A relação entre ciclo-oxigenase (COX-2) e doença induzida por hipóxia

para mais informações:ali.ma@wecistanche.com

A prostaglandina E2 intracelular contribui para a morte celular tubular proximal induzida por hipóxia

Coral Garcia-Pastorl, Selma Benito-Martinez, Ricardo J.Bosch1, Ana B. Fernandez-Martinez, Francisco J. Lucio-Cazana

As células tubulares proximais (PTC) são particularmente vulneráveis ​​à apoptose induzida por hipóxia, um fator relevante paradoenca renal. Nós hipotetizamos aqui que a morte de PTC sob hipóxia é mediada pela produção dependente de ciclo-oxigenase (COX-2) de prostaglandina E,(PGE,), que foi confirmada em células HK tubulares proximais humanas-2 porque a hipóxia (1 por cento de apoptose induzida por O,) (i) foi prevenida por uma COX-2(ciclo-oxigenase) e por antagonistas de receptores de prostaglandina (EP) e (ii) foi associado a um aumento de PGE intracelular, (iPGE,) devido ao fator induzível de hipóxia -1 -regulação transcricional dependente de COX{{3 }}(ciclo-oxigenase). A apoptose também foi prevenida por inibidores do transportador de captação de prostaglandina PGT, o que indicou que a iPGE contribui para a apoptose induzida por hipóxia (ao contrário, a morte de PTC induzida por hipóxia/reoxigenação foi exclusivamente devido à PGE extracelular). Assim, iPGE é um novo ator na patogênese da lesão tubular induzida por hipóxia e PGT pode ser um novo alvo terapêutico para a prevenção de lesões dependentes de hipóxia em doenças renais.

Está bem estabelecido que a hipóxia tubular é um fator relevante tanto para doenças agudas como crônicas.doenca renal'2 As células tubulares proximais (CPT) são altamente ativas em termos de consumo de oxigênio devido às suas atividades de reabsorção que demandam energia e, consequentemente, são vulneráveis ​​à hipóxia. Tem sido demonstrado que a apoptose desempenha um papel relevante em PTC cultivados expostos à hipóxia, mas as vias de sinalização responsáveis ​​pela ativação da maquinaria apoptótica não foram investigadas. Nós e outros descobrimos que a prostaglandina E (PGE), um importante mediador lipídico de numerosos processos fisiológicos e patológicos norim, desempenha um papel relevante na sinalização que leva à apoptose do PTC no tratamento com cisplatina7, albumina8ou leptina e gentamicina. Em todos os casos, verificou-se que o aumento da PGE depende do aumento da expressão da ciclo-oxigenase-2(COX-2)(ciclo-oxigenase), uma enzima induzível que, juntamente com COX-1l, é a etapa limitante da velocidade na síntese de prostaglandinas. No humanorim, COX basal-2(ciclo-oxigenase)expressão é menos intensa que a de COX-1. COX-2(ciclo-oxigenase)foi identificada em podócitos e partes da alça de Henle e vasculatura renal em condições fisiológicas10. Em estados patológicos, entretanto, a imunorreatividade COX-2 pode ser encontrada em muitos outros tipos de células dentro dorimincluindo PTC, e possivelmente contribui para lesão renal. Curiosamente, a hipóxia aumenta a expressão de COX-2(ciclo-oxigenase)e/ou a produção de PGE,12-i7 em muitos tipos de células. De fato, descobrimos anteriormente que a hipóxia aumenta o conteúdo intracelular em PGE, bem como sua liberação para o meio extracelular8. Portanto, é teoricamente possível que a PGE media o efeito apoptótico da hipóxia no PTC.

A maioria dos estudos sobre apoptose dependente de PGE tem sido essencialmente focada em mecanismos envolvendo PGE extracelular, porque é amplamente aceito que a PGE exerce seus efeitos biológicos através da ativação de receptores de PGE acoplados à proteína G transmembrana plasmática (receptores de prostaglandina da série E PE1-4)1. No entanto, em alguns modelos, a PGE intracelular (iPGE) é relevante na morte celular apoptótica720-22. Isso implica que, para induzir a apoptose, a PGE precisa atingir o meio intracelular novamente e ativar um subconjunto de receptores EP, que estão localizados dentro da célula (receptores iEP). Como a tarefa de capturar PGE é feita principalmente pelo transportador de captação de prostaglandina (PGT)23-26, a inibição de PGT resulta na prevenção da morte celular apoptótica mediada por iPGE7.

Levando em conta esse histórico, no presente trabalho, estudamos se um COX-2(ciclo-oxigenase)-dependente do aumento de iPGE, os níveis mediam a apoptose induzida por hipóxia em PTC.

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Métodos

Reagentes.

