O papel dos testes genéticos no fluxo de trabalho diagnóstico de pacientes pediátricos com doenças renais: a experiência de uma única instituição

AbstratoPropósitoAs doenças renais hereditárias estão entre as principais causas de insuficiência renal em crianças, resultando em aumento da mortalidade, elevados custos de saúde e necessidade de transplante de órgãos. As tecnologias de sequenciamento de próxima geração podem ajudar no diagnóstico de condições monogênicas raras, permitindo um manejo médico e escolhas terapêuticas otimizados.

Métodos O sequenciamento clínico do exoma (CES) foi realizado em uma coorte de 191 pacientes pediátricos de uma única instituição, seguido pelo sequenciamento Sanger para confirmar variantes identificadas e para estudos de segregação familiar. Resultados Todos os pacientes tinham diagnóstico clínico de doença renal: as principais categorias de doenças foram doenças glomerulares (32,5%), ciliopatias (20,4%), CAKUT (17,8%), nefrolitíase (11,5%) e doença tubular (10,5%). 7,3% dos pacientes apresentavam outras condições. Um teste genético conclusivo, baseado na validação CES e Sanger, foi obtido em 37,1% dos pacientes. A maior taxa de detecção foi obtida para ciliopatias (74,4%), seguida por nefrolitíase (45,5%) e doenças tubulares (45%), enquanto a maioria das doenças glomerulares e CAKUT permaneceram sem diagnóstico. Conclusões Os resultados indicam que os testes genéticos utilizados de forma consistente no fluxo de trabalho diagnóstico de crianças com doença renal crónica podem (i) confirmar o diagnóstico clínico, (ii) fornecer um diagnóstico precoce no caso de doenças hereditárias, (iii) e a causa genética de doenças anteriormente não reconhecidas. doenças e (iv) adaptar programas de transplante.

Palavras-chave Sequenciamento clínico de exoma, Sequenciamento de próxima geração,Doenças renais, Testes genéticos, Coorte pediátrica

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Introdução

As nefropatias pediátricas compreendem entidades de doenças amplamente diferentes em termos de apresentação clínica, evolução e opções terapêuticas [1–4]. Aproximadamente 30% das crianças com doença renal crônica (DRC) sofrem de uma condição monogênica, uma porcentagem que aumenta quando se consideram crianças com doença renal em estágio terminal (DRT) [5, 6]. Muitas dessas crianças permanecem sem diagnóstico no momento do transplante [4, 6, 7]. Chegar a um diagnóstico para esses pacientes não implica apenas o fim de uma odisseia diagnóstica, mas apresenta diversas vantagens para o prognóstico, manejo e tratamento

Estudos pioneiros demonstraram consistentemente que a implementação de técnicas de sequenciamento de próxima geração (NGS) melhorou significativamente o rendimento diagnóstico em pacientes com doenças renais hereditárias (IKD) [8]. Mais recentemente, o uso generalizado de NGS tornou o diagnóstico genético disponível num tempo razoável e a custos acessíveis, levantando a questão de se e quando deve ser integrado no fluxo de trabalho de diagnóstico de rotina [5].

O diagnóstico genético em crianças é de extrema importância em diversos aspectos. A primeira é que pode ser relevante na abordagem clínica da doença, sendo o exemplo típico o das síndromes nefróticas, onde a identificação de variantes estruturais em genes relacionados com podócitos argumenta contra terapias imunossupressoras que de outra forma seriam utilizadas rotineiramente durante um período de vários anos. meses [9]. A segunda é que pode ser de grande relevância para a família da criança e para a identificação de outros membros portadores da variante possivelmente transmissível às gerações futuras. Uma vez identificada uma variante patogênica em um probando, os testes em cascata de membros da família e o aconselhamento genético em portadores de variantes representam uma prática padrão em genética clínica [5]. A terceira é que conhecer a variante patogênica é essencial no contexto do transplante onde o doador pode ser um parente. Na verdade, é fundamental excluir a presença da(s) mesma(s) variante(s) no doador de órgãos, bem como é fundamental identificar todos os membros da família potencialmente necessitados de um transplante. A quarta é que algumas doenças apresentam alto risco de recidiva após o transplante de órgãos, como a glomeruloesclerose segmentar e focal [10], ou seu desfecho pode ser melhorado por uma escolha mais personalizada do transplante a ser realizado, como no caso de doença primária. hiperoxalúria, onde um transplante combinado de rim e fígado pode resultar em um melhor resultado [11]. Finalmente, ter um diagnóstico claro da doença pode ser útil para o paciente participar em ensaios clínicos e beneficiar de novas opções de tratamento [12, 13].

