O caminho para o progresso dos estudos pré-clínicos de doenças neurodegenerativas relacionadas à idade: uma perspectiva sobre modelos derivados de roedores e HiPSC, parte 2

Além dos modelos transgênicos desenvolvidos por laboratórios acadêmicos individuais, o National Institutes of Health (NIH) está atualmente liderando o Projeto de Descoberta de Alvos e Validação Pré-clínica da Accelerating Medicines Partnership-AD (AMP-AD), que é um consórcio de bolsas multiinstitucionais e multidisciplinares. que coletivamente pretendem agilizar os canais de descoberta de medicamentos para a DA (https://www.nia.nih.gov/research/dn/amp-ad-target-discovery-and-preclinicalvalidation-project).

Com o rápido desenvolvimento da biotecnologia, a tecnologia transgênica tem sido gradualmente aplicada ao campo biológico. A tecnologia transgênica é uma tecnologia de engenharia genética que introduz genes estranhos em organismos para fazê-los apresentar características específicas. No entanto, tem havido controvérsia sobre a relação entre modelos transgênicos e memória.

Alguns pesquisadores acreditam que os modelos transgênicos podem ter um efeito positivo na memória. Por exemplo, algumas experiências com animais transgénicos demonstraram que, ao alterar certos genes, a capacidade de aprendizagem e a memória dos animais podem ser melhoradas. Estes resultados experimentais mostram que a tecnologia transgênica pode potencialmente melhorar a capacidade cognitiva humana.

Embora estes resultados de investigação sejam muito interessantes, também precisamos de ser cautelosos porque os resultados após estes processos experimentais não são o resultado de promoção humana ou aplicação precipitada. Precisamos de realizar mais investigação sobre esta tecnologia para compreender os seus riscos potenciais para o ambiente e os seres humanos, e para medir o seu possível impacto social. Ao mesmo tempo, devemos também admitir que a melhoria da memória não depende apenas dos genes, mas também da saúde física e de hábitos de vida saudáveis, podendo alcançar um bom estado de memória através dos canais normais.

Em suma, devemos olhar com expectativa para os aspectos positivos da tecnologia transgénica e regulá-la e avaliá-la adequadamente. Através da utilização racional da tecnologia transgénica, podemos mudar o nosso genoma, o que nos ajudará a resolver alguns problemas médicos e ambientais, ao mesmo tempo que promove o progresso humano em muitos campos, incluindo a melhoria da memória. Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e Cistanche pode melhorar significativamente a memória porque tem efeitos antioxidantes, antiinflamatórios e antienvelhecimento, que podem ajudar a reduzir a oxidação e as reações inflamatórias no cérebro, protegendo assim a saúde do sistema nervoso. Além disso, Cistanche também pode promover o crescimento e a reparação das células nervosas, melhorando assim a conectividade e a função das redes neurais. Esses efeitos podem ajudar a melhorar a memória, a capacidade de aprendizagem e a velocidade de pensamento, e também podem prevenir a ocorrência de disfunções cognitivas e doenças neurodegenerativas.

Clique em conhecer maneiras de melhorar a função cerebral

Particularmente relevante para esta revisão é o braço do AMP-AD, denominado iniciativa de Desenvolvimento e Avaliação de Organismos Modelo para LOAD (MODEL-AD). O MODEL-AD visa gerar novas linhagens de camundongos transgênicos que modelem com precisão os fenótipos da DA e sirvam como uma plataforma aprimorada para o pipeline de desenvolvimento de medicamentos e modelos mais traduzíveis e biologicamente relevantes para validação pré-clínica de DMT.

A iniciativa MODEL-AD é composta pelo Centro da Escola de Medicina da Universidade de Indiana, pelo Laboratório Jackson, pela Sage Bionetworks, pela Escola de Medicina da Universidade de Pittsburgh e por um centro da Universidade da Califórnia em Irvine.

Juntos, este consórcio pretende estabelecer a próxima geração de modelos de DA in vivo baseados em dados humanos de uma forma rigorosa e altamente controlada. Ao fazê-lo, pretende alinhar as características fisiopatológicas dos modelos de DA com os estágios correspondentes da doença clínica, utilizando biomarcadores traduzíveis como forma de aumentar a traduzibilidade dos achados pré-clínicos.57

Até o momento, foram gerados 54 modelos de camundongos com DA, incluindo camundongos fAD, APOE, APP, MAPT/tau, bem como modelos LOAD baseados no acúmulo de Ab e outras variantes relacionadas ao LOAD previamente identificadas (//www.model-ad.org /strain-table/), que estão disponíveis através do JAX/IU/Pitt AD Precision ModelsCenter.