AG1478, Bromocresolgreen (BG), PGE, AH6809, GW627368X, cristal violeta, soluções de azul de tripano, Bromossulfoftaleína (BRS), 3-(5'-Hidroximetil2'-furil)-1-benzil indazol (YC1), e actinomicina D foram adquiridos da Sigma (St. Louis, MO, EUA). Z-VAD-FMK e celecoxib eram da Calbiochem (Darmstadt, Alemanha) e Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, EUA), respectivamente. O TriReagent foi adquirido da Vitro (Madri, Espanha) e as membranas de PVDF e o reagente luminol de Western blotting foram adquiridos da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA. EUA). Reagente antidesvanecimento ProLong Gold com 4,6-diamidino{{14 }}fenil indol (DAPI), anexina-V-FITC (isotiocianato de fluoresceína)/kit de detecção de apoptose de iodeto de propídio (PI) e sonda de diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína (DCFH-DA) foram adquiridos da Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA) e Sondas Moleculares (Oregon, EUA), respectivamente. Os anticorpos foram obtidos das seguintes fontes: anti-PGE e anti-COX-2(ciclo-oxigenase)os anticorpos eram da Abcam (Cambridge, UK); anti-Bax e anti-Bcl-2 eram da Santa Cruz Technologies (Santa Cruz, CA.USA); anticorpo anti-HIF-la e -rabbit-Alexa-Fluor 488 foram da BD Biosciences (Palo Alto, CA, EUA) e Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA), respectivamente; conjugado anti- -actina e anti-rato de coelho IgG peroxidase foi adquirido da Sigma (St.Louis, MO, EUA).

Cultura celular e condições experimentais.

As células HK tubulares proximais humanas -2 foram adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, EUA). As células foram mantidas em 5 por cento de CO, a 37 graus Cin DMEM/F12 suplementado com 10 por cento de feto bovino soro (FBS), 1 por cento de penicilina/estreptomicina/anfotericina B e 1 por cento de glutamina (Invitrogen. Carlsbad, CA, EUA) e 1 por cento de insulina-transferrina-selênio (ThermoFisher. Grand Island, NY, EUA). Em todos os experimentos, as células foram plaqueados em 70-90 por cento de confluência e, quando completamente ligados, foram cultivados sob condições hipóxicas (1 por cento de oxigênio) ou normóxicas (21 por cento de oxigênio).Hipóxiaexperimentos foram realizados em um In vivo200hipóxiaestação de trabalho (Ruskin Technology, West Yorkshire, Reino Unido). Porhipóxia/experimentos de reoxigenação, as células foram submetidas ahipóxiapor 24 h e, posteriormente, as células foram incubadas em condições normóxicas por até 3 h (período de reoxigenação).

Análise de imunofluorescência de iPGE e análise de Western blot de COX-2(ciclo-oxigenase)e HIF-1 .

As células para análise de imunofluorescência e análise de Western blot foram, respectivamente, divididas em lamelas de vidro (4×104 células/lamela de vidro) ou em placas de seis poços (15×104 células/poço) e incubadas conforme descrito em "Resultados". Em seguida, as análises de imunofluorescência e immunoblotting foram realizadas essencialmente conforme descrito anteriormente. As diluições de trabalho de anticorpos foram: 1/50 para PGE,, 1/1000 para COX{10}}(ciclo-oxigenase)/HIF-1a/a-rabbit-Alexa-Fluor 568 e 1/5000 para -actina. A detecção de imunofluorescência foi realizada usando um microscópio confocal Leica SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha), através do Confocal Microscopy Service (ICTS 'NANBIOSIS'U17) do Biomedical Research Networking Center on Bioengineering, Biomaterials, and Nanomedicine (CIBER-BBN na Universidade de Alcal, Madrid, Espanha)

Transfecção transitória.

Transfecção transitória com siRNA PGT (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), o vetor de expressão de mamífero pcDNA3 contendo o cDNA da 15-hidroxi-prostaglandina desidrogenase humana de tipo selvagem (p15-PGDH) ou o construtos de plasmídeo repórter de luciferase para COX humana-2(ciclo-oxigenase)phPES2-Luc, humanohipóxiaelemento de resposta (HRE)p9HIF1-Luc e R. reniformis pRL-CMV(Promega, Madison, WI) e a determinação da atividade de luciferase foram realizadas conforme descrito em outro lugar27,28.

Contagem de células e morfologia de células/núcleos.

