A interação entre fibrilas de proteína de soro de leite com nanotubos de carbono ou nano-cebolas de carbono Parte 1

Resumo: Fibrilas de isolado proteico de soro de leite (WPI) foram preparadas utilizando um processo de indução de hidrólise ácida.

À medida que as pessoas prestam cada vez mais atenção a uma vida saudável, a memória tornou-se gradualmente um tema de grande preocupação. A fibra é um ingrediente alimentar que muitas pessoas geralmente ignoram. Também está intimamente relacionado à saúde humana.

A fibra é uma celulose vegetal indigerível que pode estimular o peristaltismo intestinal, promover a defecação, absorver e reduzir lipídios no sangue, açúcar no sangue e colesterol no corpo humano e reduzir a ocorrência de obesidade e doenças cardiovasculares. Além disso, a fibrila também pode regular o equilíbrio da microecologia intestinal, promover a absorção de nutrientes e melhorar a imunidade.

Ao mesmo tempo, cada vez mais estudos mostram que a fibrila também está intimamente relacionada à memória. O consumo de fibras pode promover a saúde intestinal, melhorar a função metabólica humana e melhorar a imunidade do corpo. Estes estão intimamente relacionados com o sistema nervoso humano, e a saúde do sistema nervoso é um dos pilares importantes da saúde humana.

Além disso, nutrientes como vitamina B, vitamina E e zinco rico em fibras também podem promover o desenvolvimento e funcionamento normais do sistema nervoso, melhorar a cognição humana e a capacidade de aprendizagem e melhorar a memória.

Em resumo, ao mesmo tempo que promove a saúde física, a fibrila também pode melhorar a memória e a inteligência humanas. Precisamos desenvolver bons hábitos alimentares e aumentar adequadamente a ingestão de alimentos que contenham fibras cruas, como aveia, batata doce e vegetais de folhas verdes, para manter uma boa saúde e promover o desenvolvimento saudável do sistema nervoso. A memória nos ajuda a aprender rapidamente e a buscar uma melhor qualidade de vida, por isso devemos ser positivos. Percebe-se que precisamos melhorar nossa memória, e Cistanche pode melhorar significativamente a memória porque também pode regular o equilíbrio dos neurotransmissores, como aumentar os níveis de acetilcolina e fatores de crescimento, que são muito importantes para a memória e o aprendizado. Além disso, Cistanche também pode melhorar o fluxo sanguíneo e promover o fornecimento de oxigênio, o que pode garantir que o cérebro obtenha nutrição e energia suficientes, melhorando assim a vitalidade e a resistência do cérebro.

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Nanotubos de carbono (CNTs) e nano-cebolas de carbono (CNOs) foram produzidos através da deposição química catalítica de vapor (CVD) de metano. As fibrilas WPI – CNTs e as fibrilas WPI – CNOs foram preparadas por meio de síntese hidrotérmica a 80 ◦C.

Os compósitos foram caracterizados por análises de MEV, TEM, FTIR, DRX, Raman e TG. A interação entre fibrilas WPI CNTs e CNOs foi estudada. As fibrilas WPI com CNTs e CNOs formaram géis e filmes uniformes. CNTs e CNOs estavam altamente dispersos nos géis. Hidrogéis de fibrilas WPI com CNTs (ou CNOs) podem ser novos materiais com aplicações na medicina ou em outras áreas.

Os CNTs e CNOs encurtaram as fibrilas WPI, o que pode ter importante valor de pesquisa para a cura de doenças fibrosas, como as doenças de Parkinson e Alzheimer. O FTIR revelou que CNTs e CNOs tiveram interações com fibrilas WPI.

A análise de XRD sugeriu que a maioria dos CNTs estava envolta em fibrilas WPI, enquanto os CNOs estavam parcialmente envoltos. Isto ajudou a aumentar a biocompatibilidade e reduzir a citotoxicidade dos CNTs e CNOs. Estudos de espectroscopia HR-TEM e Raman mostraram que o nível de grafitização dos CNTs foi maior que dos CNOs.

Após a hibridização com fibrilas WPI, mais defeitos foram criados nos CNTs, mas alguns defeitos originais foram descartados nos CNOs. Os resultados do TG indicaram que uma nova fase de WPIfibril – CNTs ou CNOs foi formada.

Palavras-chave: fibrilas de proteína de soro de leite; nanotubos de carbono; nano-cebolas de carbono; compósitos; interação.

1. Introdução

O whey protein é comum e facilmente obtido a partir do leite bovino. Foi de importância prática preparar fibrilas de isolado de proteína de soro de leite (WPI). Hoje em dia, as fibrilas amilóides auto-montadas baseadas em componentes do soro do leite são um importante campo de pesquisa [1–3].

