Glicosídeos totais de Cistanche Deserticola promovem a recuperação da função neurológica ao induzir a regeneração neurovascular via via Nrf- 2/Keap-1 em ratos MCAO/R-Ⅱ

TGs promovem remodelação neural em ratos feridos por I/R

De acordo com numerosos estudos, a neurogênese após um acidente vascular cerebral pode melhorar significativamente a recuperação funcional. Sinaptofisina (SYN), proteínas de densidade pós-sináptica 95 (PSD -95) e proteína 2 associada a microtúbulos (MAP -2) foram usadas como marcadores para examinar a plasticidade neuronal na penumbra isquêmica do córtex. Para avaliar os efeitos do tratamento com TGs, PSs e OSs na neurogênese em ratos lesionados por I/R, foram realizadas imunofluorescência e western blot para expressões SYN, PSD95 e MAP-2. Como mostrado nas Figuras 9 e 10, os níveis de expressão de SYN, PSD95 e MAP-2 em ratos I/R após 14 dias de reperfusão diminuíram em comparação com os ratos NOR, enquanto a cura de TGs e PSs poderia aumentar significativamente. regular seus níveis de expressão. O grupo OSs não teve alteração significativa em comparação com o grupo MOD. Os dados indicaram que a cura dos TGs e PSs foi capaz depromover remodelação neural após lesão de I/R. 

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TGs alteram Nrf-2 e mantêm-1 expressões em ratos feridos por I/R

O estresse oxidativo é o principal mecanismo patogênico na lesão de I/R. Os estudos verificaram que Nrf-2 é um regulador mestre das respostas antioxidantes. Para investigar as respostas oxidativas mediadas por Nrf-2 e Keap-1 após lesão de I/R avaliamos o citoplasma

expressão, bem como translocação nuclear de Keap-1. Enquanto isso, a expressão de Nrf-2 em tecidos cerebrais de ratos lesionados por I/R também foi avaliada (Figuras 10 e 11). De acordo com a análise de imunofluorescência, descobriu-se que Nrf-2 estava localizado principalmente no citoplasma no grupo NOR. No grupo TGs, a expressão de Nrf-2 na localização citoplasmática foi regulada negativamente, mas regulada positivamente no núcleo, e também foi observada uma expressão diminuída de Keap-1. Os dados mostraram que a proteção cerebral dos TGs poderia estar associada à modulação de Nrf-2 e Keap-1.

TGs atenuam o estresse oxidativo do tecido cerebral em ratos feridos por I/R

Para confirmar os efeitos antioxidantes dos TGs, as atividades de SOD, CAT, GSH-Px e MDA foram avaliadas em ratos lesionados por I/R. Na Figura 12, o conteúdo de MDA aumentou acentuadamente no grupo MOD e, ao mesmo tempo, as atividades de SOD, CAT e GSH-Px diminuíram, em comparação com os ratos normais. Por outro lado, o tratamento com TGs levou a uma diminuição significativa no conteúdo de MDA e a um aumento nas atividades de SOD, CAT e GSH-Px. Estes resultados confirmaram ainda mais a atividade antioxidante dos TGs.

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DISCUSSÃO

Muitos estudos sugerem que a MTC C. deserticola tem extensas atividades biológicas, por exemplo, melhorando a capacidade de aprendizagem, memória e imunidade. No entanto, os componentes activos da C. deserticola para a neuroprotecção permanecem obscuros. O presente trabalho visa rastrear os componentes ativos deC. deserticola contra acidente vascular cerebral isquêmicono modelo MCAO/R. Três extratos de C. deserticola (TGs, PSs e OSs) foram utilizados para avaliar seus efeitos em ratos MCAO/R, bem como possíveis mecanismos.

O acidente vascular cerebral é uma doença cerebrovascular aguda comum. Estudos epidemiológicos mostram que o AVC é mais comum em homens do que em mulheres. Assim, em nosso experimento, foram adotados ratos machos para os testes. Nossos resultados provaram que a indução de I/R acelerou o estresse oxidativo e o volume do infarto, rompendo a BHE e levando a lesões nervosas e cerebrovasculares. Após a triagem, descobriu-se que os TG diminuem o volume do infarto e promovem remodelação neural e angiogênese. Além disso, observou-se que os TGs mantinham a integridade da BHE após lesão de I/R. Pelo contrário, os PS e os OS não trazem nenhum alívio significativo ao prejuízo de I/R. Assim, os TGs são considerados a principal fração ativa de C. deserticola para neuroproteção, potencialmente através da promoção de remodelação neural, angiogênese e integridade da BBB por meio da ativação da via Nrf- 2/Keap-1.