O número de células aderentes foi determinado espectrofotometricamente com um método de coloração violeta de cristal modificado2. Para detectar evidências de apoptose, a morfologia celular foi observada usando microscopia de contraste de fase. Os núcleos celulares foram visualizados após a coloração de DNA com DAPI conforme descrito anteriormente0. A morfologia apoptótica típica que foi examinada incluiu encolhimento celular, condensação e fragmentação nuclear e formação de corpos apoptóticos. Para quantificação, seis campos foram examinados em cada condição experimental de forma cega para estimar a porcentagem de núcleos com aparência de apoptose.

Ensaio de apoptose por citometria de fluxo e ensaio de viabilidade celular pelo teste de exclusão do corante azul de tripano.

As células aderentes à placa foram destacadas por tripsinização e, juntamente com as células destacadas previamente recuperadas do meio de cultura, foram utilizadas para o ensaio.

O kit de detecção de apoptose anexina-V-FITC/PI permitiu a detecção por citometria de fluxo de células HK-2 apoptóticas e necróticas, conforme descrito anteriormente 7. As células apoptóticas precoces e tardias foram positivas, respectivamente, para coloração de anexina V e ambas e anexina V coloração. As células necróticas foram apenas positivas para PI e as células vivas HK-2 não apresentaram coloração.

O teste de exclusão do corante azul de tripano foi usado para avaliar a viabilidade celular. Células viáveis ​​(brancas) e células mortas (azul) foram contadas usando um microscópio de luz e um hemocitômetro.

Análise estatística.

Cada experimento foi repetido pelo menos três vezes. Os resultados são expressos como média±SEM. Eles foram submetidos a uma análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida do teste de Bonferroni para comparações múltiplas. O nível de significância foi definido em P Menor ou igual a 0.05.

Resultados

A hipóxia induz a morte da célula HK tubular proximal-2.

Hipóxiareduziu o número de células HK-2, conforme avaliado pelo ensaio de cristal violeta (Fig. la), e também induziu o arredondamento e descolamento das células da placa (Fig. lb, painel superior). Como esperado,hipóxiadesencadeou um modelo de morte celular com características morfológicas claras de apoptose (veja coloração nuclear com DAPI na Fig. lb, painel inferior, à esquerda), como encolhimento celular com condensação nuclear significativa, fragmentação e formação de corpos semelhantes a apoptose.Hipóxiaa apoptose induzida foi ainda confirmada pelo aumento da coloração de anexina V-FITC, avaliada por citometria de fluxo, e sua prevenção com inibidor de pan-caspase Z-VAD-FMK (Fig. lc).Hipóxiatambém determinou uma diminuição no número de células viáveis, mas não induziu alterações estatisticamente significativas no número de células necróticas (Fig. lc, inserir).

Figura 1. A hipóxia induz a morte celular tubular proximal HK-2.(a) Contagem de células diminuída (ensaio de violeta de cristal). (b) Características morfológicas da apoptose. Fotomicrografias de contraste de fase representativas (painel superior, ampliação original, 10×) Fotomicrografias de coloração DAPI (painel inferior, ampliação original, 40×). (c) Aumento da apoptose (estudos de citometria de fluxo). As células de anexina V mais compreendem células de anexina V mais /iodeto de propídio (isto é, células apoptóticas precoces com integridade da membrana plasmática preservada) e células anexina V mais /iodeto de propídio mais (isto é, células apoptóticas tardias). Inserção: Tipos de populações de células (Anexina V-/iodeto de propídio mais células são células necróticas e anexina V-/iodeto de propídio-são células vivas). Os resultados são expressos em porcentagens em relação ao número total de eventos. Informações gerais:(1) As células foram incubadas por 24 h em condições normóxicas (21 por cento O2) ou hipóxicas (1 por cento O), conforme indicado em "Métodos?. inibidor de pan-caspase Z-VAD-FMK (25 μM) foi adicionado 1 h antes do início da exposição aohipóxia. (2)As microfotografias são exemplos representativos de três experimentos independentes. Barras e barras de erro em gráficos: Cada barra representa a média ± SEM de 3 experimentos diferentes *P<0.01 vs.=""><0.01 vs="">hipóxia;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">hipóxiamais ZVAD.

COX-2(ciclo-oxigenase)A via do receptor /iPGE/EP medeia a morte celular tubular proximal de HK-2 induzida por hipóxia.

Para avaliar o papel do COX-2(ciclo-oxigenase)via do receptor /iPGE2/EP emhipóxiainduzida pela morte celular de HK-2, primeiro pré-incubamos as células com celecoxib, uma COX-2(ciclo-oxigenase)inibidor1; AH6809, um antagonista dos receptores EP1, EP2 e EP3 ou GW627368X, um antagonista do receptor EP433; ou com verde de bromocresol ou bromosul-foftale em ambos os inibidores de PGT435.PGT também foi derrubado por transfecção com siRNA.

