Tiorredoxina 1 (Trx1) está associada a mau prognóstico no carcinoma de células renais de células claras (ccRCC): um exemplo para o papel crucial da sinalização redox no CcRCC

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Abstrato

PropósitoAs tioredoxinas são as principais proteínas reguladoras da sinalização oxidativa. Trx1 é o mais proeminentetioredoxinae, portanto, o presente estudo buscou avaliar o papel prognóstico do Trx1 no ccRCC.

Métodose pacientes Um estudo de microarray de tecido (TMA) foi realizado para avaliar a associação de Trx1 com características clínico-patológicas e desfechos de sobrevida. Dados doCâncerGenome Atlas (TCGA) foram avaliados quanto à associação de características do gene Trx1 com características clínico-patológicas e desfechos de sobrevida.

ResultadosNa TMA, os pacientes com ccRCC que apresentavam níveis elevados de Trx1 apresentavam estágios T mais baixos (p<0.001), less="" often="" distant="" metastases(p="0.018),lower" nuclear=""><0.001),and less="" often="" tumor="" necrosis="" (p="0.037)or" sarcomatoid="" features="" (p="0.008).Patients" with="" a="" combined="" score="" of="" ≥10="" had="" better="" dss="" than="" patients="" with="" a="" low="" combined="" score=""><10 (hr="" 95%="" ci="" 0.62(0.39-0.98)).="" interestingly,="" the="" survival="" outcome="" is="" compartment-specific:="" ccrcc="" patients="" whose="" tumors="" had="" exclusively="" trx1="" expression="" in="" the="" cytoplasm="" had="" the="" worst="" survival="" outcome(hr="" 3.1;95%="" ci="" 1.2-8.0).="" genomic="" data="" from="" the="" tcga="" demonstrated="" that="" patients="" with="" ccrccs="" that="" had="" trx1="" losses="" had="" more="" advanced="" clinicopathological="" features="" and="" worse="" survival="" outcomes="" in="" disease-specific=""><0.001), overall(p="0.001)," and="" progression-free="" survival="" (p="0.001)when" compared="" to="" patients="" with="" ccrccs="" without="" copy="" number="" variations(cnv)="" or="">

ConclusãoO estudo atual sugere um possível papel do Trx1 na biologia tumoral do ccRCC e, portanto, o estudo atual aconselha fortemente investigações aprofundadas das vias de sinalização redox no ccRCC.

Palavras-chaveTiorredoxina.Sinalização oxidativa. Espécies que reagem ao oxigênio. Câncer de rim. Terapias direcionadas

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Introdução

O estresse oxidativo tem sido associado à carcinogênese por muitas décadas. Um desequilíbrio de pró-oxidantes e antioxidantes tem sido atribuído ao dano do ácido desoxirribonucleico (DNA) e falha em processos celulares essenciais, incluindo desregulações metabólicas, lesões na membrana celular e falha na transcrição de DNA e tradução de mRNA [1]. otioredoxinaA família foi anteriormente considerada um importante regulador do equilíbrio oxidativo nas células. As tiorredoxinas são altamente conservadas em quase todas as espécies celulares. Eles compreendem três grupos de proteínas: as tiorredoxinas (Trxs), glutarredoxinas (Grxs) e peroxirredoxinas (Prxs) (revisado em [1]).

Um corpo esmagador de literatura científica forneceu evidências de que as tiorredoxinas não são guardiãs de um equilíbrio oxidativo, mas melhor caracterizadas como reguladores da sinalização oxidativa (revisado em [1,2]). transdutores e efetores de funções celulares [3]. Processos biológicos como ativação e estabilização de compartimentos de proteínas não podem ser explicados sem consideração das características eletrostáticas[4]. substrato especifica de tiorredoxinas e provavelmente outras proteínas [4].

Trx1 está envolvido em muitos processos biológicos que têm um papel fundamental na tumorigênese de células clarasrenalCarcinoma celular (ccRCC). Por exemplo, o Trx1 citosólico pode ser secretado e atuar como uma quimiocina que pode atrair e ativar células imunes [1]. Além disso, Trx1 pode induzir a expressão de interleucina(IL)IL-1, IL-2, IL-8, e dependente da dose a expressão de IL-6[1]. Particularmente, IL-6é uma importante proteína reguladora da tumorigênese em ccRCC [5]. Além disso, a visão macroscópica dos tumores ccRCC geralmente demonstra um quadro misto de áreas gordurosas, necróticas e hemorrágicas, o que destaca que processos biológicos como vias metabólicas hiperativas e neovascularização são componentes-chave para o desenvolvimento e progressão de ccRCCs. Vários estudos mostraram que os membros datioredoxinasão componentes regulatórios chave do metabolismo celular e também da neovascularização []. Por exemplo, os níveis séricos de Trx1 foram correlacionados com a suscetibilidade ao diabetes e com a tolerância à glicose. Além disso, Trx1 é capaz de induzir a expressão do fator endotelial vascular (VEGF)[1]. A inibição do VEGF com inibidores de tirosina quinase (TKIs) é uma das estratégias terapêuticas mais importantes no tratamento médico de ccRCCs metastáticos [6].

