O receptor de glutamato desempenha um papel na defesa contra Botrytis Cinerea por meio de sinalização elétrica no tomate

Abstrato:

Os genes de receptores semelhantes ao glutamato (GLRs) de plantas são homólogos aos genes de receptores de glutamato ionotrópicos de mamíferos (iGluRs). Embora os GLRs tenham sido implicados nas defesas das plantas ao estresse biótico, a relação entre a imunidade da planta mediada por GLR contra patógenos fúngicos e sinais elétricos permanece pouco compreendida. Aqui, descobrimos que o pré-tratamento com um inibidor de GLR, 6,7-dinitriquinoxalina-2,3-diona (DNQX), aumentou a suscetibilidade das plantas de tomate ao fungo patógeno necrotrófico Botrytis cinerea. A avaliação dos mutantes duplos glr3.3, glr3.5 e glr3.3/glr3.5 na infecção por B. cinerea mostrou que os GLR3.3 e GLR3.5 do tomate são essenciais para a imunidade da planta contra B. cinerea, em que GLR3. 3 desempenha o papel principal.

A análise das alterações de potencial de membrana induzidas por glutamato (Glu) ou glicina (Gly) revelou uma amplitude significativamente reduzida ao eliminar GLR3.3 em tomates. Enquanto o tratamento com Glu ou Gly aumentou significativamente a imunidade contra B. cinerea em plantas selvagens, esse efeito foi significativamente atenuado em mutantes glr3.3. Assim, nossos dados demonstram que a imunidade vegetal mediada por GLR3.3- e GLR3.5-contra B. cinerea está associada a sinais elétricos em tomateiros.

A força da imunidade determina diretamente nosso estado de saúde. Quando a imunidade é forte, somos mais capazes de combater doenças e infecções. Por outro lado, se nosso sistema imunológico estiver fraco, os patógenos podem invadir mais facilmente nossos corpos e nos causar doenças. Portanto, é muito importante manter o sistema imunológico saudável, o que pode ser melhorado por meio de dieta, exercícios e redução do estresse.

Na pesquisa, descobriu-se que Cistanche Herba pode melhorar significativamente a imunidade. Os glicosídeos totais de Cistanche deserticola, polissacarídeos de Cistanche deserticola e verbascosídeo podem reduzir significativamente o conteúdo de MDA no fígado e no tecido cerebral e a atividade da telomerase no coração e no tecido cerebral. A função fagocítica dos macrófagos é aumentada, e a resposta proliferativa dos linfócitos e o conteúdo de IL-2 no sangue periférico é significativamente aumentado, aumentando assim a função imunológica do corpo.

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1. Introdução

Plantas que crescem em ambiente natural são continuamente ameaçadas por vários patógenos. Esses estressores bióticos afetam a produção agrícola e muitas vezes causam perdas econômicas. Como as plantas carecem de mobilidade, elas adquiriram uma variedade de sistemas de transmissão de sinal durante a evolução para mitigar efetivamente os efeitos adversos das mudanças ambientais. Quanto mais rápido esses sinais manobrarem, mais provável será que as plantas se adaptem e resistam ao estresse recebido. Os sinais relatados até agora incluem fluxo de cálcio, ROS (espécies reativas de oxigênio), sinais elétricos, etc. [1–5], que reagem em segundos ou minutos.

Genes de receptores semelhantes ao glutamato (GLRs) de plantas são homólogos aos genes de receptores de glutamato ionotrópicos de mamíferos (iGluRs), que desencadeiam cascatas elétricas e de sinal de Ca2+ [3,6]. Acredita-se que os GLRs de plantas tenham atividade de ligação ao ligante, bem como atividade de canal iônico. GLRs têm 20 membros da família em Arabidopsis [7] e 13 membros em arroz [8]. Existem 13 genes GLR completos em plantas de tomate [9].

É importante ressaltar que os GLRs estão envolvidos na resposta das plantas ao estresse biótico. Por exemplo, AtGLR3.3 é um módulo vital da imunidade da planta contra o patógeno bacteriano P. syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000), o Oomiceto Hyaloperonospora arabidopsidis e o inseto Spodoptera littoralis [10–12].

Além disso, Wang et al. (2019) relataram que o GLR3.5 funciona na defesa do tomateiro contra o nematóide das galhas (RKN) Meloidogyne incognita [13]. A superexpressão de DNA complementar de GluR de rabanete em plantas de Arabidopsis aumenta a resistência a um patógeno fúngico necrótico, B. cinerea. No entanto, os mutantes Arabidopsis glr3.3 não demonstraram maior vulnerabilidade ao patógeno fúngico em comparação com Col-0. Assim, o papel dos GLRs na imunidade da planta contra patógenos fúngicos permanece controverso.

GLRs de plantas estão envolvidos na geração e transmissão de sinais elétricos. A existência de sinais elétricos nas plantas foi descoberta por Burden-Sanderson e Charles Darwin [14,15]. São sinais de resposta rápida gerados pela mudança instantânea no gradiente de potencial elétrico na membrana plasmática ou na membrana da folha alveolar [16]. Todas as plantas podem produzir sinais elétricos de longa distância, que desempenham um papel na comunicação de diversos tecidos e órgãos, levando à integração de respostas ambientais [17,18].