Figura 2. COX-2(ciclo-oxigenase)A via do receptor /iPGE/EP medeia a morte celular tubular proximal HK-2 induzida por hipóxia.(a) Prevenção da morte celular por inibidores da via. Painel superior; As barras mostram a porcentagem de morte celular total (esquerda) ou a porcentagem de anexina V apoptótica mais células (direita). Antes de ser expostohipóxia, as células foram pré-incubadas por 1 h com 3 μM de celecoxib（COX-2(ciclo-oxigenase)inibidor）;10 µM AH6809, （EP1-3 antagonista de receptores）, 10 μM GW627368X（EP4 antagonista de receptores）; ou com 50 μM de verde de bromocresol (BG) ou 25 μM de bromosulfoftaleína (BrS), dois inibidores de PGT. Painel inferior: Esquerda: Prevenção da morte celular eliminando PGT por meio de transfecção com siRNA (teste de exclusão de mergulho com azul tripano). Detalhe: Efetividade do knockdown de PGT (análise de Western blot)Direita: Dependência da concentração do efeito preventivo do verde de bromocresol (BG). (b) Prevenção da morte celular por transfecção com um vetor de expressão de mamífero contendo enzima inativadora de prostaglandina 15-hidroxi-prostaglandina desidrogenase(15-PGDH) cDNA (teste de exclusão de corante azul de tripano).Inserção: Expressão de {{ 11}}PGDH (análise de Western blot) em células transfectadas. (c)Hipóxiainduz um aumento sensível a PGT em iPGE,Esquerda: Imunofluorescência dependente de PGE isoladamente ou mesclada com coloração nuclear com DAPI é mostrada (ampliação original,40×) Direita: Abordagem quantitativa das imagens apresentadas no painel esquerdo usando o software Image J. (d) O inibidor da ativação de EGFR AG1478 não previne a morte celular de HK-2 EGFR. As células foram pré-incubadas por 1 h com l μM AG1478 antes de serem submetidas ahipóxia. （e） O inibidor de PGT BG não modifica a expressão de Bax e Bcl-2 em células HK-2 sobhipóxia(Análise de Western blot). (f) Prevenção dehipóxia/morte celular induzida por reoxigenação por inibidores da via (teste de exclusão do corante azul de tripano). As células foram pré-incubadas com inibidores da via e submetidas ahipóxiacomo em (a). Em seguida, as células foram expostas à normóxia por 3 h. Informações gerais:(1) As células foram incubadas por 24 h em condições normóxicas (21 por cento O,) ou hipóxicas (1 por cento O,), conforme indicado em "Métodos". (2)As microfotografias são exemplos representativos de três experimentos independentes. (3) Os solventes dos inibidores (meio luL/mL) não modificaram o efeito dehipóxiana morte celular (os resultados não são mostrados). (4) Análise de Western blot: A proteína igual foi confirmada por sondagem com um anticorpo anti- -actina ou anti-GAPDH. (5) Barras e barra de erro em gráficos: Cada barra representa a média ± SEM de 3 experimentos diferentes.*P<0.01><0.01>hipóxiaouhipóxia/reoxigenação.

Conforme mostrado na Fig. 2a,hipóxiaA morte celular tubular proximal induzida foi prevenida em todos os casos. A inibição da apoptose pelo celecoxib indicou que a COX-2(ciclo-oxigenase)desempenha um papel relevantehipóxiamorte celular apoptótica induzida (Fig. 2a, painel superior, à direita). Mais especificamente, o fato de que a apoptose foi prevenida por antagonismo de receptores EP indica que a apoptose é mediada por COX-2(ciclo-oxigenase)produção dependente de PGE. Por outro lado, é mais provável que iPGE, contribua parahipóxiainduziu a morte celular HK-2 porque foi prevenida por;(i) inibição de PGT(Fig.2a) ou(i) superexpressão de 15-PGDH(Fig. 2b), que inativa iPGE2 através de sua oxidação25(de nota, o próprio procedimento de transfecção aumentou a sensibilidade das células HK-2 parahipóxia: a morte celular foi de 45-55 por cento para transfecção em condições de controle em comparação com 15-20 por cento em células não transfectadas). Apoio adicional à contribuição do iPGE, parahipóxiamorte celular HK-2 induzida, são nossas descobertas anteriores quehipóxiadetermina um aumento no conteúdo celular de iPGE,1 e que esse aumento foi prevenido por inibidores de PGT (Fig. 2c).

As vias de sinalização MAPK podem induzir apoptose, porque os receptores iEP transativam o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR)36, o que leva à ativação das MAP quinases ERK1/2 e p38 em células HK-20, perguntamos se pré -incubação de células HK-2 com o inibidor da ativação de EGFR AG1478 prevenidahipóxia-morte celular induzida. Encontramos resultados negativos (Fig.2d) e, portanto, é improvável que a transativação de EGFR media a morte celular HK-2 sobhipóxia.