No final de 2018, numa colaboração entre nefrologistas pediátricos e geneticistas, começámos a realizar testes genéticos para condições monogénicas que potencialmente conduzem à DRT e, consequentemente, ao transplante. Nosso hospital é o maior do noroeste da Itália, atendendo uma área de cerca de 5 milhões de pessoas. Selecionamos uma análise do tipo "tamanho único", com o sequenciamento do exoma clínico, ou seja, aproximadamente 6.700 genes que estão associados a condições monogênicas, focando a análise em painéis genéticos adaptados à suspeita clínica e, portanto, limitando achados incidentais e reduzindo o tempo para análise de sequência.

Globalmente, ao aplicar este pipeline, obtivemos um rendimento diagnóstico em linha com os dados publicados, com alguma heterogeneidade entre as diferentes suspeitas clínicas, como esperado. Os resultados obtidos confirmam a relevância da inclusão de testes genéticos de rotina e aconselhamento no fluxo de trabalho diagnóstico de pacientes pediátricos afetados por nefropatias. Na verdade, a identificação de variantes causais é crítica para o seu manejo clínico e, potencialmente, para a seleção ideal de doadores vivos.

Materiais e métodos

Recrutamento de pacientes

O estudo foi baseado em uma coorte diagnóstica de 191 pacientes pediátricos consecutivos (idade de recrutamento < 18 anos), recrutados pelas Unidades de Nefrologia Pediátrica, Diálise e Transplantes do Hospital Infantil Regina Margherita e encaminhados ao Serviço de Imunogenética e Biologia de Transplantes para análise genética. Todos os pacientes incluídos no estudo forneceram consentimento informado por escrito assinado por ambos os pais, sempre que possível.

Preparação de amostras, sequenciamento e análises de bioinformática

Extração de ácido nucleico do sangue periférico, análise da qualidade do DNA, preparação da biblioteca e sequenciamento foram realizadas conforme relatado anteriormente [14]. Os dados brutos obtidos do sequenciamento foram convertidos em arquivos FASTQ e então alinhados com as ferramentas Enrichment 3.1.0 ou DRAGEN Enrichment (Illumina) e mapeados no manifesto TruSight One Expanded v2.0 usando o genoma do Homo Sapiens UCSC GRCh37 como uma referência para obter variantes de nucleotídeo único, variantes de número de cópias (CNV) e variantes estruturais de arquivos. Para identificação do número de cópias, foi utilizada uma linha de base composta por dados de sequenciamento de 5 pacientes diferentes, todos negativos para CNV (conforme dados comparativos de hibridização genômica do array). Esta abordagem permite a detecção de CNV mesmo em cromossomos sexuais, uma vez que o grupo de referência foi composto por indivíduos do sexo feminino e masculino e o sexo do sujeito a ser analisado foi sempre especificado durante a fase de alinhamento. A chamada e priorização de variantes foram feitas seguindo critérios definidos. O alinhamento de leituras e a cobertura de exons do gene de interesse foram verificados e exibidos pelo Integrative Genomics Viewer IGV, disponível gratuitamente na UC San Diego — Universidade da Califórnia e no Broad Institute of MIT e Harvard University — Boston (https://software.broadinstitute. org/software/igv/). As variantes a serem incluídas no relatório genético final foram classificadas de acordo com os critérios do American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG).

Geração de lista de doenças genéticas in silico

Os genes a serem considerados para identificação e priorização de variantes foram definidos com base nas suspeitas clínicas. Listas de genes in silico foram geradas combinando (i) dados de diferentes bancos de dados, correlacionando genótipo a fenótipo (OMIM, PanelApp England, ClinGen, Malacards), e (ii) dados da literatura. As listas de genes disponíveis são atualizadas uma vez por ano com base em novas evidências de associação gene-doença.