Finalmente, foi demonstrado que o fator induzível por hipóxia-2 (HIF-2) é um importante progressor tumoral no ccRCC [7]. Trx1 regula os níveis de HIF-2 através de um elemento responsivo ao ferro in vitro [8]. Foi demonstrado que a depleção de Trx1 resulta em um aumento dos níveis de mRNA de HIF-2. Os autores sugeriram que o acúmulo de HIF{10}} requer suprimento suficiente de ferro ou a falta do sistema redutor Trx1. Atualmente, os ensaios clínicos de fase II investigam a inibição do HIF{12}} como um dos futuros alvos promissores na terapia com mRCC. Trx1 e otioredoxinaA família pode, portanto, estar envolvida na progressão do ccRCC por meio de um mecanismo dependente de HIF-2 -.

Coletivamente, existem evidências plausíveis de que Trx1 pode induzir processos fisiopatológicos que orientam a progressão do tumor no ccRCC. Por outro lado, também a perda de Trx1 pode ser capaz de induzir o acúmulo de HIF-2. Níveis baixos ou aumentados de Trx1 podem afetar o contexto, dependendo da progressão do tumor no ccRCC. Portanto, o presente estudo investigou a associação dos níveis de proteína Trx1 em uma análise de TMA e levantou-se a hipótese de que níveis baixos ou altos de Trx1 poderiam estar associados a características clínico-patológicas e resultados de sobrevida de pacientes com CCRcc.

Métodos e pacientes

Características do paciente e do tumor

Duas coortes de pacientes foram analisadas. A primeira coorte incluiu pacientes que foram tratados cirurgicamente no Departamento de Urologia do Hospital Universitário de Tübingen/Alemanha e foram analisados ​​em um estudo de microarray de tecido (TMA) (Tabela 1 complementar). Todos os pacientes incluídos tinham estágios T avaliados patologicamente. A linfadenectomia foi feita quando linfonodos suspeitos eram visíveis na ressonância magnética ou tomografia computadorizada pré-operatória. Portanto, o estágio T foi avaliado clínica e patologicamente. O estágio M foi avaliado clinicamente com ressonância magnética e tomografia computadorizada. Todos os pacientes com Ml foram metástases sincronicamente, e a nefrectomia foi realizada com intenção citorredutora nesses pacientes. A segunda coorte incluiu pacientes do TheCâncerProjeto Genome Atlas (TCGA)(fornecimento. Tabela 1).

Análises de microarray de tecido (TMA)

Trx1 é conhecido por estar tanto no núcleo quanto no citoplasma. Em ambos os compartimentos, Trx1 está envolvido em processos de regulação redox e de ferro (revisto em [1]). A coloração foi avaliada por um patologista geniturinário experiente (SR). A intensidade foi contada em uma escala 0-3 (0=negativa,1=fracamente positiva,2=moderadamente positiva, 3=fortemente positiva) e porcentagem de células alvo (intervalo O-100 por cento positivo) coloração em cada intensidade. Para melhor representar os níveis gerais de proteína, combinamos as medidas de frequência e intensidade em uma medida de intensidade integrada usando a seguinte fórmula: ((% de coloração na intensidade 3*3) mais ( porcentagem de coloração na intensidade 2*2) mais ( porcentagem de coloração na intensidade 1*1))/100 conforme descrito anteriormente [10].

Os dados da proteína Trx1 foram correlacionados com a sobrevida específica da doença (DSS), características clinicopatológicas e expressão de proteínas marcadoras de vias que são relevantes para a biologia do CCR. A mediana de seguimento foi de 90,4 meses (Tabela Complementar 1). A estatística descritiva incluiu variáveis ​​contínuas que são apresentadas como média±desvio padrão (DP) ou intervalos interquartis (IQR), enquanto os dados categóricos são apresentados como números absolutos e frequências correspondentes. As variáveis ​​categóricas foram comparadas com o teste qui-quadrado ou exato de Fisher, conforme apropriado. O teste t de Student corrigido com o teste de Levan para equivalência ou o teste U de Mann-Whitney foi usado para comparação das variáveis ​​contínuas. Os valores de corte foram calculados com análises de árvore de partição recursiva usando a função rpart de R. As funções de sobrevivência foram estimadas com o método de Kaplan-Meier e as associações com os tempos de sobrevivência foram avaliadas com análises de regressão de Cox de risco proporcional (PH) uni e multivariável. Todos os testes estatísticos foram bilaterais e a significância estatística foi definida asp<0.05. all="" data="" were="" analyzed="" with="" the="" statistical="" package="" for="" social="" sciences="" software,="" version="" 24.0="" (spss="" inc.,="" chicago,="" il)="" and="" r="" version="" rx64="" 3.5.0(www-project.="" org),="" including="" additional="" packages="" coin,="" survival,="" and="">