Nos últimos anos, a função de sinais elétricos na resistência de plantas mediada por GLR ao estresse biótico tem atraído muita atenção [19]. Em Arabidopsis, insetos que se alimentam de folhas podem causar alterações no potencial de superfície, que levam à expressão de vários genes reguladores induzíveis por jasmonatos (JA)-chave na fase adulta das plantas [3]. O ataque do nematóide das galhas às raízes do tomateiro causa a transferência de sinais elétricos e ROS das raízes para as folhas, resultando em um acúmulo de JAs nas folhas [13]. Farmer et ai. (2014) propuseram uma hipótese de que a síntese distal de JA em plantas após ferimentos era dependente de sinais elétricos mediados por GLR do clado 3 [20]. No entanto, a relação entre sinais elétricos e imunidade vegetal induzida por GLR contra patógenos fúngicos não foi totalmente comprovada.

O tomate (Solanum lycopersicum L.) é uma das culturas cultivadas mais importantes do mundo em termos de importância econômica [21]. No entanto, doenças fúngicas prejudicam a produção de tomate, resultando em perdas econômicas substanciais [22]. Em particular, Botrytis cinerea, um fungo necrotrófico típico, foi considerado o segundo lugar entre os 10 principais patógenos fúngicos em patologia molecular de plantas [23]. Possui uma ampla gama de hospedeiros e pode infectar mais de 200 espécies de plantas, incluindo uma variedade de culturas comerciais [24]. B. cinerea pode causar um declínio significativo na produção de tomate e na qualidade pós-colheita dos frutos [25]. No entanto, uma variedade de tomate com ampla resistência a B. cinerea ainda não foi desenvolvida. Assim, entender os mecanismos moleculares da resistência do tomateiro a B. cinerea é particularmente importante.

Existem 13 genes GLR completos em plantas de tomate. Neste estudo, GLR3.3 e GLR3.5, que desempenham papéis positivos na tolerância ao frio [26] e defesa contra RKNs [13], foram caracterizados funcionalmente em relação à imunidade do tomateiro contra B. cinerea. Descobrimos que GLR3.3 e GLR3.5 são atores importantes na imunidade da planta contra B. cinerea em tomates, possivelmente através da ligação ao ligante glutamato (Glu) ou glicina (Gly), desencadeando sinais elétricos. Esta descoberta tem valor científico intrínseco, com potencial para desenvolver novas estratégias para aumentar a resistência das culturas a B. cinerea.

2. Materiais e métodos

2.1. Materiais Vegetais, Condições de Crescimento e Tratamentos Químicos

As linhagens de tomate (CRISPR-Csa9-linhas editadas de glr3.3, glr3.5 e glr3.3/3.5) usadas neste estudo estavam no fundo cv Ailsa Craig (AC) tipo selvagem (WT) , conforme relatado anteriormente [27]. No caso da cultura de substrato sem solo, os tomateiros foram cultivados em vasos contendo substrato misto (vermiculita: turfa, 1:3, v/v) e adubados com solução nutritiva de Hoagland.

No caso do cultivo hidropônico, as sementes de tomate foram inicialmente germinadas em bandejas preenchidas com substrato misto (vermiculita: perlita, 1:1, v/v) e, após a emergência, as mudas foram transferidas para recipientes plásticos com capacidade de 1,5 L (quatro mudas por recipiente). Os recipientes foram preenchidos com solução nutritiva Enshi meia força, que foi continuamente ventilada pela aeração do ar de uma bomba de ar [21]. As condições de cultivo foram: 14 h luz/8 h escuro fotoperíodo; 24 ◦C/20 ◦C temperatura dia/noite; e 400 µmol m−2 s−1 PPFD (densidade de fluxo de fótons fotossintéticos). Plantas de tomateiro com quatro semanas de idade foram submetidas aos tratamentos.

Para o ensaio de pré-tratamento de DNQX (6,7-dinitriquinoxalina-2,3-diona, inibidor de GLRs), as plantas WT foram tratadas por pulverização foliar com 1 mM de DNQX ou H2O como controle, 12 h antes Inoculação de B. cinerea. Ensaios de pré-tratamento Glu e Gly foram realizados como os mutantes glr3.3 e plantas WT foram tratadas com 20 mM Glu, 20 mM Gly ou H2O como controle uma vez por dia em ambas as superfícies abaxial e adaxial das folhas. Dois dias após o tratamento farmacológico, as plantas foram submetidas à inoculação do patógeno.

2.2. Inoculação de Patógenos e Ensaios de Sintomas de Doenças

A estirpe B. cinerea BO5-10 foi utilizada neste estudo. A inoculação foi realizada utilizando uma suspensão de B. cinerea na densidade de 2 × 105 esporos mL−1 [28]. A porção de folha inteira de plantas de tomate foi pulverizada com a suspensão. As plantas inoculadas foram colocadas em uma caixa selada para manter a umidade de cerca de 90 por cento. A temperatura e a luz foram as mesmas das condições normais de cultura.

Após a inoculação do patógeno, o acúmulo de mRNA de actina de B. cinerea foi quantificado em {{0}}dia pós-inoculação (dpi) [29]. A fluorescência da clorofila foi medida com um fluorômetro de clorofila (IMAG-MAXI; Heinz Walz) a 3 dpi. A eficiência quântica fotoquímica do PSII (ΦPSII) foi analisada como Fm0–F/Fm0 [30].

