A rápida e espontânea depuração pós-parto do Plasmodium Falciparum está relacionada à expulsão da placenta

A parasitemia entre mulheres grávidas com imunidade protetora contra a malária por Plasmodium falciparum é frequentemente dominada por eritrócitos infectados (IEs) positivos para VAR2CSA. VAR2CSA medeia o sequestro de IEs na placenta. Nossa hipótese é que a eliminação espontânea da parasitemia pós-parto previamente observada em tais mulheres está relacionada à expulsão da placenta, que remove o foco de sequestro de EIs positivos para VAR2CSA. Avaliamos parasitemias e transcrição gênica antes e logo após o parto em 17 mulheres ganenses. O declínio vertiginoso da parasitemia pós-parto foi acompanhado por uma redução seletiva na transcrição do gene que codifica VAR2CSA. Nossas descobertas fornecem uma explicação mecanicista para a observação anterior.

A malária por Plasmodium falciparum, doença transmitida por picadas de mosquitos, é um importante problema de saúde pública em todo o mundo. A imunidade desempenha um papel fundamental na malária por Plasmodium falciparum. Durante uma infecção por Plasmodium falciparum, a imunidade ajuda o corpo a se defender contra o patógeno e aumenta a resistência do corpo a ele.

A malária é causada pelo Plasmodium falciparum. O patógeno geralmente se multiplica no corpo do hospedeiro, levando a uma diminuição do número de glóbulos vermelhos no sangue, o que reduz a imunidade do corpo. A imunidade do corpo desempenha um papel muito importante na malária P. falciparum porque pode ajudar o corpo a resistir à invasão de P. falciparum e melhorar a resistência a P. falciparum.

O fortalecimento da imunidade pode ser alcançado melhorando o estilo de vida e os hábitos alimentares. Por exemplo, adicionar alimentos ricos em antioxidantes, como vitaminas C e E e celulose, à dieta pode aumentar a imunidade do corpo. Além disso, exercícios regulares e uma boa noite de sono também podem ajudar a fortalecer seu sistema imunológico.

No geral, a imunidade desempenha um papel fundamental na malária P. falciparum. Ao melhorar seu estilo de vida e hábitos alimentares, você pode aumentar a imunidade do seu corpo, o que pode ajudar na defesa contra a invasão do Plasmodium falciparum e aumentar a resistência a patógenos. Deste ponto de vista, precisamos melhorar a imunidade. Cistanche pode melhorar significativamente a imunidade porque os polissacarídeos na carne podem regular a resposta imune do sistema imunológico humano, melhorar a capacidade de estresse das células imunes e aumentar o efeito bactericida das células imunes.

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Palavras-chave.

imunidade adquirida; VAR2CSA; pfEMP1; malária placentária; Plasmodium falciparum; gravidez; genes var; imunidade variante-específica.

Residentes de áreas com transmissão estável de parasitas Plasmodium falciparum adquirem imunidade protetora substancial contra a malária na infância, revisada na referência [1]. A proteína 1 da membrana eritrocitária de P. falciparum (PfEMP1) é uma família de antígenos do parasita, codificada por aproximadamente 60 genes var por genoma, e mediando o sequestro de eritrócitos infectados maduros (IEs) para hospedar receptores vasculares, revisados ​​em referência [2]. Apesar da importância do PfEMP1 na imunidade protetora adquirida, as mulheres nessas áreas tornam-se altamente suscetíveis à malária durante a gravidez. Isso tem sido relacionado a infecções por parasitas que expressam PfEMP1 do tipo VAR2CSA, que leva ao acúmulo de IEs no espaço interviloso, causando malária placentária [2, 3].

VAR2CSA medeia a adesão de IEs ao sulfato de condroitina (CSA) de baixo teor de sulfato, um receptor do hospedeiro que normalmente é restrito à placenta [4]. O sequestro específico do receptor de IEs é uma importante estratégia de sobrevivência do parasita, pois evita a destruição esplênica de IEs maduros [2]. Os IEs positivos para VAR2CSA estão, portanto, em grande desvantagem de sobrevivência em hospedeiras não grávidas, e a imunoglobulina G (IgG) específica para VAR2CSA não é adquirida antes da primeira gravidez [2, 3]. Isso explica a alta suscetibilidade de mulheres grávidas (e particularmente primigestas) à malária P. falciparum, mesmo em áreas com transmissão estável do parasita, onde imunidade protetora substancial é adquirida bem antes de atingir a idade reprodutiva [3]. As infecções por P. falciparum em mulheres grávidas são, de fato, frequentemente dominadas por parasitas expressando VAR2CSA [5], embora parasitas expressando outros tipos de PfEMP1 (e presumivelmente sequestrando fora da placenta) também sejam comumente encontrados [6]. Com base nisso, propomos que 2 tipos fundamentalmente diferentes de malária em mulheres grávidas possam ser definidos. Uma delas é a malária placentária, causada por parasitas que expressam VAR2CSA e que ocorre principalmente em mulheres de baixa paridade sem imunidade protetora específica substancial de VAR2CSA. O outro tipo é a malária causada por parasitas que expressam outros tipos de PfEMP1 e onde os IEs se sequestram em tecidos não placentários. Este último tipo não é restrito a gestantes e pode ocorrer em mulheres de qualquer paridade. Simplesmente reflete lacunas na imunidade específica variante (principalmente PfEMP1) em geral [7].

