O Método de Monitorar e Avaliar a Função do Transplante Renal: (Espectroscopia Raman Aprimorada de Superfície)

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PARTE Ⅰ: Correlação de impressões digitais espectroscópicas Raman com superfície aprimorada de urina de receptor de transplante renal com parâmetros de função renal

Zhongli Huang, Shijian Feng & et al.

Monitoramento de rotina detransplante de rimfunção é necessária para o tratamento padrão no manejo pós-transplante, incluindo medições frequentes de creatinina sérica com ou sem biópsia renal. No entanto, a invasividade desses métodos com potencial para complicações clinicamente significativas os torna menos do que ideais. O objetivo deste estudo foi desenvolver uma ferramenta não invasiva para monitorartransplante de rimfunção usandoSuperfície aprimorada Espectroscopia Raman(SER). Amostras de urina e sangue foram coletadas detransplante de rimreceptores após a cirurgia. SERS à base de nanopartículas de prata (Superfície aprimorada Espectroscopia Raman) da urina foram medidos e avaliados usando análise de mínimos quadrados parciais (PLS). O SERS(Superfície aprimorada Espectroscopia Raman)espectros foram comparados com marcadores químicos convencionais derimtransplantefunção para avaliar sua capacidade preditiva. Um total de 110transplante de rimos receptores foram incluídos neste estudo. Os resultados do PLS mostraram correlação significativa com a proteína da urina (R2=0.4660, p<><0.01), and="" urea(r2=""><0.01).furthermore, the="" prediction="" of="" the="" blood="" markers="" of="">transplante de rimfunção usando o SERS de urina(Superfície aprimorada Espectroscopia Raman)espectros foi indicado por R2=0.7628(p<0.01)for serum="" creatinine="" and="" r2="0.6539" for=""><0.01)for blood="" urea="" nitrogen.="" this="" preliminary="" study="" suggested="" that="" the="" urine="">(Superfície aprimorada Espectroscopia Raman)A análise espectral pode ser usada como um método conveniente para a avaliação rápida detransplante de rimfunção.

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Transplante de rimrepresenta um tratamento padrão ouro para pacientes com doença renal terminal (ESRD)!. Fatores do doador e receptor, fatores cirúrgicos e imunológicos podem contribuir ou causar a função prejudicada do enxerto imediatamente após a operação de transplante, denominada função tardia do enxerto, ou em qualquer outro momento após o transplante. mostrando aumento da creatinina sérica (SCr), juntamente com outros achados potenciais, incluindo diminuição do volume de urina e aumento da pressão arterial, grau de piúria e proteinúria, rejeição aguda (RA), necrose tubular aguda (NTA) e toxicidade por ciclosporina/tacrolimus são alguns dos as etiologias mais comuns derimtransplantedisfunção7-9. Se essas questões não forem devidamente identificadas e tratadas, podem levar à deterioração permanente dorimtransplantefunção. Assim, pacientes comrimtransplantesprecisam de monitoramento de rotina de seusrimtransplantefuncionam como parte do gerenciamento pós-transplante10-1.

Os métodos convencionais para avaliar o estado funcional dos rins transplantados incluem avaliação clínica dos pacientes com base no estado do volume e débito urinário, medições seriadas da SCr com taxas de filtração glomerular estimadas (TFGe) e até exames baseados em isótopos em raras circunstâncias2,13. Se houver suspeita de RA, geralmente são realizadas ultrassonografias de transplante renal seguidas de biópsia de transplante para confirmar um diagnóstico patológico para a decisão do plano de tratamento. O procedimento da biópsia pode ser desconfortável para os pacientes e pode levar a complicações clinicamente significativas, como sangramento ou perda do enxerto nos casos mais extremos. Portanto, uma ferramenta clínica não invasiva que determina com precisão o ktransplante de idneyé definitivamente desejável tanto do ponto de vista do paciente quanto do clínico.