2.3. Localização subcelular

Os fragmentos dos genes GLR3.3 e GLR3.5 foram amplificados usando os primers listados na Tabela Suplementar S1 e clonados em um vetor pAC402 com uma etiqueta de proteína verde fluorescente (GFP) [31]. A cepa de Agrobacterium GV3101, portadora de plasmídeos, e Agrobacterium, portadora de FLS2-mCherry como um marcador de localização de membrana plasmática, foram co-expressas transitoriamente no transgênico Nicotiana benthamiana (expresso com histona 2B-mCherry para marcar a localização do núcleo), como descrito anteriormente [32]. Dois dias após a infiltração, os sinais fluorescentes de proteínas marcadas com GFP ou mCherry foram avaliados nas folhas, usando um microscópio confocal Zeiss LSM 780 em comprimentos de onda de excitação/emissão descritos anteriormente [28].

2.4. Isolamento de RNA, transcrição e qRT-PCR

O RNA total foi isolado de folhas de tomate usando o RNAsimple Total RNA Kit (Tiangen, China) e transcrito reversa usando o ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo, Japão). O processo qRT-PCR foi realizado usando o LightCycler 480 Real-Time PCR System (Roche, Suíça). O sistema de reação foi realizado conforme descrito no experimento anterior [28]. Os iniciadores específicos para o gene de actina de B. cinerea e o gene de actina de tomate de controle interno estão listados na Tabela Suplementar S1.

2.5. Registro de Potencial Elétrico

Plantas de tomateiro hidropônico no estádio de quatro folhas foram utilizadas para registro do potencial elétrico. Capilares de vidro borosilicato com um diâmetro externo de 1,5 mm e um diâmetro interno de 0.86 mm (Sutter Instrument Company, América) foram moldados em microeletrodos de vidro com um diâmetro de ponta de cerca de 0 0,5 mm para medições de potencial citoplasmático intracelular. Um extrator de micropipeta vertical APE-2 (Narishige, Tóquio, Japão) foi usado para puxar os capilares após o aquecimento. Microeletrodos foram preenchidos com KCl 1 M e inseridos nas células do mesofilo de uma folha. A folha foi submersa com a solução básica (composta de 5 mM MES, {{10}}.5 mM CaSO4, 0.05 mM KCl e pH 6,0) [13], que foi executado conforme mostrado no Suplemento da Figura S1. Cada eletrodo foi conectado a um amplificador diferencial. Dois amplificadores de canal duplo (FD223 e Duo773, World Precision Instruments) foram usados ​​para detectar os sinais. A solução hidropônica foi substituída pela mesma solução adicionada de 2 mM Glu ou 2 mM Gly, usando o tubo de infusão, quando o valor do potencial de membrana medido era estável. Amplitudes são diferenças de potencial em relação à linha de base antes das mudanças.

2.6. Análise estatística

Os experimentos foram conduzidos por meio de um delineamento inteiramente casualizado, e um mínimo de três réplicas foram usadas em cada experimento. Salvo indicação em contrário, para cada replicação biológica, duas folhas de cada uma das duas plantas foram combinadas e usadas como uma amostra independente. Três experimentos separados foram realizados independentemente. Fizemos uma análise de variância dos dados usando o software SAS versão 8 (SAS Institute) e, em seguida, usamos o teste de Tukey para determinar a significância no nível de 5 por cento.

3. Resultados

3.1. O pré-tratamento com um inibidor de GLR aumenta a suscetibilidade do tomate a B. cinerea

Para explorar o papel dos GLRs na defesa da planta contra B. cinerea, os tomateiros foram pulverizados com DNQX ou H2O (controle), por 12 h antes da inoculação com B. cinerea. Aos 3 dpi com B. cinerea, as folhas inoculadas exibiram lesões visíveis da doença. O dano induzido pela infecção por B. cinerea nas folhas foi avaliado usando imagens de fluorescência de clorofila para determinar os desvios no rendimento quântico do fotossistema II (ΦPSII) (Figura 1a,b). Após a inoculação com B. cinerea, o ΦPSII diminuiu significativamente. Notavelmente, o valor de ΦPSII nas plantas tratadas com DNQX foi menor do que no controle. O tratamento com DNQX também aumentou a abundância de mRNA de actina de B. cinerea nas folhas (Figura 1c). Esses achados indicam que os GLRs regulam positivamente a imunidade da planta contra B. cinerea em plantas de tomate.

Figura 1. O tratamento com DNQX aumenta a suscetibilidade dos tomates a B. cinerea. Plantas de tomate com quatro semanas de idade foram tratadas com 1 mM DNQX ou H2O, 12 h antes da inoculação com B. cinerea: (a) imagens pseudocoloridas de folhas de tomate mostrando ΦPSII em 3 dpi; (b) valores quantitativos de ΦPSII a 3 dpi; (c) abundância transcrita de actina de B. cinerea em folhas de tomate inoculadas com B. cinerea em 1 dpi. Os resultados nos painéis (b,c) são apresentados como valores médios ± DP; n=4. Diferenças estatisticamente significativas entre tratamentos (p < 0.05, teste de Tukey) são mostradas por letras diferentes. Os experimentos descritos acima foram realizados três vezes, com os mesmos resultados a cada vez.