Sequenciamento Sanger e amplificação por sonda dependente de ligação multiplex (MLPA)

O sequenciamento de Sanger e/ou análises de MLPA foram realizados para validar variantes identificadas por NGS e para estudos de segregação familiar. Resumidamente, o DNA foi extraído a partir de uma segunda alíquota independente do sangue periférico do probando e dos pais. As regiões de interesse do DNA foram amplificadas por PCR utilizando condições experimentais específicas. A pureza e especificidade das regiões amplificadas foram verificadas por gel de agarose 00,8 ou 1,5%. Os produtos de PCR amplificados foram então sequenciados por Sanger usando os mesmos iniciadores. Para variantes de PKD1, a validação foi realizada utilizando PCR de longo alcance seguida de nested PCR para evitar qualquer inferência a partir dos pseudogenes.

Resultados

Definição de critérios para retorno de resultados de análises genéticas

We previously reported on the design and set-up of a "kidney" gene panel that comprises>400 genes, todos envolvidos em diferentes formas de doenças renais [14]. Para este estudo, implementamos análises com subpainéis focados na categoria clínica específica de suspeita (por exemplo, CAKUT, glomerulopatia, tubulopatia, etc.) e priorizamos um grupo específico de genes para análise. Esta abordagem limitou o número de genes analisados, simplificando as análises e reduzindo o número de achados incidentais. Somente quando, no final do campo analítico com painel(es) relevante(s), o resultado genético era negativo e (i) o fenótipo clínico não estava claramente indicado ou (ii) se sobrepunham a diferentes categorias de doenças, a análise genética era estendida aos chamados "lista completa de rins ou rimoma", um superpainel que compreende todos os genes incluídos nos subpainéis.

Como primeiro passo, definimos um conjunto de critérios para a interpretação dos resultados da NGS. Depois de realizar o sequenciamento clínico do exoma (CES) e o alinhamento dos dados, um pipeline de análise foi determinado para filtrar as variantes relevantes. Especificamente, com base na suspeita clínica, as variantes identificadas foram filtradas com base em listas de genes in silico, específicas para as diferentes macrocategorias da doença. Variantes sinônimas que não impactam o mecanismo de splicing ou variantes intrônicas que não mapeiam dentro da região de splicing foram excluídas, levando em consideração apenas as variantes não-sinônimas, sem sentido, frameshift e que afetam o splicing. Dez, apenas variantes raras (frequência inferior a 1% na população) e variantes com frequência alélica no paciente de pelo menos 0.2 e cobertura de pelo menos 20 leituras foram incluídas. As variantes restantes foram anotadas e selecionadas com base em (i) modo de herança, (ii) conservação de nucleotídeos, (iii) impacto proteico, explorando diferentes bancos de dados para verificar as pontuações e (iv) literatura, se houver. Neste ponto, as variantes filtradas foram listadas em um chamado “relatório técnico”. O laudo técnico foi interpretado por um médico geneticista para produzir o laudo genético final para o paciente e sua família. Durante a consulta genética, foram propostos estudos de segregação familiar para (i) confirmar as variantes no probando e (ii) incluir/excluir variantes não causativas com base na sua segregação na família (Fig. 1).

Ao adotar esses critérios, conseguimos definir três categorias diferentes de relatórios genéticos. Primeiro, um “relatório conclusivo” que incluía variantes patogênicas (C5) e provavelmente patogênicas (C4). Relatos de variantes de significado desconhecido (C3) foram considerados conclusivos apenas se totalmente compatíveis com o quadro clínico e se os estudos de segregação familiar confirmassem seu possível papel. Em segundo lugar, um “relatório incerto” que incluía variantes C3 identificadas pelo CES que ainda não foram ou não puderam ser validadas no contexto de estudos de segregação familiar ou variantes C4/C5 que não estavam totalmente alinhadas com o fenótipo clínico. Terceiro, um “relatório inconclusivo” que incluía (i) uma análise CES negativa, o que significa que nenhuma variante foi identificada pela NGS; (ii) variantes únicas em genes recessivos; e (iii) variantes C3 não condizentes com o fenótipo clínico, identificadas quando a análise foi estendida a todosgenes relacionados à doença renal(Figura 1).