Em vários modelos experimentais, a redução de ATP derivado de mitocôndrias durantehipóxiacausa um aumento na razão de expressão da proteína pró-apoptótica Bax para a proteína antiapoptótica Bcl-2, o que leva à liberação do citocromo C no citosol, ativação da caspase 9 e subsequente clivagem e ativação do efetor a jusante caspases37,38. No entanto, a pré-incubação com inibidor de PGT BG em células HK-2 sobhipóxianão resultou em alterações compatíveis com uma mudança antiapoptótica no equilíbrio entre a expressão de Bc-2 e Bax(Fig.2e), o que não suporta um papel dessas proteínas na célula HK-2 morte sobhipóxia.

Após exposição hipóxica, episódios de reoxigenação (lesão de isquemia/reperfusão) podem induzir danos celulares adicionais. O "paradoxo" da lesão por reoxigenação pode ser entendido levando em consideração que as células sofrem alterações específicas nas atividades enzimáticas, função mitocondrial, estrutura do citoesqueleto, transporte de membrana e defesas antioxidantes em resposta ahipóxia, que então coletivamente predispõem à lesão de reoxigenação39. A reoxigenação contribui para lesão renal aguda durante acidente vascular cerebral isquêmico, transplante renal, insuficiência circulatória ou cirurgia renal e cardiovascular. Neste contexto, o potencial valor terapêutico da inibição dehipóxia/morte celular tubular proximal induzida por reoxigenação através de intervenção em COX-2(ciclo-oxigenase)A via do receptor /iPGE,/iEP é evidente. Portanto, perguntamos se o iPGE media especificamentehipóxiainduz a morte celular ou também medeiahipóxia/morte celular induzida por reoxigenação (um modelo in vitro que imita a lesão de isquemia/reperfusão renal in vivo). Conforme mostrado na Fig.2f, a morte celular (conforme avaliada pelo teste de exclusão de mergulho com azul tripano) foi evitada por COX-2(ciclo-oxigenase)inibidor celecoxib, bem como por antagonistas do receptor EP AH6809 ou GW627368X. Igual à Fig.2a, esses resultados sugerem que COX-2 desempenha um papel relevante nahipóxia/morte celular induzida por reoxigenação e, mais especificamente, essa morte celular é mediada por COX-2(ciclo-oxigenase)produção dependente de PGE, uma vez que foi impedida pelo antagonismo dos receptores EP. No entanto, como a morte celular não foi prevenida pelos inibidores de PGT verde de bromocresol ou bro-mossulfoftaleína (Fig.2f e Figura Suplementar 2d), é mais provável quehipóxiaA morte celular HK-2 induzida por reoxigenação é mediada exclusivamente por PGE extracelular.

HIF-1 -regulação transcricional dependente de COX-2(ciclo-oxigenase)expressão gênica contribui para umahipóxiaaumento induzido em iPGE, em células HK tubulares proximais-2. PGE, a biossíntese envolve a liberação de glicerofosfolipídios de membrana do ácido araquidônico pela fosfolipase A, seguida pela conversão pelas isoenzimas COX do ácido araquidônico em prostaglandina H e, finalmente, pela isomerização da glândula prosta em H, em PGE, por sintases de prostaglandina E como PGE sintase microssomal-1 (mPGES-1)19. Nós descobrimos quehipóxiaapoptose induzida em células HK-2 é provavelmente mediada por uma COX-2(ciclo-oxigenase)-aumento dependente na produção de PGE,(Fig.2). Dado que COX-2(ciclo-oxigenase)é uma enzima cuja expressão pode ser induzida porhipóxia, hipotetizamos que umhipóxiaaumento induzido em PGE, a produção em células HK-2 pode ser consequência de um aumento na expressão de COX-2(ciclo-oxigenase). Para confirmar nossa hipótese, estudamos (i) o efeito dehipóxiana expressão de COX-2(ciclo-oxigenase)proteína e mRNA e (ii) o efeito da COX-2(ciclo-oxigenase)inibidor celecoxib nohipóxiaaumento induzido em iPGE, Nossos resultados indicaram quehipóxiadeterminado de forma transitória a regulação positiva da transcrição de COX-2(ciclo-oxigenase)expressão(Fig. 3a,b) e que COX-2(ciclo-oxigenase)inibição embotou o aumento de iPGE, em células HK-2 sobhipóxia(Fig.3c). Interessantemente,hipóxiatambém determinou a regulação positiva transitória da expressão da proteína mPGES-1 (Fig, 3a, inserção), mas não afetou a expressão de mRNA mPGES-1 (Fig, 3b. inserção). Esses resultados indicaram que a expressão aumentada de COX-2(ciclo-oxigenase)e mPGES-1 é responsável pelahipóxiaaumento induzido de iPGE.