Evidências crescentes indicam que o estabelecimento de circulação colateral eficaz é significativamente importante para evitar a formação de infarto e penumbra isquêmica, e é um tratamento crítico na fase inicial do acidente vascular cerebral isquêmico. A proliferação de células endoteliais vasculares e de células musculares lisas após o infarto isquêmico determina o estabelecimento de circulação colateral. No entanto, os modelos de isquemia têm um fenômeno comum – isto é, o estresse oxidativo existe amplamente na microvasculatura cerebral. Os dados do estudo demonstraram que um grande número de antioxidantes pode perturbar a função da BBB e as propriedades da angiogênese. CD31 e a-SMA são os marcadores das células endoteliais vasculares e também das células musculares lisas, respectivamente. Para investigar o efeito da proliferação celular acima mencionada dos extratos de C. deserticola, examinamos as expressões de CD31 e a-SMA no homogenato de penumbra isquêmica cerebral. Nossos dados mostraram que os TGs melhoraram notavelmente as expressões de CD31 e a-SMA. No entanto, não houve diferenças significativas entre os grupos PSs e OSs. Portanto, deduzimos que os TGs podem reduzir os danos cerebrais, promovendo a angiogênese através do aumento das expressões de CD31 e a-SMA, enquanto os PSs e os OSs não forneceram tal proteção contra danos cerebrais. Estes resultados confirmaram ainda que apenas os TGs poderiam prevenir lesões cerebrais de I/R.

O AVC isquêmico pode ser considerado o resultado de isquemia cerebral causada por comprometimento da plasticidade neuronal ou remodelamento de áreas cerebrais. A maioria dos pacientes com AVC sofre déficits neurológicos. A ativação da neurogênese é uma estratégia promissora para pacientes com AVC melhorarem suas funções neurológicas. A neurogênese participa diretamente na recuperação da função neurológica após lesão de I/R cerebral. Pesquisas anteriores mostram que os TGs podem melhorar a taxa de sobrevivência das células piramidais do hipocampo e induzir a neurogênese. O estresse oxidativo causa a perda de neurônios durante muitas doenças, como Parkinson, acidente vascular cerebral e assim por diante. Nrf-2 transcreve muitos genes relacionados à neuroproteção em sua região promotora, incluindo principalmente SOD, MDA, CAT e g-glutamil cisteína ligases, etc. SYN, PSD-95 e MAP{{ 4}} proteínas, que estão intimamente associadas à formação sináptica e à neurotransmissão, podem ser consideradas marcadores de pesquisa de plasticidade neuronal na região da penumbra isquêmica. Após estudar, descobrimos que a cura com TGs poderia aumentar significativamente as expressões de PSD95, SYN e MAP-2, indicando que a proteção cerebral dos TGs estava correlacionada com o aumento da plasticidade neuronal durante a I/R. No entanto, é uma pena que não haja diferença óbvia entre grupos de PSs e sistemas operacionais. Estes resultados indicaram que os TGs poderiam aumentar a neuroplasticidade após lesão cerebral de I/R.

Pesquisas de imagem em pacientes com AVC mostraram que a disfunção da BHE pode ser considerada um atributo marcante do cérebro peri-isquêmico (Bang et al., 2007). Os TJs, que são compostos de proteínas citoplasmáticas, proteínas transmembrana e moléculas de adesão de junção entre células endoteliais capilares, são muito importantes na manutenção da integridade da BBB (Ye et al., 2019). Entre elas, ZO-1, claudina-5 e ocludina são as proteínas mais importantes em TJs. Evidências crescentes indicam que o aumento da permeabilidade da BBB induzida por isquemia geralmente se correlaciona com as alterações de ZO-1, claudina-5 e ocludina (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu e outros, 2017; Neste trabalho, os resultados demonstraram que, embora os TGs pudessem aumentar significativamente as expressões das proteínas ZO-1, claudina-5 e ocludina em tecidos cerebrais induzidos por MCAO, nem PSs nem OSs o fizeram. A BBB consiste em células endoteliais cerebrais e está intimamente associada aos pericitos (Nyul-Toth et al., 2016). Os pericitos são vitais para a integridade da BBB (Bell et al., 2010). O AVC isquêmico desencadeia a morte dos pericitos e o descolamento das células endoteliais cerebrais na fase aguda, desestabilizando assim a microvasculatura e alterando as propriedades da BBB (Zechariah et al., 2013). Nossos dados mostraram que os TGs poderiam aumentar a cobertura de pericitos nos capilares e aumentar os níveis de expressão de ZO-1, claudina-5 e ocludina. Esses fenômenos provaram que os TGs poderiam proteger efetivamente a integridade da BHE após lesão cerebral de I/R. Em resumo, os TGs podem atenuar a lesão cerebral de várias maneiras, como promover a angiogênese, melhorar a plasticidade neuronal e manter a integridade da BHE.

