O leitor RNA M6 A YTHDF2 controla o antitumoral e a imunidade antiviral de células NK, parte 2

YTHDF2 é necessário para a função antiviral das células NK

Para determinar se a deficiência de Ythdf2 afeta a atividade antiviral das células NK, injetamos 2, 5 × 104 PFU de MCMV em camundongos Ythdf2WT e camundongos Ythdf2ΔNK.

Os resultados mostraram que os camundongos Ythdf2ΔNK eram mais suscetíveis à infecção por MCMV, conforme demonstrado pela perda significativa de peso e aumento dos títulos virais no sangue, baço e fígado em comparação com camundongos Ythdf2WT (Fig. 3, A e B; e Fig. S2, A e B) .

Também observamos uma redução significativa na porcentagem e no número absoluto de células NK totais no baço e no sangue de camundongos Ythdf2ΔNK em comparação com aqueles em camundongos Ythdf2WT após a infecção (Fig. 3, C e D; e Fig. S2, C e D). Análises adicionais mostraram que as células NK de camundongos Ythdf2ΔNK apresentaram expressão significativamente menor de Ki67 do que camundongos Ythdf2WT (Fig. 3, E – G).

No entanto, a viabilidade das células NK foi semelhante entre camundongos Ythdf2WT e camundongos Ythdf2ΔNK, como mostrado pela coloração com anexina V (Fig. S2 E). Estes dados indicam que a deficiência de YTHDF2 nas células NK resulta num defeito na proliferação celular em vez da sobrevivência celular durante a infecção viral. As células NK inibem a infecção por MCMV através dos receptores de ativação Ly49H e Ly49D, e o processo é caracterizado por uma resposta antiviral mediada por perforina ou IFN (Arase et al., 2002; Lee et al., 2009; Loh et al., 2005; Orr et al., 2010; Sumaria et al., 2009).

Descobrimos que os camundongos Ythdf2ΔNK reduziram significativamente as células NK Ly49H + e Ly49D + no baço e no sangue em comparação com os camundongos Ythdf2WT após a infecção (Fig. 3, H – J; e Fig. S2, F – K).

Análises adicionais demonstraram que, embora por porcentagem, apenas as células Ly49D+Ly49H+ mostrassem uma diferença em camundongos Ythdf2ΔNK em comparação com camundongos Ythdf2WT, o número absoluto de células de células NK Ly49D-Ly49H+, células Ly49D+Ly49H− NK e células NK Ly49D+Ly49H+ no baço e sangue diminuíram significativamente em camundongos Ythdf2ΔNK em comparação com camundongos Ythdf2WT após infecção (Fig. S2, L – W).

Nossos dados sugerem que o controle da infecção por MCMV por YTHDF2 parece ser mediado principalmente por células NK Ly49D+Ly49H+. A produção de granzima B e IFN pelas células NK em camundongos Ythdf2ΔNK foi comparável à dos camundongos Ythdf2WT (Fig. S2, X e Y).

Descobrimos uma produção significativamente reduzida de perforina por camundongos Ythdf2ΔNK em comparação com a de camundongos Ythdf2WT no baço e no sangue 7 dias após a infecção (Fig. 3, K-M), indicando que o YTHDF2 afeta principalmente a atividade antiviral mediada por perforina contra MCMV em células NK. sugerem que o YTHDF2 é crítico para a expansão das células NK e função efetora durante a infecção pelo MCMV.

YTHDF2 controla a homeostase das células NK e a maturação terminal em estado estacionário

As descobertas acima de que a deficiência de Ythdf2 nas células NK aumentaram as metástases tumorais e prejudicaram a capacidade das células NK para controlar a infecção por MCMV nos encorajaram a investigar se o YTHDF2 é necessário para a manutenção das células NK em um estado estacionário.

Como mostrado na Figura 4 A, a frequência e o número absoluto de células NK foram significativamente reduzidos no sangue periférico, baço, fígado e pulmão, mas não na medula óssea (BM) de camundongos Ythdf2ΔNK em comparação com camundongos Ythdf2WT.

No entanto, não houve alterações significativas entre o progenitor linfóide comum, o progenitor de células pré-NK e o progenitor de células NK refinado (NKP) no BM (Fathman et al., 2011) entre camundongos Ythdf2WT e Ythdf2ΔNK (Fig. S3 A), indicando que YTHDF2 pode não afetar o desenvolvimento inicial das células NK em nosso modelo.

Para explorar os mecanismos potenciais responsáveis ​​pela diminuição de células NK em camundongos Ythdf2ΔNK, investigamos a proliferação celular, a viabilidade e a capacidade de tráfego de células NK após a deleção de Ythdf2 em um estado estacionário. A percentagem de células NK em proliferação foi comparável entre ratinhos Ythdf2WT e Ythdf2ΔNK, como evidenciado pela coloração Ki67 (Fig. S3 B).