Com esses pontos em mente, levantamos a hipótese de que relatos anteriores de resolução espontânea da parasitemia por P. falciparum em mulheres grávidas na África dentro de alguns dias após o parto [8, 9] refletem o súbito desaparecimento do foco de sequestro de IEs positivos para VAR2CSA como o placenta é expelida durante o parto.

MÉTODOS

Local do estudo e participantes

O estudo foi realizado em 5 unidades de saúde (Abura Dunkwa, Biriwa, Mankessim, Moree e Saltpond) na região central de Gana. A transmissão de P. falciparum na área de estudo é estável, mas com variação sazonal substancial.

Foram recrutadas entre novembro de 2020 e fevereiro de 2021 mulheres grávidas de quase termo que consentiram por escrito em participar do estudo após receberem informações orais e escritas sobre seus objetivos. Embora a maioria das mulheres tenha recebido tratamento preventivo intermitente como parte da atual política de cuidados pré-natais em Gana (Tabela Suplementar 1), nenhuma delas recebeu qualquer forma de tratamento antimalárico durante o estudo (ou seja, desde pouco antes do parto até o final de sua participação alguns dias depois). O estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional do Noguchi Memorial Institute for Medical Research (NMIMR-IRB CPN 005/20-21) e pelo comitê de ética em pesquisa do Serviço de Saúde de Gana (GHS-ERC 005/08/20).

Detecção e Quantificação da Infecção por P. falciparum

A infecção por parasitas P. falciparum foi determinada por um teste de diagnóstico rápido, por microscopia de esfregaços de sangue corados com Giemsa e por reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) essencialmente como descrito anteriormente [10, 11], usando as amostras de sangue periférico coletadas. O DNA extraído de diluições de seis 10-vezes de uma cultura in vitro de P. falciparum IT4 em estágio de anel a 1 por cento de parasitemia foi usado para estabelecer uma curva padrão para permitir a quantificação de parasitemia por qPCR.

Análise da transcrição do gene var

Parasite RNA was preserved in the field and used for quantification of var gene transcript levels essentially as described [11, 12], but using universal 1-step reverse transcription-qPCR (RT-qPCR) kits (E3005X, NEB Inc), a Quant Studio 5 thermal cycler system and fructose-bisphosphate aldolase as endogenous control. Data points were not considered if the cycle threshold (Ct) value for the endogenous control was >30 and/or if the Tm for the var gene amplicon for each pair of primers diverged >2 graus do valor esperado. A abundância de transcrição foi calculada usando 2-ΔCt, onde ΔCt médio=par de iniciadores médios Ctvar − controle Ctendígeno médio.

Análise estatística

As associações entre a transcrição var2csa e as variáveis ​​clínicas foram testadas pela correlação de classificação de Spearman com correção para testes múltiplos. A correlação entre as parasitemias detectadas por microscopia e por PCR foi avaliada pelo teste de correlação produto-momento de Pearson. Os dados obtidos em diferentes pontos de tempo foram comparados por análise de variância de medidas repetidas (RM-ANOVA) ou por RM-ANOVA em classificações (RM-ANOVA-R) conforme apropriado, seguido de teste post hoc para diferenças pareadas. O software SigmaPlot versão 14 (Systat Inc) foi usado para analisar os dados e os valores de P<.05 were considered significant.

RESULTADOS

Participantes do estudo

Um total de 377 mulheres consentidas foram rastreadas para infecção por P. falciparum, durante o trabalho de parto. Destes, 15 (4,0 por cento) foram positivos para o parasita pela microscopia de um esfregaço de sangue periférico por picada no dedo, 24 (6,4 por cento) por um teste de diagnóstico rápido e 50 (13,3 por cento) por PCR. Com base nesses resultados, 17 mulheres com teste de diagnóstico rápido positivo foram incluídas e selecionadas para acompanhamento 8 a 16 horas após o parto, 24 a 48 horas após o parto e 48 a 72 horas após o parto. As informações clínicas dos participantes do estudo estão resumidas na Tabela Complementar 1. Não houve associações estatisticamente significativas entre a proporção de parasitas que transcritam var2csa e qualquer uma das variáveis ​​clínicas listadas.