Análise de alterações genéticas no TCGA As associações entre variáveis ​​clínico-patológicas e variações no número de cópias (CNV) ou mutações somáticas foram investigadas usando o teste exato de Fisher, teste de tendência de Cochran-Armitage ou teste U de Mann-Whitney, conforme apropriado. A regressão de Cox PH uni e multivariável foi aplicada para análises de associação entre CNV ou mutações somáticas e sobrevida global (OS), sobrevida específica da doença (DSS) e intervalo livre de progressão (PFD). Os dados de sobrevivência foram obtidos de Liu et al. [12]. Splines cúbicas restritas foram usadas para modelar a relação entre os níveis de RNA de Trx1 e os desfechos de sobrevivência OS, DSS e PFI (Figura S4).

Resultados

Resultados da análise de microarray de tecido.

A corrente analisada na coorte TMA foi composta por 248 pacientes (171 homens e 77 mulheres) com idade mediana de 65 anos (IQR 56.0-71.4) e tempo de seguimento mediano de 88,5 meses (QR 2 0.3-152.0 meses). Setenta e dois pacientes morreram, por causa de ccRCC no momento da análise. As características do paciente e do tumor de toda a coorte de TMA são mostradas na Tabela Complementar 1 e as características da coorte de TCGA são demonstradas na Tabela Complementar 2. Houve uma tendência de que qualquer expressão de Trx1 vs. nenhuma expressão de Trx1 estivesse associada a pior resultado de sobrevida HR: 2,0295 porcentagem CI 0.81-5.02;p=0.129. A comparação das associações de diferentes compartimentos com DSS é demonstrada na Fig.1. Tumores de pacientes que tiveram uma expressão exclusiva de Trx1 no citoplasma tiveram o pior desfecho de sobrevida (HR, intervalo de confiança de 95 por cento (CI):3,13(1.21-8,04)), Tabela 1). Qualquer expressão de Trx1 foi considerada nos diferentes compartimentos celulares nesta análise.

Next, the combined frequencies and intensities were investigated to better account for the protein levels as described above. For this purpose, we calculated a cutoff value of≥10 using recursive partitioning. Patients with a combined score of>10 tiveram DSS melhor do que pacientes com baixo escore combinado de<10(hr,95% ci0.62(0.39-0.98).="" in="" line="" with="" this="" result,="" tumors="" of="" patients="" with="" a="" high="" combined="" score="" demonstrated="" more="" often="" less="" advanced="" tumor="" features(table2).in="" multivariable="" analysis,="" high="" combined="" cytoplasmic="" trx1="" expression="" lost="" its="" significance="" for="" its="" association="" with="" survival="" outcome="" when="" adjusted="" for="" the="" prognostic="" groups="" of="" the="" ssign(stage,="" size,="" grade,="" and="" necrosis)score.="" the="" multivariable="" analysis="" is="" demonstrated="" in="" table="" lb="" for="" trx1="" continuous="" expression.="" the="" investigation="" for="" categorized="" trx1="" showed="" similarly="" non-significant="">

Resultados da análise TCGA

A investigação da CNV do gene Trx1 nos dados do TCGA revelou que as variações diplóides e do genoma ganho no gene Trx1 foram significativamente associadas a estádios tumorais menos avançados e características clínico-patológicas, enquanto as perdas foram observadas com mais frequência em estádios tumorais mais elevados e foram associadas a estádios tumorais avançados. características clinicopatológicas (Fig. 2A). Consequentemente, as perdas foram associadas a intervalos pobres em geral, específicos da doença e livres de progressão (Fig.2B).

Em seguida, os níveis de expressão gênica foram analisados ​​nos dados de RNA seq. Não houve associação significativa dos níveis de mRNA de Trx1 com características clínico-patológicas (Fig.3A) e também não houve associação contínua de níveis de mRNA com desfecho de sobrevida (Fig.3B). Mutações somáticas de Trx1 estavam presentes apenas em dois pacientes.

Discussão

O presente estudo teve como objetivo explorar o possível papel do membro mais proeminente da família das tiorredoxinas, Trx1, na biologia tumoral de ccRCC. a quantidade de níveis de proteína Trx1 foi correlacionada com características clínico-patológicas: níveis mais baixos de proteína Trx1 foram associados a características clínico-patológicas avançadas. Além disso, houve uma correlação de CNV (perdas) com estágios tumorais avançados, enquanto não houve correlação clara para os níveis de mRNA de Trx1 com características clinicopatológicas ou resultados de sobrevida.