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Espectroscopia Raman(RS) é uma ferramenta especializada e não invasiva que emite uma luz laser incidente através de uma amostra de fluido, resultando em fótons dispersos que produzem uma mudança em um comprimento de onda dependente da composição química do fluido'4-17. A intensidade do espalhamento Raman é proporcional à magnitude da mudança na polarização molecular. Anteriormente, a aplicação do RS(Espectroscopia Raman)foi limitado por causa de sua baixa sensibilidade, altos custos e falta de análise acessível no local8. O recente avanço tecnológico do RS trouxe um RS prontamente disponível, portátil e relativamente barato (Espectroscopia Raman) dispositivo9.Superfície aprimorada Espectroscopia Raman(SERS) é um subtipo de RS. projetado especificamente para aumentar sua sensibilidade de analitos de baixa concentração, em que o tratamento de uma amostra com um material de realce amplifica significativamente os campos eletromagnéticos de moléculas de adsorbato que são gerados pela excitação de plasmons de superfície localizados (LSP)20. Vários SERS(Superfície aprimorada Espectroscopia Raman) materiais de aprimoramento foram descritos (por exemplo, metais coloidais e metais ásperos, incluindo ouro, prata e cobre). Esses intensificadores de metal podem aumentar a intensidade do sinal Raman em até 10 a 10 graus de dobra2. Nosso estudo anterior demonstrou que nossas nanopartículas de prata coloidal caseiras (Ag NP) são um material de aprimoramento confiável e reprodutível para SERS(Superfície aprimorada Espectroscopia Raman). O objetivo do presente estudo foi avaliar a viabilidade do uso de SERS baseado em Ag NP(Superfície aprimorada Espectroscopia Raman)de amostras de urina dos pacientes para determinar atransplante de rimfunção em comparação com seus marcadores bioquímicos convencionais.

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MÉTODO E ANIMAL

Amostra e coleta de dados. Amostras de urina e sangue foram coletadas derimtransplantepacientes do Departamento de Urologia do Hospital da China Ocidental na Universidade de Sichuan. Essas amostras foram coletadas simultaneamente dentro de 3 dias darimtransplantecirurgia. Seguindo um procedimento operacional padrão, as amostras de sangue foram enviadas para o laboratório de bioquímica clínica no Hospital da China Ocidental para determinação de SCr e nitrogênio ureico no sangue (BUN). As amostras de urina foram coletadas pelos próprios pacientes utilizando-se um tubo estéril de 50 mL. As amostras de urina foram então entregues ao laboratório do hospital dentro de 8 h após a coleta. Os tubos de urina foram centrifugados a 1500×g por 10 min para remover as células e detritos, e apenas os sobrenadantes resultantes foram armazenados em alíquotas a -80 graus de geladeira antes do uso. Os níveis de proteína e creatinina nas amostras de urina foram determinados no Laboratório de Química Clínica do Hospital Geral de Vancouver (Vancouver, British Columbia, Canadá).

Nanopartículas de prata (Ag) e preparação de amostras de urina. Colóides Ag foram preparados usando cloridrato de hidroxilamina e nitrato de Ag como descrito anteriormente23,24. Resumidamente, a vidraria usada nos procedimentos a seguir foi limpa com loção de ácido crômico e, em seguida, enxaguada completamente com água milli-O antes do uso., 4,5 mL de solução de NaOH 0.1 M foi rapidamente adicionado a 5 mL de 6× 10-2M solução de cloridrato de hidroxilamina e a mistura foi agitada até formar uma suspensão homogênea. A solução resultante foi misturada com 90 mL de 1,11×10-3M AgNO, solução aquosa em temperatura ambiente até a presença de uma cor cinza-leitosa. Esta suspensão colóide Ag foi então armazenada no escuro antes do uso. Para garantir a forma e tamanho consistentes do Ag NP, todas as etapas e processos experimentais foram padronizados. Uma vez prontos para uso, os colóides Ag foram peletizados por centrifugação a 10,000×g por 10 min. Uma imagem de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de nanopartículas de Ag foi tirada com os tamanhos do Ag NP sintetizado seguindo uma distribuição normal com um diâmetro médio de 35±5 nm (Supl. Figura 1). O Ag NP peletizado foi então misturado com amostras de urina na proporção de 1:1 em uma placa de alumínio retangular (volume total de 10 μL). O mesmo lote de Ag NP foi usado para uma rodada de SERS(Superfície aprimorada Espectroscopia Raman)medição de todas as amostras de urina ao mesmo tempo para evitar a provável inconsistência do Ag NP. As medições repetidas (réplicas técnicas) das mesmas amostras foram realizadas usando o mesmo ou um lote diferente do Ag NP. A mistura de colóide Ag/urina foi então seca ao ar à temperatura ambiente por 60 min antes do SERS(Superfície aprimorada Espectroscopia Raman)medição para facilitar a agregação molecular. Caso as amostras preparadas apresentassem o chamado "efeito anel de café" ou formação de cristais evidentes (poucos casos), elas eram refeitas até a ausência desse problema. De nota, acredita-se que os agentes de agregação aumentam a intensidade do sinal de SERS(Superfície aprimorada Espectroscopia Raman), no entanto, optamos por renunciar ao uso de tais agentes na esperança de agilizar o processo de preparação da amostra.