Principais características da coorte recrutada

Este estudo descreve uma coorte de 191 pacientes pediátricos (0–18 anos de idade) que foram encaminhados consecutivamente pela Unidade de Nefrologia Pediátrica para análise genética de novembro de 2018 a maio de 2022, com uma média de 50 novos pacientes inscritos a cada ano . Os critérios para testes genéticos foram (i) nefropatia associada a um histórico familiar positivo de doença renal ou (ii) suspeita clínica de uma condição monogênica ou (iii) necessidade de descartar uma condição monogênica (como no caso de síndromes nefróticas, onde distinguir doenças monogênicas versus não monogênicas é clinicamente significativa para prognóstico e tratamento).

A coorte foi dividida com base na suspeita clínica, considerando 6 diferentes macrocategorias de doenças: anomalias congênitas do rim e do trato urinário (CAKUT; n=34), ciliopatias (n=39), glomerulopatias (n=62), nefrolitíase (n=22), tauopatias (n=20) e outras doenças que incluíam também fenótipos sindrômicos (n=14). Com exceção do CAKUT e das tubulopatias que apresentaram distribuição igualitária entre mulheres e homens, em todas as outras categorias houve prevalência de indivíduos do sexo masculino (fig. 2a). Ao analisar a idade de recrutamento, não se destacou distribuição significativamente diferente entre os diferentes grupos, com média de idade variando de 6,7 a 10 anos em “Outras doenças” e glomerulopatias, respectivamente. Porém, ao observar a mediana de idade, as doenças CAKUT apresentaram o valor mais baixo (4,6 anos), condizente com um fenótipo congênito. Do ponto de vista étnico, independentemente da macrocategoria da doença considerada, a maioria dos pacientes eram europeus, seguidos pelos africanos, sendo apenas alguns pacientes asiáticos, latino-americanos ou mestiços (fig. 2b). Entre a coorte, apenas 8 pacientes tinham pais consanguíneos.

Figura 1 Pipeline de análise de dados genéticos e critérios para inclusão de variantes. Representação esquemática do pipeline analítico adotado para identificação e priorização de variantes, incluindo todos os critérios de filtragem e exclusão. As variantes resultantes foram incluídas no relatório genético final. Sempre que possível, foram realizados estudos de validação de variante(s) e segregação familiar. Os relatórios genéticos foram classificados como conclusivos, incertos ou inconclusivos com base nos critérios indicados. Com base nesta classificação, foi calculada a taxa de diagnóstico do nosso fluxo de trabalho de sequenciamento de próxima geração (NGS). 1 KG: banco de dados de 1000 genomas; Alt fr: frequência alterada; C3: variante de significado desconhecido; C4: provável variante patogênica; C5: variante patogênica; AR: autossômico recessivo

Por fim, ao levar em conta a história familiar para doenças renais considerando indivíduos do sexo masculino e feminino separadamente, ficou evidente a heterogeneidade na distribuição entre casos positivos e negativos considerando as diferentes categorias da doença. No geral, a maior parte da coorte recrutada e independentemente do sexo não foi caracterizada por uma história familiar positiva, como mostrado para CAKUT, glomerulopatias, tauopatias e outras doenças renais. No entanto, nas ciliopatias e na nefrolitíase, uma proporção significativa de casos apresentou um histórico familiar positivo com uma distribuição diferente entre mulheres e homens (13 casos em 22 para ciliopatias e 5 em 12 para nefrolitíase; Fig. 2c).

Do ponto de vista clínico, a coorte foi bastante heterogênea, com diferentes doenças primárias incluídas (Fig. 2d). Dentre eles, as suspeitas clínicas mais recorrentes foram doença renal policística (n=27), CAKUT (n=25), síndrome nefrótica (n=19), glomeruloesclerose segmentar e focal (GESF; n =14) e síndrome de Alport (n=13; Fig. 2d).

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