Figura 3. Regulação transcricional dependente de HIF-la de COX-2(ciclo-oxigenase)a expressão gênica contribui para o aumento induzido por hipóxia de iPGE, em células HK tubulares proximais-2.(a) A expressão de COX-2(ciclo-oxigenase)proteína é transitoriamente aumentada porhipóxia(Análise de Western blot). Detalhe: a proteína mPGES-1 de expressão também é transitoriamente regulada positivamente porhipóxia. (b)Expressão COX-2(ciclo-oxigenase)O mRNA é transitoriamente aumentado porhipóxia. Inserção: A expressão de mPGES-1 mRNA não é afetada porhipóxia. (c) Prevenção por celecoxib, um COX-2(ciclo-oxigenase)inibidor, do aumento de iPGE, induzido porhipóxia. As células foram pré-incubadas por 1 h com 3 μM de celecoxib. Esquerda∶PGE, imunofluorescência dependente sozinha ou mesclada com coloração nuclear com DAPI é mostrada (ampliação original, 40×). Direita: Abordagem quantitativa das imagens apresentadas no painel esquerdo usando o software Image J. (d) Contribuição dos mecanismos de transcrição. Esquerda: O inibidor transcricional actinomicina D (Ato D) previne umahipóxiaaumento induzido em COX-2(ciclo-oxigenase)expressão de proteínas (análise de Western blot). As células foram pré-tratadas durante lh com 1 ug/ml de Act. D antes de ser exposto ahipóxiapor 3 h.Direito: Aumento na atividade de um COX-2(ciclo-oxigenase)construção do repórter. (e) Inibidor de HIF-la YC-1 previnehipóxiaCOX transcricional induzida-2(ciclo-oxigenase)regulação ascendente. As células foram pré-incubadas por 1 h com 0,5 uM YC-1. Esquerda: Prevenção de COX-2(ciclo-oxigenase)regulação ascendente. As células foram expostas ahipóxiapor 8h. Central: Prevenção do aumento da atividade de um COX-2(ciclo-oxigenase)construção do repórter. Direita: Inibição da atividade de uma construção de repórter orientada por HRE. As células foram expostas ahipóxiapor 8 h.(f) o inibidor de HIF-la YC-1 aumenta a morte celular por apoptose (estudos de citometria de fluxo). Antes de ser expostohipóxia, as células foram pré-incubadas por 1 h com 0,5 μM YC-1. Inset∶ YC-1 inibe ahipóxiaaumento induzido em HIF-1uma expressão (análise de Western blot). Informações gerais:(1) As células foram incubadas por 24 h em condições normóxicas (21 por cento O,) ou hipóxicas (1 por cento O,), conforme indicado em "Métodos". (2)As microfotografias são exemplos representativos de três experimentos independentes. (3)Análise de Western blot: A proteína igual foi confirmada por sondagem com um anticorpo anti- -actina (4) Barras e barras de erro nos gráficos: Cada barra representa a média ± SEM de 3 experimentos diferentes *P<0.01 vs.="" other="">

Para examinar melhor a contribuição dos mecanismos de transcrição para o aumento da COX-2(ciclo-oxigenase)expressão de proteínas sobhipóxia, expressão de COX-2(ciclo-oxigenase)foi avaliada em células HK-2, que foram pré-incubadas com o inibidor de transcrição actinomicina D antes de serem submetidas ahipóxiapor 5h. Conforme mostrado na Fig.3d,hipóxiaaumento induzido em COX-2(ciclo-oxigenase)a expressão da proteína foi prevenida pela actinomicina D. Além disso,hipóxiatambém determinou um aumento na atividade de um COX-2(ciclo-oxigenase)construtor promotor previamente transfectado em células HK-2 (Fig.3d à direita). Tomados em conjunto, os resultados mostrados na Fig. 3d sugerem que os mecanismos de transcrição contribuem para umahipóxiaaumento induzido em COX-2(ciclo-oxigenase)expressão de proteínas. No entanto, houve uma discrepância entre o momento da ativação do promotor COX-2 e o momento da COX máxima-2(ciclo-oxigenase)Expressão de mRNA: enquanto o aumento transitório em COX-2(ciclo-oxigenase)A expressão de mRNA foi máxima após 2 h (Fig.3b), o promotor COX-2 foi ativado após 3 h (Fig.3d), o que provavelmente reflete a contribuição de mecanismos pós-transcricionais para o aumento de COX{{6 }}(ciclo-oxigenase)expressão4. Assim, especulamos que COX-2(ciclo-oxigenase)mRNA é estabilizado sobhipóxia, o que resultaria em níveis maiores de COX-2(ciclo-oxigenase)expressão de mRNA sem qualquer contribuição (no momento) de aumento da atividade da COX-2(ciclo-oxigenase)promotor. No entanto, também é possível que um intervalo de tempo entre a ativação do promotor e o acúmulo de substrato mensurável também possa contribuir para a discrepância entre o momento da ativação do promotor COX-2 e o momento da COX máxima{{1 }}(ciclo-oxigenase)expressão de mRNA.