Geralmente, as fibrilas amilóides são derivadas da associação com amiloidose. Por exemplo, o peptídeo isletamilóide está associado ao diabetes e a proteína -amilóide está associada à doença de Alzheimer [4].

As fibrilas proteicas também podem ser sintetizadas in vitro. Além disso, a lactoglobulina (-lg) pode auto-montar proteínas fibrilares [5,6]. O -lg é uma proteína globular com peso molecular de 18.400 g·mol−1 e raio de cerca de 2 nm [7].

Pode induzir a formação de fibrilas sob aquecimento prolongado (6–24 h) a 80 ◦C e tem pH 2 e baixa força iônica [8]. O comprimento médio das fibrilas é de 1–8 µm, com um diâmetro de cerca de 4 nm [9].

O material proteico nessas fibrilas é mantido unido por folhas intermoleculares [10]. Durante a formação da fibrila, a quantidade de folhas aumenta. Nanotubos de carbono (CNTs) são tubos ocos feitos de folhas de grafite multicamadas girando e enrolando em torno do mesmo eixo em um determinado ângulo [11].

Seus diâmetros variam de 0,4 (SWCNTs) a 100 nm (MWCNTs); seu comprimento pode atingir vários mícrons; e possuem propriedades mecânicas superiores, estabilidade química e uma grande área superficial específica [12]. Nanotubos de carbono são frequentemente usados ​​como materiais de enchimento para preparar nanocompósitos para melhorar o comportamento mecânico dos materiais de matriz.

As aplicações biológicas dos nanotubos de carbono também têm sido amplamente estudadas, como em biossensores, distribuição de medicamentos e vacinas, engenharia de tecidos [13] e novos biomateriais [14]. No entanto, os CNTs puros têm baixa solubilidade e potencial citotoxicidade [15]. Biomacromoléculas ligadas, como proteínas, DNA e RNA, podem promover a dispersão de CNTs [16].

As interações físicas com biomacromoléculas podem alterar sua atividade biológica in vivo [17]. Após funcionalização e modificação, os CNTs podem carregar diferentes tipos de medicamentos para fins específicos [18]. Sistemas baseados em CNT biocompatíveis podem carregar vários agentes terapêuticos, de direcionamento e de sondagem para terapia do câncer.

Foi comprovado que os CNTs funcionalizados podem atravessar a membrana plasmática através de diferentes mecanismos, principalmente através da endocitose [19–21]. As nano-cebolas de carbono (CNOs) compreendem múltiplas camadas concêntricas de fulerenos.

Suas estruturas gaiola dentro da gaiola geram algumas propriedades físico-químicas únicas. Ao contrário de quaisquer outros alótropos de carbono [22,23], os CNOs são igualmente importantes como os CNTs e os fulerenos, que são ideais para aplicações de distribuição de medicamentos devido à sua capacidade de permanecer na circulação sistêmica por horas, aumentando suas chances de acessar o local alvo [24–28].

Na engenharia de tecidos, os andaimes CNO modificados exibem capacidade de regeneração de tecidos [28]. CNOs fluorescentes vermelhos distantes foram desenvolvidos para fins de imagem celular [29].

Apesar deste imenso potencial, parece que o papel deste novo nanossistema no campo biomédico tem sido esquecido há muitos anos. A pesquisa sobre fibrilas de proteínas – sistemas de nanomateriais de carbono será de grande importância no tratamento de doenças humanas, na redução da citotoxicidade dos nanomateriais de carbono e no desenvolvimento de novas tecnologias.

A formação de fibrilas amilóides in vivo pode levar a uma variedade de doenças, como doenças neurodegenerativas de Alzheimer e Parkinson. Os pesquisadores estão procurando substâncias que possam inibir a fibrose amilóide ou destruir as fibrilas amilóides [30,31]. A Tabela 1 resume alguns dos estudos sobre a interação de nanomateriais de carbono com fibrilas amilóides [32].

Alguns estudos mostraram que nanomateriais de carbono podem interagir com várias proteínas biológicas [33]. Os CNTs são cobertos por macromoléculas biológicas adsorvidas na solução biológica devido à sua alta área superficial específica e superfície hidrofóbica [34].

As proteínas adsorvidas se reúnem na superfície dos nanomateriais de carbono para formar uma "coroa proteica" [34]. A interação entre CNTs e proteínas também desempenha um papel importante na formação de folhas.

Ghule et al. descobriram que nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNTs) forneciam superfícies de interação para adsorção ou encapsulamento de proteínas. Isso poderia inibir a capacidade da superfície apolar das proteínas de se ligar às fibrilas proteicas, evitando assim que a proteína sofra mais fibrose [35].