Modelos de toxinas químicas da DA

Além dos modelos transgênicos mais recentes, os modelos de roedores com DA foram historicamente baseados na exposição a compostos tóxicos que causam neurodegeneração seletiva, levando a deficiências cognitivas e comportamentais semelhantes às observadas em pacientes com DA.

Embora vários modelos de exposição a toxinas tenham sido empregados no estudo da DA e da DP, os modelos da DA foram amplamente substituídos pelos modelos transgênicos mais recentes discutidos acima.

Modelos químicos de DA induzem patologia semelhante à DA usando compostos que interrompem seletiva e reversivelmente a atividade dos neurônios colinérgicos ou toxinas que perturbam permanentemente os processos de homeostase celular que levam à morte celular, como o ácido ocadaico e várias classes de metais pesados ​​58 (Tabela 2). Embora estes modelos produzam alguns défices neurológicos e comportamentais que se assemelham aos sintomas da DA, incluindo aprendizagem e memória prejudicadas, eles carecem em grande parte de lesões patológicas da DA (isto é, as placas Ab e NFTs).

Os modelos animais que se concentram explicitamente na ruptura dos neurônios colinérgicos baseiam-se na hipótese colinérgica da DA, agora um tanto desatualizada.59 Nesses modelos, os antagonistas dos receptores muscarínicos, por exemplo, o composto escopolamina, são administrados em regiões cerebrais específicas, como o HP, para bloquear atividade endógena da acetilcolina e induz prejuízos cognitivos na aprendizagem e na memória.60

Outros modelos de intervenção química da DA envolvem a administração local ou periférica de neurotoxinas, levando à morte celular neuronal inespecífica61-64 (Tabela 2).

Modelos transgênicos de DP

Como é o caso da DA, os modelos de camundongos transgênicos da DP permitem o estudo das características clínicas da doença induzidas através da manipulação de loci genéticos associados às formas mendelianas da doença, e centenas de linhagens exclusivas estão agora comercialmente disponíveis para compra.

Tal como a DA, a maioria dos casos clínicos de DP são classificados como esporádicos, sendo as formas hereditárias da doença responsáveis ​​por menos de 1% de todos os casos.89 As alterações genéticas nos genes SNCA, LRRK2 e UCH-L1 estão ligadas a formas autossómicas dominantes da doença. PD, enquanto alternâncias nos genes PRKN, PINK1 e DJ-1 estão associadas às formas autossômicas recessivas90 (Tabela 1).

Os dois genes mais comumente visados ​​em modelos transgênicos de DP são SNCA e LRRK2.91,92 Mutações nesses genes causam DP familiar e também foram associadas à forma esporádica de DP via GWAS.93

Além disso, o papel da superexpressão de SNCA na DP familiar (casos de tripla/duplicação) e esporádica foi bem estabelecido.94

Até o momento, a maioria dos modelos transgênicos que manipulam SNCA não apenas introduzem as mutações familiares missense, mas também empregam uma estratégia de superexpressão, inserindo múltiplas cópias do gene SNCA humano ou de camundongo para imitar o aumento da produção de a-sinucleína (a-syn), isoladamente ou em combinação, com um mutação missense familiar.95-97

Uma mutação missense em LRRK2 é a mutação mais comumente relatada associada à DP familiar,98 e várias linhagens de camundongos transgênicos foram geradas com base em uma variedade de mutações conhecidas em LRRK2.

A mutação GS2019S, por exemplo, resulta em uma mutação de ganho de função com atividade quinase aumentada.99 Outros modelos, como as mutações R1441C/G, T1348N e A2016T, relatam alterações na expressão ou agregação a-syn e, em alguns casos, déficits motores nominais; no entanto, os déficits precisos e as características clínicas variam substancialmente entre os modelos.89,92,100

Além dos genes SNCA e LRRK2, várias outras linhagens transgênicas foram geradas nas quais outros genes associados à PD são direcionados (Tabela 1). Embora muitos destes modelos alterem com sucesso a expressão e agregação de a-syn, a maioria exibe pouca ou nenhuma neurodegeneração e, consequentemente, as funções motoras permanecem relativamente intactas92 (Tabela 1).