HIF-1 é um fator de transcrição heterodimérico composto pela subunidade dependente de oxigênio e pela subunidade expressa constitutivamente. Debaixohipóxia, HIF-l se acumula e entra no núcleo, onde gera o fator de transcrição HIF-1 após dimerização com HIF-1 . O HIF-1 então promove a expressão de seus genes alvo ligando-se ahipóxia-elementos responsivos (HREs) presentes em sua região reguladora e subsequentemente orquestram respostas adaptativas celulares para combaterhipóxia 3. Dado quehipóxiapode ativar COX-2(ciclo-oxigenase)expressão de forma dependente de HIF-1-através de um HRE funcional presente na sequência do promotor COX-22, examinamos o papel do HIF-l em umhipóxiaaumento induzido em COX-2(ciclo-oxigenase)expressão. Também analisamos a atividade de uma construção do promotor COX-2 transfectada em células HK-2. Conforme mostrado na Fig. 3e, pré-incubação com o HIF-1um inibidor YC-1, que embotouhipóxiaaumento induzido na expressão de HIF-la e na atividade de um construto repórter HRE, resultou na prevenção do aumento na expressão de COX-2(ciclo-oxigenase)e atividade do COX-2(ciclo-oxigenase)construtor promotor em HK-2 submetido ahipóxia. Em resumo, os resultados são mostrados na Fig.3a-e suportam a noção de que HIF-1 -regulação transcricional dependente de COX-2(ciclo-oxigenase)é responsável pelahipóxiaaumento induzido em iPGE2.

Embora as consequências da ativação do HIF-1a emhipóxiaapoptose induzida são controversas (provavelmente porque podem ser dependentes do contexto), analisamos (de forma preliminar) o papel do HIF-1a em nosso sistema experimental. Como encontramos anteriormente essa intervenção no COX-2(ciclo-oxigenase)/iPGE, via do receptor EP inibe o aumento da expressão de HIF-la desencadeado porhipóxia8,56 perguntamos se a inibição do HIF-la resulta na prevenção dehipóxiaapoptose de células HK-2 induzida. Conforme mostrado na Fig. 3f, a pré-incubação com YC-1, um inibidor de HIF-l, na verdade aumentouhipóxiaapoptose induzida. Portanto, é improvável que HlF-la

Discussão

Tecidohipóxiaé considerada criticamente relevante na fisiopatologia tanto da doença renal crônica quanto da lesão renal aguda, sendo o PTC a porção mais suscetível dos túbulos renais contrahipóxia. Aqui examinamos o papel da PGE, nos danos infligidos porhipóxiapara PTC humano e descobriu que o aumento da produção de iPGE originou-se da regulação positiva de COX dependente de HIF-la-2(ciclo-oxigenase)expressão gênica e expressão aumentada de mPGES-1, contribui parahipóxiamorte celular apoptótica induzida em células HK-2. Dado que a hipóxia tubular é um fator relevante para doença renal aguda e crônica-2, esses resultados apontam o transportador de prostaglandinas PGT como um novo alvo terapêutico nas doenças renais.

Hipóxianão apenas aumenta a iPGE, mas também sua liberação para o meio extracelular8, de modo que a PGE secretada (extracelular) também pode desempenhar um papel nahipóxiaapoptose induzida (por exemplo, desencadeando cascatas apoptóticas através da ativação canônica de receptores EP localizados na membrana celular). Dois estudos anteriores mostraram que a morte celular sobhipóxiatambém foi devido a COX-2(ciclo-oxigenase)-produção dependente de PGE,1345. Por outro lado, em certos tipos de células (fibroblastos, microglia, neurônios e linhagens de células de leucemia linfoblástica aguda), a apoptose induzida por PGE é mediada pela ativação dependente de PGE de receptores EP46-48. Encontramos aqui quehipóxiaa apoptose de células HK -2 induzida também foi prevenida pelo antagonismo dos receptores EP (Fig.2a, painel superior, à direita). Mas como os receptores EP foram classicamente descritos como receptores de membrana plasmática - de modo que são inacessíveis para iPGE2-, especulamos que os receptores EP que medeiam o efeito apoptótico de iPGE, em células HK hipóxicas-2 são um subconjunto localizado intracelularmente (ou seja, receptores iEP).