A viabilidade das células NK também foi equivalente entre os camundongos Ythdf2WT e Ythdf2ΔNK, como mostrado pela coloração com anexina V (Fig. S3 C). Para verificar se o YTHDF2 afeta a saída de células NK do BM para a periferia, camundongos Ythdf2WT e Ythdf2ΔNK foram injetados iv com um anticorpo antiCD45 para marcar células imunes e sacrificados após 2 min, e suas células BM foram analisadas.

Isso nos permitiu quantificar o número de células NK nas regiões sinusoidal versus parenquimatosa do BM, um indicador do tráfego de células NK do BM para o sangue periférico em estado estacionário (Leong et al., 2015). Os resultados mostraram uma redução significativa na frequência de células NK CD45+ em camundongos Ythdf2ΔNK em comparação com camundongos Ythdf2WT nos sinusóides (Fig. 4 B), indicando que a deficiência de Ythdf2 prejudica a saída de células NK do BM para o sistema circulatório in vivo .

As células imunológicas sofrem proliferação homeostática durante a linfopenia induzida por certas infecções virais ou causada pela quimioterapia (Sun et al., 2011). Embora tenhamos descoberto que o YTHDF2 é dispensável para a proliferação de células NK em estado estacionário, observamos uma diminuição significativa na proliferação celular durante a infecção por MCMV (Fig. 3, EG). Portanto, investigamos o papel do YTHDF2 na regulação da proliferação homeostática de células NK em um ambiente linfopênico in vivo.

Nós cotransferimos um número igual de células NK esplênicas de camundongos CD45.2 Ythdf2ΔNK ou camundongos congênicos CD45.1 para camundongos Rag2 -/- Il2rg -/- deficientes em linfócitos. Os resultados mostraram que uma proporção maior de células NK foi derivada de camundongos controle CD45.1WT do que de camundongos CD45.2 Ythdf2ΔNK no dia 3 após a transferência celular (Fig. S3 D).

Análises adicionais demonstraram que a redução de células NK de camundongos Ythdf2ΔNK foi devida à proliferação celular prejudicada (Fig. S3 E), mas não à apoptose celular (Fig. S3 F), sugerindo que YTHDF2 impulsiona a proliferação homeostática de células NK in vivo sob condições linfopênicas.

A diferenciação adicional de células NK murinas pode ser classificada em estágios imaturos (CD11b-CD 27+), maduros intermediários (CD11b + CD 27+) e maduros terminais (CD11b + CD27-) com base nos níveis de CD11b e CD27 ( Chiossone et al., 2009; Geiger e Sun, 2016).

Descobrimos que a expressão de Ythdf2 aumentou com a maturação e que CD11b−CD27+, CD11b+CD27+, CD11b+CD27− exibiram níveis de expressão mais baixos, intermediários e mais altos de Ythdf2, respectivamente (Fig. S3 G), indicando que o YTHDF2 pode estar envolvido na maturação das células NK. Portanto, investigamos o papel do YTHDF2 na maturação das células NK definida pelos marcadores de superfície celular CD11b e CD27.

Descobrimos que a perda de Ythdf2 em células NK resultou em uma diminuição significativa na frequência de células NK maduras terminais e/ou em um aumento de células NK maduras imaturas e intermediárias no baço, fígado, pulmão e sangue, mas não na medula óssea (Fig. 4 C e Fig. S3 H), indicando que YTHDF2 regula positivamente a maturação de células NK terminais. Consistente com esses dados, os níveis de KLRG1, que é um marcador de maturação de células NK terminais, foram significativamente mais baixos em camundongos Ythdf2ΔNK no baço, fígado e pulmão, mas não BM em comparação com a dos camundongos Ythdf2WT nos órgãos ou compartimentos de tecido correspondentes (Fig. 4 D).

Para determinar se o número reduzido de células NK maduras pela deficiência de Ythdf2 é intrínseco à célula, criamos quimeras em camundongos Rag2-/-Il2rg-/- injetando células BM de camundongos CD45.1 WT e CD45.2 Ythdf2ΔNK, misturados na proporção de 1:1. razão. Como mostrado pela citometria de fluxo 8 semanas após o transplante, uma proporção reduzida de células NK maduras terminais foi derivada de células BM CD45.2 Ythdf2ΔNK do que aquelas de células de controle CD45.1 WT (Fig. 4 E), sugerindo que a maturação terminal de células NK controlada por YTHDF2 é intrínseco à célula.

Os fatores de transcrição T-box Eomes e Tbet são críticos para a maturação das células NK (Daussy et al., 2014; Gordon et al., 2012). A coloração intracelular revelou uma redução significativa nos níveis de proteína de Eomes em células NK de camundongos Ythdf2ΔNK em comparação com camundongos Ythdf2WT (Fig. S3 I). Além disso, descobrimos que a redução dos níveis de proteína e mRNA de Eomes ocorreu especificamente em células NK maduras terminais (CD11b + CD27-) (Fig. S3, J – L).

No entanto, em contraste com Eomes, a expressão de Tbet foi equivalente em células NK entre camundongos Ythdf2ΔNK e Ythdf2WT (Fig. S3, I e K), indicando que YTHDF2 possivelmente regula a maturação terminal de células NK visando Eomes.