A análise cuidadosa dos agregados a-syn produzidos em muitas dessas linhagens transgênicas revelou ainda que as inclusões formadas não se assemelham aos corpos de Lewy (LBs) de ocorrência natural observados em cérebros com DP pós-morte, mas, em vez disso, exibem uma composição estrutural única.101

A falha dos modelos transgênicos em reproduzir os aspectos moleculares e neurodegenerativos da DP provavelmente se deve a uma combinação de vários fatores. A principal destas preocupações é que a natureza e a extensão do envolvimento de genes ligados à família, e a forma esporádica mais comum da doença, permanecem obscuras, pondo em causa a relevância de modelos baseados na manipulação destes genes para a grande maioria dos casos de DP.

Outra limitação é que os modelos transgênicos resultam em superexpressão do transgene que não imita os níveis fisiológicos e, portanto, pode introduzir artefatos. Além disso, a forma esporádica da doença provavelmente envolve alterações em múltiplos genes, com a suscetibilidade sendo ainda mais impactada por componentes ambientais, sugerindo que os modelos transgênicos monogênicos podem ter utilidade limitada.

No geral, muitas das mesmas questões que assolam os modelos transgénicos da DA aplicam-se aos modelos da DP: existe uma actual falta de compreensão do papel preciso dos genes ligados à família na etiologia da DP e até que ponto eles contribuem para as formas esporádicas da doença.

Estas questões tornaram extremamente difícil a produção de um modelo de DP atransgénico, que reproduz fielmente a acumulação de a-syn e a formação de LB, por sua vez, levando a um padrão de neurodegeneração e deficiências comportamentais que correspondem aos observados em populações clínicas.

Os atuais modelos transgênicos recapitulam apenas algumas dessas características e, como resultado, provaram ter pouca validade preditiva para avaliar a eficácia de potenciais DMTs. Em contraste, os modelos de toxinas químicas da DP ainda são amplamente utilizados devido à sua capacidade de reproduzir fielmente a neurodegeneração seletiva de DA característica da DP.

Modelos de toxinas químicas da DP

Ao longo do último meio século, uma grande variedade de compostos tóxicos tem sido empregada para modelar o padrão de neurodegeneração observado na DP. Destes, quatro modelos de lesão química surgiram como os mais amplamente utilizados para pesquisas pré-clínicas, e seus efeitos foram extensivamente caracterizados.

Estes incluem 6-hidroxidopamina (6-OHDA), um análogo da catecolamina; 1-metil-4-fenil1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), um análogo de opioide sintético; rotenona, um pesticida; e paraquat, um herbicida102 (Tabela 2). Outro modelo de DP não transgênico é baseado na injeção de fibrilas pré-formadas (PFFs; proteínas a-syn monoméricas recombinantes convertidas na forma agregada fibrilar) nos cérebros de animais, o que desencadeia hiperfosforilação de proteínas a-syn endógenas e provoca patologia semelhante a LB no SN pars compacta (SNpc)87,88 (Tabela 2).

Esses modelos baseados em toxinas podem induzir, em graus variados, agregação a-syn e neurodegeneração seletiva de neurônios DA na via nigroestriatal, uma deficiência notável de seus modelos transgênicos.

As vias envolvidas no desencadeamento da morte celular e a extensão da perda de neurônios DA, no entanto, variam substancialmente entre os modelos, que foram revisados ​​em detalhes em outro lugar.103 Em última análise, o resultado da perda de células DA na DP é que os núcleos motores do corpo estriado não são mais capazes de manter função fisiológica normal, causando uma ampla gama de habilidades motoras prejudicadas.

No entanto, a perda de neurônios DA nigrostriatais não é, por si só, um modelo de DP em si, mas sim um parkinsonismo mais geral, caracterizado por um espectro mais amplo de sintomas motores.104

Até este ponto, embora alguns modelos baseados em toxinas, incluindo PFF, MPTP crônico e administração de rotenona, possam induzir agregados a-syn e formação semelhante a LB, eles são distintos das inclusões características de LB na DP, e da distribuição geral desses agregados não reflete o padrão observado em PDbrains.102

Esses modelos também são limitados em sua capacidade de modelar a natureza progressiva da DP e a disseminação da patologia para outras regiões do cérebro, uma vez que os pacientes com DP também sofrem neurodegeneração em regiões subcorticais e, eventualmente, corticais nos estágios mais avançados da doença.105

Em resumo, os modelos baseados na exposição a toxinas demonstram algumas semelhanças com as patologias observadas na DP; no entanto, o mecanismo de morte celular induzido pelas toxinas é provavelmente distinto daqueles subjacentes à perda neuronal na DP.106,107 É digno de nota que os esquemas de dosagem típicos para modelos de toxinas químicas da DP ocorrem ao longo de dias a semanas, enquanto o curso da DP se desenvolve ao longo de décadas e progride ao longo de anos.

