significantly different from that of the blank group (P>0.05). A taxa de blastocisto dos dois grupos foi maior que a do grupo branco, e a taxa de blastocisto do grupo Cistanche foi diferente da do grupo branco. Significativo (P<0.05). it="" is="" believed="" that="" cistanche="" has="" a="" better="" effect="" on="" promoting="" early="" embryonic="">

2.2 A influência da concentração do ingrediente da medicina chinesa Cistanche no desenvolvimento embrionário inicial

Conforme mostrado na Tabela 2, a adição de Cistanche em uma concentração de volume de 0.05 por cento a 0,10 por cento no fluido de cultura de embriões tem um melhor efeito de promoção em embriões de fertilização in vitro com líquido de esperma congelado WZSP , e a taxa de desenvolvimento de blastocistos é significativamente diferente daquela do grupo em branco (P<0.05); the="" blastocyst="" development="" rate="" of="" 0.15%="" cistanche="" deserticola="" was="" 0,="" which="" was="" significantly="" different="" from="" other="" groups=""><0.01). it="" means="" that="" if="" the="" concentration="" of="" cistanche="" is="" too="" high,="" it="" may="" cause="">

2.3 O efeito da adição de um período do ingrediente da medicina chinesa Cistanche no desenvolvimento embrionário inicial

As shown in Table 3, after testing and analysis, the addition of Cistanche at a volume concentration of 0.10% at the 2-cell stage has a better-promoting effect on the WZSP frozen sperm liquid in vitro fertilization-embryo, and there is no significant difference from the addition before the cleavage (P>0.05). No entanto, houve uma diferença significativa em comparação com a adição de 4 células (P<0.05); it="" indicated="" that="" the="" addition="" of="" cistanche="" at="" a="" volume="" concentration="" of="" 0.10%="" in="" the="" 2="" cell="" stage="" was="" most="" suitable="" for="" early="" embryo="">

3. Discussão

Comparado com o desenvolvimento normalembriõesin vivo, o ambiente de desenvolvimento da fertilização in vitroembriõesé significativamente diferente. Durante o processo deembriãocrescimento e divisão, uma grande quantidade de No., radicais livres e algumas substâncias tóxicas são produzidas, o que é desfavorável para o crescimento do embrião. Os embriões em desenvolvimento normal no corpo podem eliminar esses fatores desfavoráveis ​​através do metabolismo do ambiente interno; esses fatores desfavoráveis ​​sempre se acumularão no ambiente de crescimento do embrião da fertilização in vitro. O tradicionalchinêsmedicamentoingredienteCistanchepode ter a função de reduzir a ausência de concentração e eliminar certos radicais livres, a fim de melhorar ainda mais a taxa de desenvolvimento da fertilização in vitro por sêmen congelado. O experimento explorou a adição de uma certa concentração deCistanchee Astrágalo. Os resultados confirmaram que o Astragalus não teve efeito efetivo na melhoria do ambiente de cultivo in vitro. Uma concentração adequada deCistanchetem um certo efeito promotorembrião inicialdesenvolvimento, mas quando a concentração deCistancheexcede uma certa concentração, também tem um efeito inibitório sobreembriãodesenvolvimento.

Exploramos ainda mais os diferentes efeitos deCistanche, um tradicionalchinêsmedicamentocomponente, em vários estágios, e o experimento descobriu que oembriões iniciaistêm uma maior taxa de desenvolvimento na fase posterior, quandocistacheé adicionado no estágio de célula 2-. A possível razão é devido ao ambiente externo do receptor. O óxido nítrico (NO) é uma molécula sinal e fator citotóxico com uma ampla gama de atividades biológicas. O efeito do NO sobreembrião inicialdesenvolvimento deve ser rastreado até oembrionário inicialestágio de desenvolvimento, que pode ser causado por uma das causas de 2-bloqueio de células (2-bloqueio de células) na cultura de embriões de mamíferos, e o bloqueio in vitro de porcos ocorre no estágio de 4-células [ 9]. A adição do tradicionalchinêsmedicamentoingredientes podem eliminar o radical livre de NO até certo ponto e aliviar os fatores desfavoráveis ​​deembriãocrescimento [10].

Cistanche

Referências

[1] Comport M. Três modelos de infúria celular induzida por radicais livres[J]. Chem Biol Interact, 1989, 72(1/2):1- 56.

[2] Pan Dengke. Estudo sobre os fatores que afetam o desenvolvimento de células somáticas de porco clonadasembriões[D]. Pequim: Universidade Agrícola da China, 2005.

[3] Zhang Yunhai. Pesquisa sobre a produção de suínos clonadosembriõesusando tecnologia de transferência nuclear de células somáticas [D]. Pequim: Universidade Agrícola da China, 2005.

[4] Lu Shengsheng, Zhang Yanling, Shi Deshun, et al. Efeitos da adição de soro bovino e fluido folicular suíno durante a maturação na maturação nuclear de oócitos suínos eembrionário inicialdesenvolvimento após fertilização in vitro [J]. Heilongjiang Pecuária e Medicina Veterinária, 2002, (8):1- 3.