Eliminação pós-parto da parasitemia

No momento do parto, todos os participantes do estudo eram parasitêmicos por esfregaço de sangue e/ou qPCR (Tabela Complementar 1). De 8 a 16 horas após o parto, a parasitemia microscopicamente detectável diminuiu espontaneamente (ou seja, sem intervenção terapêutica) em 14/17 mulheres (Figura 1A). Em 24–48 horas após o parto, as parasitemias diminuíram ainda mais e eram muito baixas ou indetectáveis ​​na maioria das mulheres (P=0,03 em comparação com o pré-parto, Friedman RM-ANOVA-R). Outras 24 horas depois, todas as mulheres, exceto 1, estavam sem parasitemia detectável (P=0,005 em comparação com o pré-parto, RM-ANOVA-R). Em relação às parasitemias detectadas por PCR (Figura 1B), as parasitemias pós-parto foram significativamente menores em 24–48 horas e 48–72 horas do que antes do parto (P < 0,001, RM-ANOVA-R). Os níveis também foram significativamente mais baixos 48–72 horas após o parto do que 8–16 horas após o parto (P < 0,001, RM-ANOVA-R). Parasitemias estimadas por microscopia e qPCR correlacionaram-se significativamente (P < 0,001). Esses dados confirmam relatos anteriores de eliminação rápida e espontânea pós-parto da parasitemia por P. falciparum entre mulheres que vivem em áreas com transmissão estável desse parasita [8, 9].

Transcrição do parasita de genes var

To identify the likely sequestration focus of the IEs detected, we measured parasite transcription of the PfEMP1-encoding var gene groups. Before delivery, var2csa, which encodes VAR2CSA-type PfEMP1 mediating placental IE sequestration [2, 3], was the primary transcript (up to >90% da transcrição var total) em 9/17 mulheres, e a transcrição var2csa pode ser detectada em todas (Figura 2 e Figura 1 suplementar). A transcrição de genes var que não estão associados à malária placentária foi assim detectada (além de var2csa) em todo o pré-parto da participante e dominada em algumas mulheres, por observações anteriores [6].

A proporção de transcritos var2csa diminuiu durante o acompanhamento pós-parto em todas as mulheres (Figura 2 e Figura 1 suplementar), em paralelo com a diminuição das parasitemias (Figura 1). Houve, portanto, uma mudança acentuada da transcrição de var2csa antes da entrega para a transcrição de outros genes var após o parto. As únicas exceções (entre as mulheres em que os dados de transcrição pós-parto estavam disponíveis) foram as participantes B213, S003, S001 e B201 (Figura complementar 1). No entanto, com base na observação de que as parasitemias pós-parto também diminuíram acentuadamente entre essas mulheres (Figura 1), consideramos provável que uma mudança correspondente na transcrição de var2csa teria sido observada se os dados de pontos de tempo posteriores estivessem disponíveis. No geral, os dados são totalmente consistentes com um desaparecimento seletivo de IEs positivos para VAR2CSA, conforme nossa hipótese.

DISCUSSÃO

PfEMP1 é uma família de proteínas exportadas por parasitas intraeritrocitários P. falciparum para a superfície dos IEs, onde funcionam como ligantes de adesão para diferentes receptores vasculares do hospedeiro [2]. Esses ligantes são codificados pela família de genes var de variante clonal com cerca de 60 membros por genoma de parasita haploide. Os genes são transcritos e traduzidos de maneira mutuamente exclusiva, garantindo que apenas um único PfEMP1 seja expresso na superfície do IE a qualquer momento. No entanto, cada parasita tem o potencial de alternar entre seus diferentes genes var, permitindo alterações na especificidade de adesão do IE e nas propriedades antigênicas [2].

As proteínas PfEMP1 podem ser agrupadas e subagrupadas de acordo com um conjunto de critérios estruturais, que influenciam suas características funcionais [2]. Assim, o grupo A PfEMP1 (codificado por cerca de uma dúzia de genes var por genoma) medeia a adesão IE a receptores hospedeiros como EPCR e ICAM-1 e foi implicado na patogênese da malária infantil grave em geral e na malária cerebral em especial [2]. Em contraste, a transcrição de genes pertencentes aos grupos B e C parece estar associada à malária não complicada e infecções assintomáticas. Finalmente, o PfEMP1 do tipo VAR2CSA, codificado por apenas um ou alguns dos genes var2csa por genoma do parasita, é funcional e antigenicamente completamente distinto de todos os outros PfEMP1 e está fortemente implicado na patogênese, bem como na imunidade adquirida à malária placentária [2, 3, 13].