Essas limitações sugerem que modelos baseados na exposição a toxinas destinados a induzir a morte seletiva de neurônios DA na via nigroestriatal apresentam um quadro incompleto da DP e fornecem uma explicação de por que os esforços para identificar DMTs em tais modelos não foram eficazes em ensaios clínicos.12

Modelos de vetores virais para PD e ADVantagens de sistemas de vetores virais

Os sistemas de entrega de vetores virais oferecem diversas vantagens que são difíceis de alcançar com outras abordagens.108 Primeiro, os sistemas de vetores virais fornecem um controle robusto sobre a expressão temporal do gene de interesse.

Em segundo lugar, o envelhecimento é o principal fator de risco dos distúrbios do espectro da AD-PD, e a possibilidade de entregar o vetor em qualquer ponto da vida do animal representa uma grande vantagem para o desenho do estudo. Terceiro, os vetores virais apoiam a entrega e expressão local do transgene, permitindo assim a direcionamento preciso e específico de regiões cerebrais de interesse.

Quarto, manipulações precisas de dosagem podem ser facilmente conseguidas com o uso de vetores virais. Quinto, o modelo de interesse pode ser criado em múltiplas espécies animais, desde pequenos roedores até grandes primatas não humanos.

Sexto, diferentes variações de genes podem ser facilmente feitas para obter um fenótipo de interesse. Sétimo, a versatilidade e flexibilidade das diferentes plataformas de vetores utilizadas para transferência de genes mediada por vírus para o sistema nervoso central são vastas.

Os sistemas virais, incluindo vetores adeno-associados recombinantes (UAVs) e vetores lentivirais (LVs), suportam de forma eficiente e robusta a expressão gênica de curto ou longo prazo, respectivamente, tanto local quanto globalmente. , tanto em termos de esforço como de custo, em relação a outros modelos de doenças.

Modelos de vetores virais AD e PD: AAVs e LVs

A abordagem de vetor viral para modelar fenótipos de AD e PD in vivo tem sido utilizada por vários grupos diferentes usando rAAVs ou LVs. Desde a sua primeira utilização no início do milénio, uma variedade de modelos baseados em vírus foram desenvolvidos e utilizados para a DA.

Os modelos iniciais de AAV-tauopatia exploraram AAV2/2 para expressar a proteína humantau P301L nos cérebros de camundongos e ratos.109,110 Nestes estudos, o vetor AAV-tau-P301L foi injetado no prosencéfalo basal de ratos adultos, levando ao aumento dos níveis de tau. por pelo menos 8 meses após a transdução. Significativamente, agregados de tau e hiperfosforilados semelhantes a NFTs foram encontrados 3 a 4 semanas após a transdução.110,111

Estes estudos forneceram a primeira prova de conceito de que a injeção de AAV-P301L tau poderia resultar na expressão persistente da proteína e na sua agregação em camundongos e ratos.

Consistentemente, a injeção de AAV do tipo selvagem (WT) ou APP triplo mutante resultou na formação de placas Ab, mas sem neurodegeneração evidente. Esses achados contrastam com as observações acima de que AAV-WTtau ou AAV-P301L tau foram capazes de causar neurodegeneração significativa de neurônios piramidais HP.112

Em experimentos mais recentes, o AAV2/5 foi usado para fornecer WT tau e o vetor de controle GFP no HP dorsal de ratos Fischer 344 idosos.113 Ambos os vírus foram expressos de forma robusta em neurônios HP e levaram a estrutura axonal aberrante, degeneração axonal e fragmentação de tau em Axônios HP comparados aos axônios de controle que expressam GFP que pareciam normais.

Em outro modelo, a tau P301L expressa a partir do promotor da sinapsina I humana foi entregue pelo vetor AAV2/9 no córtex entorrinal lateral, o que permitiu aos autores detectar múltiplas formas de variantes de tau fosforiladas e agregadas antes da perda de sinapses da via perfurante e da neurodegeneração.114

Esses dados apoiam a utilidade de abordagens baseadas em AAV na DA, particularmente na modelagem de alterações patológicas precoces, como degeneração e degradação axonal. Vários estudos utilizaram modelos baseados em vírus destinados a induzir outros aspectos patológicos de LOAD.115,116 Por exemplo, AAV-BRI-Ab42 e Vetores AAV-BRI-Ab40 foram utilizados para expressão e secreção controlada de peptídeos Ab em roedores HP.116

Notavelmente, animais injetados com AAV-BRIAb42-demonstraram que esses vetores foram capazes de induzir a formação de placas, mas isso não foi observado com a expressão de rAAV2/1-BRIAb40.