3.2. Localização subcelular de GLR3.3 e GLR3.5

Tomato GLR3.3 e GLR3.5 são homólogos a Arabidopsis GLR3.3 e GLR3.6, respectivamente (9), que foram relatados como participantes na resposta ao ataque de nematóides e tolerância ao frio em tomates. Determinar a localização subcelular de tomate GLR3.3 e GLR3.5, GLR3.3-GFP, GLR3.5-GFP e GFP foram transformados em Agrobacteriumtumefaciens e, então, expressos transitoriamente em N. benthamiana. A microscopia confocal de células epidérmicas foliares mostrou que o sinal GFP de controle exibiu uma localização nas membranas celulares, citosol e núcleos (Figura 2). Os sinais fluorescentes de GLR3.3-GFP e GLR3.5-GFP foram colocalizados com FLS2-mCherry no plasma membranas das células não foi observado que GLR3.3 e GLR3.5 colocalized com histona 2B-mCherry nos núcleos. Os resultados sugerem que tomate GLR3.3-GFP e GLR3.5-CFP localizam-se no membrana plasmática de uma célula.

Figura 2. Localização subcelular de GLR3.3 e GLR3.5. GLRs-GFP de tomate foram coexpressos transitoriamente com FLS2-mCherry (um fabricante de localização de membrana plasmática) em folhas de N. benthamiama. Os sinais GFP e mCherry foram visualizados usando microscopia confocal 48 h após a infiltração. Barra=25 µm.

3.3. Função GLR3.3 e GLR3.5 na defesa da planta contra B. cinerea

Para investigar o papel dos GLRs na imunidade da planta, plantas nocaute GLR3.3 ou GLR3.5 de tomate editadas por genes CRISPR/Cas 9-e mutantes duplos glr3.3/3.5 foram infectadas com B. cinerea. Os resultados mostraram que o nocaute de GLR33 e GLR3.5 resultou em uma diminuição óbvia em PSll, em comparação com o controle WT (Figura 3a,b). Consequentemente, o acúmulo de mRNA de actina de B. cinerea nas folhas aumentou significativamente (Figura 3c) nos mutantes glr3.3 ou glr3.5.

Enquanto isso, os mutantes duplos glr3.3/glr3.5 apresentaram maior atenuação na defesa da planta quando comparados com os mutantes glr3.3 e glr3.5. Essas observações sugerem que GLR3.3 e GLR3.5 funcionam de forma redundante para estabelecer resistência contra B. Cameron. Além disso, GLR3.3 desempenha o papel principal, já que os mutantes glr3.3 foram mais suscetíveis à inoculação de B. cinerea do que os mutantes glr3.5. Com base nisso, GLR3.3 foi selecionado para um estudo mais aprofundado.

3.4. Reconhecimento de Glu e Gly por GLRs desencadeou sinalização elétrica na resposta imune

Como Glu ou Gly podem ser reconhecidos por GLRs para desencadear a despolarização da membrana [33], determinamos a sinalização elétrica induzida por Glu ou Gly monitorando o efeito de Glu e Gly no potencial de membrana em folhas de tomate. O tratamento com Glu e Gly provocou mudanças significativas no potencial de membrana em um curto espaço de tempo, com um aumento na amplitude de cerca de 17-20 mV (Figura 4). Notavelmente, a mudança no potencial de membrana induzida por Glu e Gly foi significativamente enfraquecida nos mutantes glr3.3. Esses achados sugerem que a sinalização elétrica em folhas de tomate, induzida por Glu ou Gly, é parcialmente dependente de GLR3.3.

Figura 3. Efeitos da edição de GLR3.3 e GLR3.5 na defesa da planta contra a inoculação de B. cinerea em tomate: (a) imagens pseudocoloridas de folhas de tomate mostrando pPSll a 3 dpi; (b) quantificação de pPSllat 3 dpi; (c) abundância transcrita de actina de B. cinerea em folhas de tomate inoculadas com B. cinerea atI dpi. Os resultados nos painéis (b,c) são apresentados como valores médios - DP; n=4. Estatisticamente, as diferenças significativas entre os tratamentos (p < 0,05, teste de Tukey) são mostradas por letras diferentes. Os experimentos descritos acima foram realizados três vezes, com os mesmos resultados a cada vez.

Figura 4. Glu ou Gly afeta o potencial de membrana de folhas WT e glr3.3: (a) alterações típicas do potencial de membrana em folhas mutantes de tomate WT ou glr3.3 tratadas com Glu ou Gly; (b) quantificação das variações de amplitude do potencial de membrana. Os resultados do painel (b) são apresentados como valores médios ± DP; n=4. Diferenças estatisticamente significativas entre tratamentos (p <0.05, teste de Tukey) são mostradas Mock WT glr3.3 glr3.5 B. cinerea WT glr3.3/glr3.5 (b) (c ) (a) WT mais 2mM Glu WT mais 2mM Gly glr3.3 mais 2mM Gly glr3.3 mais 2mM Glu WT mais solução de controle (a) (b) Figura 4. Glu ou Gly afeta o potencial de membrana de WT e glr3.3 folhas: (a) alterações típicas do potencial de membrana em tomate WT ou folhas mutantes glr3.3 tratadas com Glu ou Gly; (b) quantificação das variações de amplitude do potencial de membrana. Os resultados do painel (b) são apresentados como valores médios ± DP; n=4. Diferenças estatisticamente significativas entre os tratamentos (p < 0,05, teste de Tukey) são mostradas por letras diferentes. Os experimentos descritos acima foram realizados três vezes, com os mesmos resultados a cada vez.