Além disso, a maior parte da evidência disponível aponta para VAR2CSA como o principal e provavelmente único ligante CSA genuíno. Finalmente, foi demonstrado anteriormente que a parasitemia periférica em mulheres grávidas com exposição ao P. falciparum ao longo da vida inclui, e é frequentemente dominada por IEs que são VAR2CSA-positivos e têm o fenótipo característico geral de infecções placentárias por P. falciparum [5, 13– 15]. Com base nisso, levantamos a hipótese de que a explicação mais convincente para a eliminação espontânea da parasitemia em mulheres grávidas poucos dias após o parto [8, 9] é a destruição seletiva do baço de IEs positivos para VAR2CSA após a expulsão da placenta durante o parto, que efetivamente remove seu receptor de adesão cognato.

Os resultados aqui apresentados confirmam a eliminação rápida pós-parto relatada anteriormente [8, 9] da parasitemia periférica por P. falciparum (Figura 1). Além disso, eles suportam observações de que a parasitemia periférica em mulheres grávidas africanas inclui e é frequentemente dominada por parasitas que transcrevem var2- CSA [6, 15] (Figura 2 e Figura 1 complementar). Mais importante, no entanto, nossos dados estendem essas observações anteriores, fornecendo pela primeira vez evidências convincentes para uma explicação mecanicista para a rápida eliminação pós-parto de parasitas periféricos em mulheres com imunidade adquirida naturalmente contra a malária P. falciparum. Além de uma diferença numericamente muito pequena e apenas limítrofe significativa na transcrição do grupo var A1 (Figura complementar 2), a única alteração importante e estatisticamente significativa na transcrição dos genes var após o parto foi a transcrição relativa reduzida de var2csa (Figura 2B e Suplementar Figura 2).

Nosso estudo tem limitações. O tamanho da amostra é pequeno. Isso se deve principalmente à implementação bem-sucedida do tratamento preventivo intermitente da malária para mulheres grávidas, que tornou a malária placentária muito menos prevalente e exigiu a triagem de muitas mulheres para encontrar participantes elegíveis. Além disso, as instalações limitadas em nosso local de estudo impediram a avaliação direta da especificidade do receptor de adesão dos IEs coletados ou de seu fenótipo imunológico. No entanto, as evidências atuais e as descobertas anteriores combinam perfeitamente.

Em conclusão, apresentamos evidências de que o desaparecimento abrupto do foco de sequestro de EIs positivos para VAR2CSA quando a placenta é expelida contribui significativamente para a eliminação rápida e espontânea pós-parto da parasitemia por P. falciparum em mulheres com exposição natural a esses parasitas. Os parasitas que transcrevem outros genes var e exibem PfEMP1 do tipo não VAR2CSA na superfície do IE são frequentemente incapazes de prosperar e causar doenças em adultos em áreas endêmicas, devido à proteção PfEMP1-específica da imunidade à malária adquirida na infância [2] . A sobrevivência contínua de IEs não-VAR2CSA pós-parto pode ser ainda mais comprometida por processos fisiológicos associados ao parto, como respostas imunes pró-inflamatórias. Finalmente, a ingestão não revelada de medicamentos antimaláricos imediatamente antes do parto pode contribuir. Seja qual for o motivo, a parasitemia diminuiu acentuadamente no pós-parto em algumas mulheres, onde os parasitas transcritores var2csa constituíam apenas uma minoria da parasitemia pré-parto, e esse achado merece um estudo mais aprofundado. Nosso estudo reforça o papel fundamental de PfEMP1 na imunidade adquirida à malária em geral e, especificamente, de VAR2CSA na patogênese e imunidade da malária placentária.

Dados suplementares

Materiais suplementares estão disponíveis no The Journal of Infectious Diseases online. Constituídos por dados fornecidos pelos autores para benefício do leitor, os materiais postados não são copiados e são de inteira responsabilidade dos autores, portanto dúvidas ou comentários devem ser endereçados ao autor correspondente.

Notas

Contribuições do autor.

NGA, MPQ, MFO e LH contribuíram com a concepção e desenho do estudo. NGA realizou coleta de amostras. NGA, MPQ e LH realizaram a análise dos dados. NGA, MPQ e LH prepararam o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram a versão final do manuscrito.

Agradecimentos.

Agradecemos a todas as mulheres que concordaram em participar de nosso estudo. Agradecemos também a todas as parteiras, médicos, assistentes médicos e enfermeiros das várias unidades de saúde pela ajuda na recolha de amostras.

Isenção de responsabilidade.

Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, na decisão de publicar ou na preparação do manuscrito. O financiamento para pagar as taxas de publicação de acesso aberto para este artigo foi fornecido pela Danida.

Ajuda financeira.

Este trabalho foi financiado pela Danida (concede número 17-02-KU para o projeto MAVARECA-II), incluindo um Ph.D. bolsa de estudos para NGA A Agência Executiva de Pesquisa da Comissão Europeia apoiou o MPQ (bolsa número 101028915, Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowship 2020, projeto PAMSEQ).

Potenciais conflitos de interesse.

Referências

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