Em outro estudo, AAV2/2 foi usado para entregar Ab40 e Ab42, um fragmento C-terminal de APP contendo os peptídeos Ab (C100) e um mutante V717F de C100 para HP e cerebelo de camundongos.

Curiosamente, os mutantes Ab42 e V717F demonstraram maior indução de microgliose e ruptura da barreira hematoencefálica (BHE) em comparação com as formas Ab40, mas não ativaram a formação de placas, indução de astrócitos ou neurodegeneração. O uso da tecnologia AAV e LV para expressar várias formas de Ab e seus precursores continuará a ser um método essencial para estudar seu papel no LOAD.117

Mais recentemente, o LV tem sido usado para expressar TDP -43, Ab42 ou ambos no córtex motor de ratos, o que descobriu que a perda de TDP -43 implica a microglia como causa da degeneração sináptica observada no LOAD. 118

Além disso, o lenti-TDP-43 desencadeou alterações no processamento de APP associado à produção de Ab42 e induziu atividade de caspases e neuroinflamação, o que foi observado de forma semelhante com o lenti-Ab42.

A expressão combinada das proteínas TDP-43 e Ab42 resultou em um resultado semelhante ao TDP-43 sozinho, mas com o recurso adicional de perda neuronal, sugerindo um possível efeito sinérgico entre os dois fatores. Outro estudo usando LVs para expressar TDP-43 no córtex motor encontrou alteração no metabolismo de aminoácidos, estresse oxidativo e morte neuronal.119

Esses resultados juntos demonstram a utilidade de sistemas modelo de DA baseados em LV para elucidar os principais fatores patogênicos relacionados à disfunção proteica implicada na DA, enquanto Ab e tau foram extensivamente testados em LOAD, consistente com a noção de longa data de que Ab é um suspeito chave na patogênese da DA . No entanto, os contínuos fracassos nos ensaios de medicamentos destinados a reduzir os níveis de amiloide exigem que os esforços sejam reorientados para outros potenciais culpados.

Vários estudos recentes demonstraram que a APOEε4 pode contribuir para a toxicidade associada ao fenótipo da DA e, até o momento, a APOE continua sendo o fator de risco genético mais significativo e replicável para a DA.120

Dado o papel da APOEε4 na patogênese da DA e o potencial efeito protetor da isoforma ε2, Hu e colegas121 geraram modelos de camundongos usando isoformas AAV8-APOE impulsionadas pelo promotor GFAP especificamente expresso em astrócitos em todas as regiões do cérebro, o que resultou em um aumento geral nos níveis de APOE em todo o cérebro do rato.

A superexpressão de APOEε4 mediada por vírus nos camundongos APOEε4-TR aumentou as partículas de lipoproteína APOE pouco lipídicas e diminuiu o colesterol associado à APOE em camundongos APOEε4-TR. Por outro lado, a superexpressão de APOEε2 em APOEε4-TR camundongos aumentaram a lipídicação da APOE e o colesterol associado.

Além disso, a superexpressão de APOEε4 elevou os níveis de Ab endógeno, enquanto a superexpressão de APOEε2 tendeu a diminuir o Ab endógeno. Com base nesses dados, os autores sugerem que o aumento da APOEε2 nos portadores da APOEε4 é uma estratégia benéfica para o tratamento da DA, enquanto o aumento da APOEε4 nos portadores da APOEε4 é prejudicial. Em outro estudo, a injeção intracerebral direta foi realizada utilizando AAV para expressar APOEε2.

O estudo relatou que a superexpressão de APOEε2 reduziu acentuadamente os níveis de Ab solúveis (incluindo oligoméricos) e insolúveis no cérebro, bem como a carga amilóide, em dois modelos de amiloidose cerebral em camundongos, cuja patologia depende da expressão de isoformas de APOEε4 de camundongo ou humana.122

Zhao et al.122 mostraram ainda que uma redução generalizada do Ab cerebral pode ser alcançada através de uma única injeção do vírus através da entrega intra-talâmica de AAV expressando APOEε2.

Coletivamente, esses dados sugerem que a entrega do gene APOEε2 por AAV, usando um AAV, pode resgatar os efeitos prejudiciais de APOEε4 na patologia amiloide cerebral; assim, esta abordagem pode representar um caminho terapêutico viável para tratar ou prevenir LOAD.

For more information:1950477648nn@gmail.com