Os mutantes glr3.3 exibiram maior sensibilidade a B. cinerea, o que foi consistente com a redução dos sinais elétricos induzidos por Glu ou Gly. Com base nessas observações, levantamos a hipótese de que o reconhecimento de Glu e Gly por GLRs é crítico na imunidade contra B. cinerea. Para verificar esta hipótese, um ensaio farmacológico foi realizado por tratamento exógeno com Glu ou Gly. Antes da inoculação de B. cinerea, as plantas WT e o mutante glr3.3 foram pré-tratados com Glu, Gly ou H2O (controle).

Nas plantas WT, a redução induzida pela inoculação de B. cinerea em ΦPSII e o aumento no acúmulo de mRNA de actina de B. cinerea foram significativamente aliviados pelo pré-tratamento com Glu ou Gly exógeno a 3 dpi (Figura 5). No entanto, os sintomas da doença no mutante glr3.3 foram mais graves, e os efeitos benéficos de Glu e Gly na resistência contra B. cinerea diminuíram significativamente devido ao nocaute de GLR3.3. Assim, estes resultados indicam que a imunidade da planta induzida por Glu e Gly contra B. cinerea depende parcialmente de GLR3.3.

Figura 5. A imunidade induzida por Glu ou Gly contra B. cinerea depende parcialmente de GLR3.3. Plantas de tomate com quatro semanas de idade foram tratadas com 20 mM Glu, 20 mM Gly ou água uma vez por dia durante dois dias antes da inoculação de B. cinerea: (a) imagens pseudocoloridas de folhas de tomate mostrando ΦPSII a 3 dpi ; (b) quantificação de ΦPSII em 3 dpi; (c) abundância transcrita de actina de B. cinerea em folhas de tomate inoculadas com B. cinerea em 1 dpi. Os resultados nos painéis (b,c) são apresentados como valores médios ± DP; n=4. Diferenças estatisticamente significativas entre os tratamentos (p < 0,05, teste de Tukey) são mostradas por letras diferentes. Os experimentos descritos acima foram realizados três vezes, com os mesmos resultados a cada vez.

4. Discussão

s são proteínas de canais catiônicos que existem em bactérias, plantas e animais. Em animais, está comprovado que os GLRs estão envolvidos na neurotransmissão e na regulação imune, e seu ligante Glu atua como um agente de sinalização entre os dois sistemas [34-36]. Nas plantas, os GLRs desempenham um papel positivo na imunidade contra o estresse biótico [10,12,13]. Notavelmente, a defesa induzida por GLR contra RKNs e picadas de insetos mostrou estar associada a sinais elétricos [3]. No entanto, a relação entre resistência a doenças fúngicas mediada por GLR e sinais elétricos não foi totalmente comprovada. Aqui, fornecemos evidências convincentes que demonstram que o tomate GLR3.3- e GLR3.5-modulam a imunidade da planta contra o patógeno fúngico típico B. cinerea está relacionado a sinais elétricos.

Neste estudo, o papel dos GLRs na imunidade de mudas de tomate contra B. cinerea foi revelado pela primeira vez. A aplicação do inibidor de GLR DNQX aumentou a suscetibilidade dos tomateiros a B. cinerea (Figura 1). Além disso, a eliminação de GLR3.3 ou GLR3.5 atenuou significativamente a imunidade da planta, levando a um aumento dos sintomas da doença nas folhas (Figura 3). Esses achados apóiam a noção de que as plantas de tomate requerem GLRs para montar uma defesa adequada contra o patógeno fúngico necrotrófico B. cinerea. Embora a superexpressão de GluR de rabanete iniba o crescimento de B. cinerea [37], nenhum dos mutantes de Arabidopsis glr foi mais sensível a B. cinerea [12], sugerindo que a função dos GLRs pode diferir entre as espécies. No presente estudo, os mutantes duplos glr3.3/glr3.5 mostraram um fenótipo mais sensível em comparação com os mutantes simples glr3.3 e glr3.5. Essas descobertas sugerem que GLR3.3 e GLR3.5 funcionam de forma redundante. Notavelmente, uma comparação dos fenótipos entre os mutantes glr3.3 e glr3.5 sugere que GLR3.3 desempenha o papel principal na defesa contra B. cinerea.

Os sinais elétricos são uma resposta rápida envolvida na resistência das plantas mediada por GLR ao estresse biótico. Aqui, os sinais elétricos induzidos por Glu ou Gly foram significativamente enfraquecidos em mutantes glr3.3. O tratamento com Glu ou Gly induziu o potencial de membrana por um curto período de tempo. No entanto, a variação na amplitude é substancialmente diminuída nos mutantes glr3.3 (Figura 4). Da mesma forma, em Arabidopsis, a geração e propagação de sinais elétricos induzidos por danos nas folhas são enfraquecidas nos mutantes glr3.3 e glr3.6 [3]. No entanto, o enfraquecimento das alterações de potencial de superfície induzidas por feridas se manifesta no encurtamento da duração, mas a amplitude permaneceu a mesma que WT em mutantes de Arabidopsis glr3.3 após ferir as folhas. Essas diferenças nos resultados podem ser devidas a diferenças nas espécies e tratamentos. Consistente com nossos resultados, o nocaute de GLR3.3 inibe a despolarização da membrana induzida pelo tratamento com Glu em raízes de Arabidopsis [38]. Todos esses resultados sugerem que os sinais elétricos induzidos por Glu ou Gly dependem parcialmente de GLR3.3.