Em seguida, investigamos a via de sinalização para explorar o mecanismo subjacente à proteção cerebral dos TGs. O processo de lesão de I/R é multifatorial e, portanto, numerosos mecanismos estão envolvidos na patogênese. O estresse oxidativo é um fator de risco fundamental que contribui para lesões cerebrais induzidas por I/R, como danos à estrutura da BHE, disfunção endotelial vascular e agravamento de lesão neuronal isquêmica. Assim, o estresse oxidativo tornou-se um alvo terapêutico atraente na lesão cerebral induzida por I/R. As enzimas da fase 2, que são mediadas pelo fator nuclear E2-fator relacionado-2 (Nrf-2), têm sido consideradas um meio importante pelo qual os neurônios se protegem contra o estresse oxidativo. Evidências crescentes indicam que a ativação de Nrf-2 durante a I/R é um alvo terapêutico potencial para neuroproteção. Nrf-2, como um importante regulador da defesa antioxidante endógena, medeia o nível de heme oxigenase 1 (HO-1) e outras enzimas antioxidantes, como NAD(P)H quinona oxidoredutase 1 (NQO1), SOD, CAT, GSH e MDA. Além disso, o Nrf-2 desempenha um importante papel regulador na angiogênese. O presente estudo mostra que o Nrf-2 pode ser significativamente aprimorado e ativado no processo de desenvolvimento vascular.

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Como descrito anteriormente, os TGs contêm muitos compostos bioativos, por exemplo, equinacosídeo, tubulosídeo A, acteosídeo, isoacteosídeo e 2'-acetilacteosídeo, e alguns deles mostraram funções neuroprotetoras após lesão de I/R cerebral. O equinacosídeo possui diversos efeitos farmacológicos, como antioxidante, anti-senescência, neuroproteção, antiinflamatório, promoção de cicatrização, hepatoproteção, promoção de formação óssea e atividades antitumorais. Recentemente, o equinacosídeo foi identificado como um potente antioxidante no sistema nervoso central. O equinacosídeo pode reduzir o conteúdo de MDA e melhorar as atividades de SOD e GSH-Px na lesão cerebral por isquemia, e a análise de acoplamento molecular mostrou que o equinacosídeo pode se ligar ao Keap-1, levando à translocação nuclear Nrf-2. O estudo de Xia mostrou que o acteosídeo poderia diminuir o volume do infarto e o conteúdo de água cerebral para melhorar os déficits neurológicos em ratos MCAO/R, mitigando o estresse oxidativo. Outros estudos demonstraram que o isoacteosídeo pode aumentar as atividades de enzimas antioxidantes celulares, SOD e CAT em células V79-4 tratadas com H2O2-. Com base nos relatórios acima sobre os compostos ativos contidos nos TGs, é possível deduzir que os TGs poderiamproteger contra acidente vascular cerebral isquêmico através das vias de antioxidante.

Li relatou os efeitos neuroprotetores dos glicosídeos feniletanóides (PhGs) na apoptose induzida por H2O 2- em células PC12 através da via Nrf2/ARE (Li et al., 2018). Esses PhGs foram significativamente suprimidos ao desencadear a translocação nuclear Nrf2 e aumentar as expressões de HO-1, NQO1, subunidade catalítica de glutamato cisteína ligase (GCLC) e subunidade modificadora de glutamato-cisteína ligase (GCLM) (Li et al., 2018 ;Gong et al., 2019). Portanto, essas descobertas sugerem que a via Nrf-2/ARE desempenha um papel crucial nos efeitos protetores mediados por PhGs nas células neuronais. Da mesma forma, neste estudo, descobrimos que os TGs poderiam diminuir o nível de MDA e aumentar os níveis de SOD, CAT e GSH-Px nos ratos I/R. Enquanto isso, os TGs poderiam regular positivamente a expressão de Nrf2 no ​​núcleo, regular negativamente a expressão correspondente no citoplasma e diminuir significativamente a expressão de Keap-1. Portanto, a via Nrf-2/Keap-1 pode estar envolvida nos efeitos neuroprotetores mediados por TGs. Validação adicional desta via será realizada em cultura de células in vitro com modelos de lesão de privação de oxigênio-glicose/reoxigenação no futuro. Além disso, extratos de C. deserticola foram administrados em nosso estudo por 14 dias continuamente. Uma vez que a neurogênese adulta afetaria a interpretação dos efeitos neuroprotetores durante 14 dias de reperfusão, a neurogênese não pode ser excluída do nosso atual desenho experimental na exploração do efeito neuroprotetor das CTs. Esta é a limitação da nossa pesquisa.

Concluindo, são os TG de C. deserticola que podemmelhorar a angiogênese e a neurogênesebem como manter a integridade da BBB em ratos com lesão I/R, mas não nos PSs e OSs. Os efeitos podem ser mediados pela ativação da via Nrf-2/Keap-1.

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