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SERS(Superfície aprimorada Espectroscopia Raman)medição. Os espectros SERS da mistura colóide Ag/urina foram medidos com um espectrômetro Raman comercial (AURA, Verisante Technology, Vancouver, BC, Canadá) equipado com um laser de diodo de 785 nm para excitação Raman, semelhante ao protótipo relatado anteriormente por Zhao et al. 25,26. O feixe de laser foi entregue à amostra através de uma única fibra com um diâmetro de núcleo de 200 μm. Os sinais brutos foram coletados por uma sonda consistindo de uma fibra de excitação central cercada por cento e dez 100-um fibras de coleta de diâmetro do núcleo e depois entregues ao espectrômetro. Cada SERS(Superfície aprimorada Espectroscopia Raman)O espectro foi adquirido com potência de laser de excitação de 150 mW e tempo de integração de um segundo com resolução espectral de 8 cm-lin na faixa de número de onda de 500-1800 cm-1. Para cada gota ou amostra seca, três espectros foram medidos com manchas de toda a área da amostra na lâmina de alumínio, e a média foi usada na análise de dados subsequente. Um monitor também foi utilizado para minimizar a heterogeneidade de cada teste da mesma amostra, visualizando o espectro simultaneamente durante a medição. Se o espectro visualizado fosse muito diferente um do outro, outros espectros 3-6 eram obtidos até que a consistência fosse alcançada.

Análise de dados. O SERS resultante(Superfície aprimorada Espectroscopia Raman)O espectro das amostras de urina na faixa de comprimento de onda de 500-1800-1 cm foi extraído subtraindo o fundo de fluorescência usando o algoritmo de ajuste polinomial de quinta ordem27. A regressão de mínimos quadrados parciais (PLS) com validação cruzada leave-one-out (LOO-CV) de todo o espectro foi usada para quantificar os parâmetros bioquímicos derimtransplanteincluindo proteína na urina, creatinina na urina (UCR), uréia na urina, SCr e BUN. As concentrações desses parâmetros obtidas a partir de análises bioquímicas de sangue/urina foram usadas como padrão ouro para comparar o SERS(Superfície aprimorada Espectroscopia Raman)análise de urina. O software TIBCO STATISTICA (Versão 10, TIBCO SOFTWARE Inc., Palo Alto, CA, EUA) foi usado para análise de regressão PLS.

Aprovação ética. Este estudo (Número de Aprovação: 2019(748)) foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital da China Ocidental da Universidade de Sichuan, e todos os participantes assinaram o consentimento informado antes da coleta da amostra. O comitê de ética da Universidade de Sichuan e do Hospital da China Ocidental confirmou que todas as atividades de pesquisa foram realizadas de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes.

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RESULTADO

Um total de 110rimtransplantedestinatários (80 homens e 30 mulheres; idade média da coorte 41,5 anos) participaram deste estudo. Os resultados da bioquímica da urina revelaram que o intervalo de proteína na urina foi de 0.05-6.83 g/L, UCR 1.03-22.49 mmol/L e uréia urinária 29.6-535. 8 mmol/L, os resultados bioquímicos dos exames de sangue indicaram que o intervalo de SCr foi de 39-1461 umol/L e BUN 3.2-25,1 mmol/L. As características demográficas dos pacientes e seus resultados de exames de urina e sangue foram resumidas na Tabela 1.

Tabela 2. Resumir SERS relatados anteriormente(Superfície aprimorada Espectroscopia Raman)posições de pico e atribuições de modo de vibração1.