O tratamento exógeno com Glu induz respostas imunes a múltiplas doenças, como o fungo da brusone do arroz Magnaporthe Oryza, o fungo necrotrófico Alternaria alternata em frutos de tomate e o patógeno bacteriano do solo Ralstonia solanacearum [39-41]. Sol e outros. (2019) relataram que o tratamento com Glu aumenta a resistência dos frutos de tomate contra B. cinerea [42]. No presente estudo, o tratamento exógeno com Glu ou Gly induziu imunidade contra B. cinerea em plantas WT; no entanto, os benefícios deste tratamento foram significativamente inibidos no mutante glr3.3 (Figura 5). Os dados aqui apresentados demonstraram que GLR3.3 era necessário para imunidade induzida por Glu ou Gly contra B. cinerea. Assim, esses achados sugerem que a resistência de B. cinerea induzida por Glu ou Gly é parcialmente dependente de GLR3.3.

Com base nos dados fornecidos aqui, propomos que GLRs estão envolvidos em respostas de defesa a B. cinerea por meio de sinais elétricos. Considerando a imunidade mediada por fitohormônios, a via de sinalização do ácido salicílico facilita a defesa contra patógenos biotróficos e hemibiotróficos, enquanto a via de sinalização JA/etileno funciona contra patógenos necrotróficos [43,44]. Uma relação antagônica entre essas duas vias é evidente em muitos patossistemas vegetais [45,46].

No entanto, GLR3.3 demonstrou mediar positivamente a resistência contra o patógeno biotrófico Pst DC3000, ao mesmo tempo em que é essencial para a imunidade contra o patógeno necrotrófico B. cinerea. Nossa proposta é razoável, pois GLR3.3 pode reconhecer Glu, que é considerado um tipo de DAMP [6,47]. DAMPs desencadeiam sinais secundários precoces e induzem a expressão de JA/etileno, um gene de defesa de sinalização SA. Além disso, a injeção de corrente artificial na superfície do caule induz um aumento significativo no acúmulo de JAs nas plantas [13].

Por esses resultados, GLR3.3 pode desempenhar um papel na fase inicial da resistência da planta através de sinais elétricos induzidos por Glu ou Gly, que respondem em segundos ou minutos, a montante da via de sinalização hormonal. A via de sinalização JA também pode ser ativada por sinais elétricos. Além disso, está bem documentado que o AtGLR3.3 participa da resistência das plantas mediando a variação [Ca2 mais ]cyt e as respostas de oxidação [12]. A relação entre essas vias e os sinais elétricos na regulação da resistência de plantas contra B. cinerea merece uma investigação mais aprofundada.

5. Conclusões

Os dados aqui apresentados mostram que GLR3.3 e GLR3.5 desempenham um papel positivo na defesa do tomateiro contra o patógeno necrotrófico B. cinerea através de sinais elétricos. Nosso estudo fornece novos insights sobre o mecanismo de defesa da planta contra B. cinerea. No entanto, será interessante investigar a relação entre várias vias de sinalização induzidas por GLR, que contribuem para a imunidade da planta contra patógenos fúngicos.

Contribuições do autor:

Conceituação, SF, CP e KS; metodologia, KS; software, SF e PW; validação, SF, CP e KS; análise formal, SF, CH e QM; investigação, SF, CP e SD; recursos, KS; curadoria de dados, SF e CP; redação—preparação do rascunho original, SF e KS; redação—revisão e edição, KS; supervisão, KS; administração de projetos, KS; aquisição de financiamento, KS Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Financiamento:

Este trabalho foi financiado pela National Natural Science Foundation of China (31772355, 32172650), pela Natural Science Foundation of Zhejiang Province for Distinguished Young Scholars (LR19C150001), pelo Key Research and Development Program da Zhejiang Province (2021C02040) e pela Starry Night Fundo de Ciências do Instituto de Estudos Avançados da Universidade de Zhejiang Shanghai (SN-ZJU-SIAS-0011).

Declaração do Conselho de Revisão Institucional:

Não aplicável.

Declaração de Consentimento Informado:

Não aplicável.

Declaração de Disponibilidade de Dados:

Os dados brutos que suportam as conclusões deste artigo serão disponibilizados pelos autores, sem reservas indevidas.

Agradecimentos:

Os autores gostariam de estender seus sinceros agradecimentos à Fundação Nacional de Ciências Naturais da China, à Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang, ao Programa Chave de Pesquisa e Desenvolvimento da Província de Zhejiang e ao Starry Night Science Fund do Instituto de Estudos Avançados da Universidade de Zhejiang Shanghai Estudo para seu apoio financeiro.