Jana e Sengupta [36] e Wei et al. [37] estudaram a automontagem do peptídeo A na presença de nanotubos de carbono de parede única (SWCNTs) usando simulação de dinâmica molecular (MD). O peptídeo A é um peptídeo anfifílico curto e sua agregação está intimamente relacionada à patogênese da doença de Alzheimer [38]. O forte efeito hidrofóbico dos CNTs pode ajudar a localizar peptídeos na superfície dos SWCNTs.

Isto evita a difusão e inibe a fibrose dos peptídeos. Proteínas como insulina, lisozima, -lactoglobulina e citocromo c podem padronizar o grafite [39,40]. Esta grafite nanopadronizada é capaz de orientar o alinhamento das fibrilas amilóides [39]. A interação entre fulerenos e materiais proteicos também foi estudada.

Através de medições de fluorescência ThT, Kim e Lee descobriram que o fulereno poderia inibir a fibrose da proteína. O fulereno pode ligar-se especificamente ao motivo hidrofóbico central KLVFF, dificultando assim a agregação do peptídeo A [41].

Verificou-se que os fulerenos hidratados poderiam não apenas destruir as fibrilas amiloides maduras, mas também prevenir a formação de novas fibrilas [42]. Podolski et al. descobriram que os fulerenos hidratados poderiam efetivamente bloquear a agregação de A 25–35 [43].

Existem poucos estudos sobre a interação entre CNOs e fibrilas amilóides. Os CNOs são um novo alótropo com baixa toxicidade e boa biocompatibilidade. O estudo da interação entre CNOs e fibrilas amilóides é desejável.

Por outro lado, alguns nanomateriais de carbono foram combinados com macromoléculas biológicas para preparar nanocompósitos híbridos para engenharia de tecidos ou administração de medicamentos devido às suas vantagens mecânicas e elétricas [55–57].

As fibrilas amilóides também possuem certos comportamentos mecânicos e superfícies de aminoácidos, que são usados ​​para preparar nanofios [58], hidrogéis [59], estruturas de células fibrosas [60,61] e filmes orgânicos funcionais sólidos [62]. As proteínas são fixadas às superfícies dos CNTs na forma de monômeros ou oligômeros [63,64], para melhorar sua solubilidade em água e reduzir sua citotoxicidade.

Os CNTs alteram as propriedades estruturais das fibrilas proteicas por meio de hibridização e recombinação para direcionar a entrega de medicamentos terapêuticos in vivo e destruir células cancerígenas [64,65].Hendler et al. usaram o método de "co-montagem" para formar fibrilas compostas híbridas de amiloide-fulereno [66], que são usadas para a preparação de nanomarcadores de separação de cores, materiais de diagnóstico e dispositivos optoeletrônicos.

As propriedades especiais das fibrilas proteicas e dos nanomateriais de carbono (tais como as propriedades mecânicas e eletromagnéticas dos nanomateriais de carbono e as propriedades biológicas dos materiais proteicos) podem beneficiar-se mutuamente, e sua combinação ampliará enormemente as faixas de aplicação desses dois tipos de nanomateriais.

No entanto, ainda há um longo caminho a percorrer para compreender completamente a interação entre fibrilas proteicas e nanomateriais de carbono. Nesta pesquisa, estudamos a interação de fibrilas WPI com CNTs (ou CNOs) e caracterizamos os compósitos de fibrilas WPI – CNTs (ou CNOs) por SEM, TEM, XRD, Raman, FTIR e TG. As fibrilas WPI foram preparadas usando um processo de indução de hidrólise ácida. Os compósitos fibrilas WPI-CNTs (ou CNO) foram feitos usando síntese hidrotérmica.

2. Materiais e Métodos

2.1. Formação de fibrilas WPI

O WPI-1 foi adquirido da Davisco Foods International Inc. (97,8% sem lecitina, NM, EUA) e o WPI-2 foi adquirido da Hilmar Ingredients (90,39% com lecitina, Hilmar, CA, EUA).

Uma solução estoque (cerca de 6% em peso) foi preparada dissolvendo WPI em água Millipore. O pH da solução foi então ajustado para 4,75 adicionando HCl 1 M, seguido de centrifugação (10,000 rpm, 60 min, 4 ◦C) e filtração do sobrenadante (FP 030/ 0,45 µm, Schleicher e Schuell). Após filtração, o pH da solução filtrada foi ajustado para 2 usando HCl 6 M.

A concentração de proteína da solução estoque foi determinada usando um espectrofotômetro UV (UV-1800PC, MAPADA, Xangai, China) e uma curva de calibração de concentrações conhecidas de WPI em um comprimento de onda de 278 nm.

A solução estoque foi diluída até uma concentração de proteína de 2% em peso com uma solução de HCl de pH 2. A solução WPI foi então aquecida e agitada (cerca de 290 rpm) por 20 horas a 80 ◦C para formar fibrilas.