Em contraste com o papel da iPGE2 nahipóxiaapoptose induzida em células HK-2, descobrimos que apenas a PGE extracelular medeiahipóxia/reoxigenação induzida por morte celular de HK-2 porque não foi prevenida por inibidores de PGT (Fig. 2f). Embora os mecanismos patológicos de lesão celular apóshipóxia/reoxigenação não são completamente compreendidos, aceita-se que a morte celular ocorre em grande parte através da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) excessivas. Isso é particularmente verdadeiro para células HK-249,50. No entanto, emborahipóxiatambém pode aumentar a produção de ROS, até onde sabemos, não há evidências de que ROS desempenhe um papel relevante nahipóxiamorte de células HK-2 induzida. Isso sugere que os efeitos letais da hipóxia e hipóxia/reoxigenação em células HK-2 são mediados por diferentes mecanismos, o que pode explicar por que BG e BS são protetores contrahipóxiamas não contrahipóxia/reoxigenação. Consequentemente, a inibição de PGT pode fornecer benefícios terapêuticos em PTC contra lesão celular induzida por hipóxia, mas não contra o efeito deletério dehipóxia/reoxigenação.

HIF-1 -regulação ascendente dependente de COX-2(ciclo-oxigenase)foi um evento crítico parahipóxiaapoptose de células HK-2 induzida (Fig.3e). No entanto, nossa observação de que o inibidor de HIF YC-1 aumentou a morte celular apoptótica (Fig.3f) é intrigante, embora relatórios anteriores já tenham mostrado resultados semelhantes1. Uma explicação possível é um cenário hipotético em que o HIF-la não apenas medeia a regulação pró-apoptótica da COX-2(ciclo-oxigenase)mas também a regulação positiva de moléculas protetoras. De fato, o HIF-1-regulava a expressão de moléculas protetoras contrahipóxiacomo RNA longo não codificante DARS-AS1'e microRNA-2103 foi encontrado especificamente em células HK-2. No entanto, embora essas evidências sustentem nosso cenário hipotético, experimentos específicos devem ser realizados para confirmá-lo.

Investigação da resposta das células renais ahipóxiapode melhorar nossa compreensão da patologia renal. Estudamos, ainda que de forma preliminar, o papel de um aumento na razão de expressão da proteína pró-apoptótica Bax para a proteína antiapoptótica Bcl-2 emhipóxiaapoptose induzida em células HK-2. Nossos resultados indicaram que a inibição de PGL não resultou em alterações compatíveis com uma mudança anti-apoptótica no equilíbrio entre a expressão de Bcl-2 e Bax(Fig.2e), o que não suporta um papel dessas proteínas na morte celular HK-2 dependente de iPGE sobhipóxia. Até onde sabemos, existem apenas dois estudos sobre a implicação do eixo Bcl{0}}/Bax na apoptose induzida por hipóxia em PTC e ambos envolveram concentrações anóxicas" ou quase anóxicas de O5 . Quando o PTC foi exposto a 0,2 por cento de O., a expressão de Bax permaneceu inalterada e a apoptose foi ligada à diminuição do grau de expressão de Bcl-2. No entanto, a expressão de Bcl-2 não foi afetada por 1 por cento de O, apesar da presença de apoptose, o que coincide com nossos resultados. Portanto, outros mecanismos que não envolvem necessariamente mudanças quantitativas na expressão de Bcl-2 ou Bax devem ser considerados: por exemplo, a indução de apoptose em células de glioma cultivadas por iPGE2 requer apenas sua associação física com Bax, que desencadeia a translocação de Bax para a mitocôndria 202. Assim, o mecanismo pelo qual a iPGE contribui para a apoptose das células HK{11}} merece mais estudos.

Nosso grupo descobriu que um COX-2(ciclo-oxigenase)-aumento dependente de iPGE, medeia a morte apoptótica em células HK-2 expostas a cisplatina, corpos apoptóticos7" ehipóxia(nossos resultados atuais). Como a PGE é rapidamente liberada para fora da célula após ser sintetizada2, seu transporte para dentro pela PGl desempenha um papel crítico na apoptose induzida por iPGE em células HK-2. Portanto, sempre que esse dano ao PTC é mediado por iPGE, o tratamento com inibidores de PGT pode ser uma abordagem terapêutica útil com aplicações potenciais, como prevenção de dano ao PTC induzido por cisplatina, inibição da propagação de lesão tubular através de corpos apoptóticos ou limitação da efeito deletério dehipóxiano PTC.