Conflitos de interesse:

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Referências

1. Gilroy, S.; Suzuki, N.; Miller, G.; Choi, WG; Toyota, M.; Devireddy, AR; Mittler, R. Uma onda de sinais: Cálcio e ROS na vanguarda da sinalização sistêmica rápida. Tendências Plant Sci. 2014, 19, 623–630. [CruzRef]

2. Hedrich, R.; Salvador-Recatala, V.; Dreyer, I. Fiação elétrica e comunicação de plantas de longa distância. Tendências Plant Sci. 2016, 21, 376–387. [CruzRef]

3. Mousavi, SA; Chauvin, A.; Pascaud, F.; Kellenberger, S.; Farmer, EE Genes semelhantes ao receptor de glutamato medeiam a sinalização de feridas folha a folha. Nature 2013, 500, 422–426. [CruzRef]

4. Choi, WG; Miller, G.; Wallace, I.; Harper, J.; Mittler, R.; Gilroy, S. Orquestrando sinalização rápida de longa distância em plantas com Ca2 plus, ROS e sinais elétricos. Plant J. 2017, 90, 698–707. [CruzRef]

5. Marcec, MJ; Gilroy, S.; Poovaiah, BW; Tanaka, K. Interação mútua de Ca2 plus e sinalização de ROS na resposta imune da planta. Plant Sci. 2019, 283, 343–354. [CruzRef]

6.Toyota, M.; Spencer, D.; Sawai-Toyota, S.; Jiaqi, W.; Zhang, T.; Koo, AJ; Howe, GA; Gilroy, S. O glutamato desencadeia sinalização de defesa vegetal à base de cálcio de longa distância. Ciência 2018, 361, 1112–1115. [CruzRef]

7. Wudick, MM; Michard, E.; Oliveira, NC; Feijo, JA Comparando receptores de glutamato de plantas e animais: Traços comuns, mas destinos diferentes? J. Exp. Robô. 2018, 69, 4151–4163. [CruzRef]

8. Ni, J.; Yu, Z.; Cavado.; Zhang, Y.; Taylor, JL; Shen, C.; Xu, J.; Liu, X.; Wang, Y.; Wu, Y. Expressão heteróloga e análise funcional da família GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE do arroz indica seu papel no fluxo de cálcio desencadeado pelo glutamato nas raízes do arroz. Rice 2016, 9, 9. [CrossRef] [PubMed]

9. Aouini, A.; Matsukura, C.; Ezura, H.; Asamizu, E. Caracterização de 13 genes semelhantes a receptores de glutamato codificados no genoma do tomate por estrutura, filogenia e perfis de expressão. Gene 2012, 493, 36–43. [CrossRef] [PubMed]

10. Li, F.; Wang, J.; Mac.; Zhao, Y.; Wang, Y.; Hasi, A.; Qi, Z. O canal 3.3 semelhante ao receptor de glutamato está envolvido na mediação de transientes citosólicos de cálcio desencadeados por glutationa, alterações transcricionais e respostas de imunidade inata em Arabidopsis. Plant Physiol. 2013, 162, 1497–1509. [CrossRef] [PubMed]

11. Nguyen, CT; Kurenda, A.; Stolz, S.; Chetelat, A.; Farmer, EE Identificação de populações de células necessárias para sinalização elétrica folha a folha em uma planta ferida. Proc. Nacional Acad. ciência EUA 2018, 115, 10178–10183. [CruzRef]

12. Manzoor, H.; Kelloniemi, J.; Chiltz, A.; Wendehenne, D.; Pugin, A.; Poinssot, B.; Garcia-Brugger, A. Envolvimento do receptor de glutamato AtGLR3.3 na sinalização de defesa de plantas e resistência a Hyaloperonospora arabidopsidis. Plant J. 2013, 76, 466–480. [CrossRef] [PubMed]

13. Wang, G.; Hu, C.; Zhou, J.; Liu, Y.; Cai, J.; Pan, C.; Wang, Y.; Wu, X.; Shi, K.; Xia, X.; e outros A sinalização sistêmica de brotos de raiz impulsiona a defesa da raiz baseada em jasmonato contra nematóides. atual Biol. 2019, 29, 3430–3438. [CrossRef] [PubMed]

14. Darwin, CR Plantas Insetívoras; John Murray: Londres, Reino Unido, 1875.

15. Burdon-Sanderson, JS Nota sobre os fenômenos elétricos que acompanham a irritação da folha de Dionæa muscular. Proc. R. Soc. Lond. 1873, 21, 495-496.

16. Sukhova, E.; Akinchits, E.; Sukhov, V. Modelos matemáticos de atividade elétrica em plantas. J. Membro. Biol. 2017, 250, 407–423. [CruzRef]

17. Li, JH; Ventilador, LF; Zhao, DJ; Zhou, Q.; Yao, JP; Wang, ZY; Huang, L. Sinais elétricos de plantas: Um desafio multidisciplinar. J. Plant Physiol. 2021, 261, 153418. [CrossRef] [PubMed]

18. Garcia-Servin, MA; Mendoza-Sánchez, M.; Contreras-Medina, LM Sinais elétricos como opção de comunicação com plantas: Uma revisão. Teor. Exp. Plant Physiol. 2021, 33, 125–139. [CruzRef]

19. Li, M.; Wang, F.; Li, S.; Yu, G.; Wang, L.; Li, Q.; Zhu, X.; Li, Z.; Yuan, L.; Liu, P. Os importadores conduzem a transmissão de ácido jasmônico folha a folha na imunidade sistêmica induzida por feridas. Mol. Plant 2020, 13, 1485–1498. [CruzRef]

20. Agricultor, EE; Gasperini, D.; Acosta, IF A hipótese da célula squeeze para a ativação da síntese de jasmonato em resposta ao ferimento. Novo Fitol. 2014, 204, 282–288. [CruzRef]