A sinalização redox é um processo biológico específico do compartimento. Algumas das tiorredoxinas são proteínas específicas do compartimento e outras são capazes de se deslocar entre os compartimentos celulares [1]. O presente estudo mostra que a expressão de Trx1 no citoplasma está associada a mau prognóstico em ccRCC, mas por outro lado, níveis mais elevados de Trx1 foram associados a características clínico-patológicas menos avançadas. Essa descoberta ressalta os relatórios publicados anteriormente de alguns dos membros do nosso grupo. Berndt et al. mostraram que Trx1 suprime a tradução de HIF-2 e HIF-2 é um importante progressor tumoral em ccRCC[7,8]. Isso pode ser mais pronunciado se o HIF-2 estiver localizado no citoplasma[13]. Esses dados pré-clínicos foram ressaltados em ensaios clínicos que investigaram agentes de pequenas moléculas que inibem o HIF-2 em pacientes com ccRCC metastático[14]. Os primeiros dados de estudos clínicos de fase I e II demonstraram que esses agentes são ativos em pacientes com CCRcc[15]. Trx1 na expressão HIF-2. ccRCCs têm biologia tumoral específica. Em condições fisiológicas com suprimento de oxigênio suficiente, o HIF-2 é constantemente degradado por meio de um processo orquestrado pela proteína von Hippel Lindau (pVHL). No entanto, em cerca de 90 por cento dos ccRCC, o pVHL é inativado e, portanto, o HIF-2 é superexpresso mesmo sob condições normóxicas[16]. A regulação redox particular via Trx1 em células com pVHL inativa ou ausente ainda não foi determinada. Essas investigações devem levar em consideração as diferenças específicas do compartimento, particularmente.

As investigações de aspectos genéticos nos dados do TCGA demonstraram que há uma clara correlação entre CNV, características clínico-patológicas avançadas e desfechos de sobrevida ruins de pacientes com CCRcc. Esperávamos que as perdas no número de cópias pudessem estar ligadas à menor expressão de RNA e que a menor expressão de RNA estivesse ligada a características e prognósticos tumorais desfavoráveis. No entanto, nossa análise dos dados de RNASeq do TCGA não foi capaz de demonstrar uma associação dos níveis de RNA com características clínico-patológicas de mau prognóstico. De fato, análises de splines cúbicos demonstraram que aqueles pacientes com ccRCCs com expressão de RNA média do gene Trx1 tiveram o pior resultado de sobrevida. Embora as CNVs sejam conhecidas há muito tempo e o significado prognóstico das CNVs tenha sido demonstrado em vários estudos em ccRCC, a relevância biológica ainda não está bem caracterizada[17,18]. Nossa descoberta ressalta que CNVs e expressão de RNA não estão necessariamente ligados e, portanto, a base biológica para a associação de perdas genômicas de CNV de Trx1 e características clínico-patológicas avançadas precisa ser objeto de futuras investigações adicionais.

Os achados atuais têm várias limitações que precisam ser consideradas na interpretação desses resultados. Este é um estudo retrospectivo. A composição do estudo poderia ter sido mais equilibrada em termos de estágios TNM. Além disso, o acompanhamento poderia ter sido mais longo.

Alguns de nossos achados parecem ser contraditórios, por exemplo, níveis mais altos de Trx1 no citoplasma estão associados a piores resultados de sobrevida, enquanto níveis mais altos de Trx1 estão associados a características clínico-patológicas menos avançadas. A sinalização redox é um processo que é específico do compartimento e do contexto, como outros processos biológicos, por exemplo, o papel supressor de tumor de p53 ou a regulação transcricional de NFkB. Interpretamos nossos resultados atuais de acordo com esse conhecimento biológico. Esses resultados contraditórios prima vista deixam espaço para investigações adicionais, particularmente o papel regulador do Trx1 no HIF-2 é um alvo atraente em relação aos atuais ensaios clínicos de fase II que investigam o HIF-2uma inibição como um efeito terapêutico conceito em ccRCC e outros tipos de câncer. Nosso grupo tem um grande interesse neste campo e investigações adicionais estão em andamento.

Em resumo, o estudo atual sugere que Trx1 tem um papel na biologia tumoral de ccRCC. Possíveis explicações para um papel importante da sinalização redox do ccRCC são a regulação da resposta imune, as regulações da via metabólica e a regulação da expressão de HIF-2. Assim, o estudo atual aconselha fortemente investigações intensificadas de vias de sinalização redox em ccRCC.

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