2.2. Preparação de CNTs e CNOs

2.2.1. Preparação de CNTs

Preparação do catalisador La2NiO4: La(NO3)3·6H2O e Ni(NO3)2·6H2O (razão molar de La/Ni=2:1) foram dissolvidos em água deionizada, em seguida foi adicionado ácido cítrico. A solução foi aquecida a 80 ◦C por 1 h com agitação e finalmente se transformou em uma substância coloidal.

A substância coloidal foi calcinada em um forno mufla (10 ◦C/min em ar; 300 ◦C por 1 h, depois 800 ◦C por 5 h). Deposição química catalítica de vapor (CVD) de metano para produzir CNTs: A substância fixa O reator catalítico sólido de gás de leito foi adotado para CVD de metano para produzir CNTs.

O catalisador La2NiO4 (0,5 g) foi colocado dentro de barcos de quartzo em um reator tubular de quartzo. Primeiramente, nitrogênio (30 mL/min) foi usado para lavar o reator por 30 min e, em seguida, hidrogênio (10 mL/min) foi usado para reduzir La2NiO4 a 600 ◦C por 1 h.

Posteriormente, o gás foi trocado para metano (60 mL/min) para CVD catalítico a 800 ◦C por 8 h para sintetizar CNTs.Purificação de CNTs: Os CNTs misturados com catalisadores foram purificados em ácido nítrico 0,1 M a 80 ◦C com agitação por 5 h.

Ela foi filtrada e lavada cinco vezes com água deionizada. Por fim, a amostra foi seca a 120 ◦C por 6 horas.

2.2.2. Preparação de CNOs

Pré-tratamento do suporte de malha de aço inoxidável: malhas de aço inoxidável SS316 medindo 20 mm × 20 mm foram limpas ultrassonicamente por 30 min em solução de HCl 0,1 M. Em seguida, as malhas foram colocadas em um reator tubular de quartzo.

Vapor de água contendo gás nitrogênio (vapor de água de 90 ◦C) foi introduzido no tubo de quartzo. O tubo de quartzo foi aquecido a 300 ◦C durante 1 h. A superfície do aço inoxidável foi utilizada como transportador de catalisador após tal tratamento.

Carregamento do catalisador: A malha de aço inoxidável pré-tratada acima foi imersa em solução de oxalato de níquel. O ácido cítrico foi adicionado com agitação durante 1 h. A solução foi aquecida a 80 ◦C e finalmente transformada em colóide. O colóide e as malhas de aço inoxidável foram colocados em um cadinho e calcinados em mufla (Zhonghuan, Tianjin, China) a 900 ◦C (10 ◦C/min, ao ar) por 3 h.

Finalmente, a malha de aço inoxidável carregada com catalisador foi obtida. CVD catalítico de metano para produzir CNOs [67]: Um reator gás-sólido de leito fixo (Zhonghuan, Tianjin, China) também foi usado. O catalisador de malha de aço inoxidável foi colocado em um tubo de quartzo.

Nitrogênio (30 mL/min) foi usado para purgar o reator em temperatura ambiente por 1 h, depois a temperatura foi elevada até a temperatura de reação de 900 ◦C e o nitrogênio foi trocado por metano (30 mL/min) por 8 h para craqueamento catalítico. .

Por fim, o metano foi reconvertido em gás nitrogênio e o reator foi resfriado até a temperatura ambiente. Finalmente, o catalisador de malha de aço inoxidável e os CNOs foram retirados. Purificação dos CNOs: Uma amostra de CNO foi primeiro peneirada para remover as partículas livres do catalisador.

Em seguida, foi misturado com HNO3 concentrado e refluxado a 90 ◦C por 40 horas. Após diluição e resfriamento, foi centrifugado a 4.000 rpm por 10 min e a solução ácida foi retirada.

Os CNOs restantes foram enxaguados abundantemente com água destilada diversas vezes até atingir pH neutro. Finalmente, os CNOs purificados foram secos.

2.3. Preparação de WPI Fibril – CNTs (ou CNOs)

Fibras WPI – CNTs (ou CNOs) foram sintetizadas usando o método hidrotérmico. Os CNTs (ou CNOs) com concentrações de {{0}}.05% em peso, 0,10% em peso e 0,15% em peso foram misturados em água deionizada e tratados ultrassonicamente por 30 min para dispersar tão bem quanto possível.

O mesmo volume de solução de fibrila WPI foi adicionado e misturado com agitação magnética durante 30 min. A mistura foi então despejada no reator autoclave (Hongchen, Xi'an, China) para reação hidrotérmica (80 ◦C, 20 h).

Em seguida, o produto foi resfriado até a temperatura ambiente, a autoclave foi aberta e a mistura retirada. O produto foi seco em estufa (60 ◦C) por 48 h.

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