O SERS(Superfície aprimorada Espectroscopia Raman)espectros de misturas de Ag NP/urina foram medidos nas mesmas condições (1 dia após a preparação da mistura). O SERS(Superfície aprimorada Espectroscopia Raman)espectros de amostras revelaram muitas bandas de vibração dominantes, o que implica uma forte interação entre o colóide Ag e as moléculas de urina, resultando no aumento do sinal. Conforme mostrado na Fig.1, o SERS principal(Superfície aprimorada Espectroscopia Raman)os picos (atribuições vibracionais) de urinas foram atribuídos a 1285,1004, 702 e 1383 cm-1, que corresponde bioquimicamente à banda de citosina, ureia, colesterol e CH3, respectivamente8. Outras atribuições bioquímicas do SERS(Superfície aprimorada Espectroscopia Raman)os picos mostrados na Fig.1 estão resumidos na Tabela 2. Para explorar se o SERS(Superfície aprimorada Espectroscopia Raman)pode ser usado como uma ferramenta não invasiva para avaliar o estado derimtransplantes, os modelos gerados por PLS foram utilizados para prever as concentrações derimtransplantemarcadores de função na urina e no sangue. A Figura 2 mostrou os resultados da análise PLS da proteína da urina, UCR e uréia na urina em comparação com o SERS(Superfície aprimorada Espectroscopia Raman) spectra, respectively. As a reference for the prediction ability of PLS analysis, R'>{{0}}.67 indicou a precisão preditiva alta, intervalo de0.33-0.67 a precisão preditiva moderada, intervalo R' de 0.19-0.33 a baixa precisão preditiva, e R'<0.19 unacceptable="" variables2.="" the="" urine="" results="" revealed="" an="" r²="0.4660（moderate）" for="" urine=""><0.001）, r²="0.8106（high）for"><0.001）, and="" r²="0.7808（high）" for="" urine=""><0.001）. figure="" 3="" showed="" the="" results="" of="" pls="" analysis="" of="" the="" blood="" scr="" and="" bun="" as="" compared="" to="" the="" urinary="">(Superfície aprimorada Espectroscopia Raman)espectros, respectivamente. Os resultados do sangue revelaram um R²=0.7628（alto） para SCr （p<0.001）and r²="0.6539" （moderate="" to="" high）for=""><0.001）. because="" the="" low="" concentrations="" of="">rimtransplantebiomarcadores de função – a função normal do transplante não é uma preocupação no atendimento clínico, calculamos o desvio padrão (DP) de suas altas concentrações de acordo com o nível limítrofe. Para a proteína da urina<0.3 g/l,="" the="" calculated="" sd="" was="" 0.33="" g/l,="" and="">{{0}},3 g/L, o SD 0,44 g/L.Para o UCr<7 mmol/l,="" the="" calculated="" sd="" was="" 1.69="" mmol/l,="" and="">7 mmol/L, o SD 1,64 mmol/L. Para a uréia na urina<266 mmol/l,="" the="" sd="" was="" 47.88="" mmol/l,="" and="">266 mmol/L, o SD29,57 mmol/L, Os biomarcadores séricos são usados ​​principalmente para arimtransplantefunção na prática clínica. Para o SC<110 mmol/l,="" the="" sd="" was="" 87.98="" mmol/l,and="">110 mmol/L, o SD 108,21 mmol/L. Para o BUN<7.7 mmol/l,="" the="" sd="" was="" 2.15,="" and="">7,7 mmol/L, o SD 2,32 mmol/L.

Figura 2. Os modelos gerados pela análise PLS foram usados ​​para prever as concentrações de moléculas na urina.Análise PLS para proteína na urina (a), UCR (b) e uréia na urina (c). Os resultados demonstraram que R2=0.4660 para proteína na urina (a) (p<0.001), r2="0.8106" for="" ucr="" (b)=""><0.001), r2="0.7808" for="" urine="" urea="" (c)=""><>	Figura 3. Os modelos gerados pela análise PLS foram usados ​​para prever as concentrações de biomarcadores sanguíneos para a função do transplante renal.Os resultados mostraram que R2=0.7628 para SCr (a) (p<0.001) and="" r2="0.6539" for="" bun="" (b)=""><0.001),>

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