21. Ding, S.; Shao, X.; Li, J.; Ahammed, GJ; Yao, Y.; Ding, J.; Hu, Z.; Yu, J.; Shi, K. Formas de nitrogênio e metabolismo afetam a defesa da planta contra patógenos foliares e radiculares no tomate. Ambiente da Célula Vegetal. 2021, 44, 1596–1610. [CruzRef]

22. Li, X.; Yang, R.; Chen, H. A subunidade MED8 do Mediador de Arabidopsis thaliana regula a imunidade da planta a Botrytis Cinerea interagindo com o fator de transcrição FAMA básico de hélice-alça-hélice (bHLH). PLoS ONE 2018, 13, e193458. [CruzRef]

23. Dean, R.; Van Kan, JA; Pretorius, ZA; Hammond-Kosack, KE; Di Pietro, A.; Spanu, PD; Rudd, JJ; Dickman, M.; Kahmann, R.; Ellis, J.; e outros Os 10 principais patógenos fúngicos em patologia molecular de plantas. Mol. Plant Pathol. 2012, 13, 414–430. [CruzRef]

24. Bai, Y.; Lindhout, P. Domesticação e criação de tomates: O que ganhamos e o que podemos ganhar no futuro? Ana. Robô. 2007, 100, 1085–1094. [CrossRef] [PubMed]

25. Wang, X.; Zhou, X.; Cai, Z.; Guo, L.; Chen, X.; Chen, X.; Liu, J.; Feng, M.; Qiu, Y.; Zhang, Y.; e outros Uma cepa de controle biológico de Pseudomonas aeruginosa CQ-40 promove o crescimento e controla Botrytis cinerea em tomate. Patógenos 2020, 10, 22. [CrossRef]

26. Li, H.; Jiang, X.; Lv, X.; Ahammed, GJ; Guo, Z.; Qi, Z.; Yu, J.; Zhou, Y. Tomato GLR3.3 e GLR3.5 medeiam a tolerância ao frio induzida pela aclimatação ao frio regulando a produção apoplástica de H2O2 e a homeostase redox. Ambiente da Célula Vegetal. 2019, 42, 3326–3339. [CruzRef]

27. Hu, C.; Duan, S.; Zhou, J.; Yu, J. Características da transdução de sinal elétrico provocada por herbivoria/ferida em tomate. Frente. Agric. ciência Eng. 2021, 8, 292–301.

28. Zhang, H.; Hu, Z.; Lei, C.; Zheng, C.; Wang, J.; Shao, S.; Li, X.; Xia, X.; Cai, X.; Zhou, J.; e outros Um peptídeo de fitossulfocina vegetal inicia a imunidade dependente de auxina através da sinalização citosólica de Ca2 plus em tomate. Plant Cell 2018, 30, 652–667. [CrossRef] [PubMed]

29. Zhang, S.; Li, X.; Sol, Z.; Shao, S.; Hu, L.; Sim, M.; Zhou, Y.; Xia, X.; Yu, J.; Shi, K. Antagonismo entre a sinalização de fitohormônios fundamenta a variação na suscetibilidade a doenças de plantas de tomate sob CO2 elevado. J. Exp. Robô. 2015, 66, 1951–1963. [CruzRef]

30. Genty, B.; Briantais, JM; Baker, NR A relação entre o rendimento quântico do transporte fotossintético de elétrons e a extinção da fluorescência da clorofila. Biochim. Biophys. Acta 1989, 990, 87-92. [CruzRef]

31. Mãe, Q.; Liu, Y.; Fang, H.; Wang, P.; Ahammed, GJ; Zai, W.; Shi, K. Um papel essencial da alfa-cetoglutarato desidrogenase E2 mitocondrial na resposta imune basal contra patógenos bacterianos no tomate. Frente. Plant Sci. 2020, 11, 579772. [CrossRef]

32. Lião, Y.; Tian, ​​M.; Zhang, H.; Li, X.; Wang, Y.; Xia, X.; Zhou, J.; Zhou, Y.; Yu, J.; Shi, K.; e outros A ligação do ácido salicílico da alfa-cetoglutarato desidrogenase E2 mitocondrial afeta a fosforilação oxidativa mitocondrial e os componentes da cadeia de transporte de elétrons e desempenha um papel na defesa basal contra o vírus do mosaico do tabaco em tomates. Novo Fitol. 2015, 205, 1296–1307. [CruzRef]

33. Stephens, NR; Qi, Z.; Spalding, EP Subtipos de receptores de glutamato evidenciados por diferenças na dessensibilização e dependência dos genes GLR3.3 e GLR3.4. Plant Physiol. 2008, 146, 529–538. [CrossRef] [PubMed]

34. Boldyrev, AA; Carpinteiro, DO; Johnson, P. Evidências emergentes de um papel semelhante dos receptores de glutamato nos sistemas nervoso e imunológico. J. Neurochem. 2005, 95, 913-918. [CruzRef]

35. Fazio, F.; Ulivieri, M.; Volpi, C.; Gargaro, M.; Fallarino, F. Segmentação de receptores metabotrópicos de glutamato para o tratamento de neuroinflamação. atual Opin. Pharmacol. 2018, 38, 16–23. [CruzRef]

36. Ganor, Y.; Levite, M. O neurotransmissor glutamato e células T humanas: Receptores de glutamato e efeitos diretos e potentes induzidos por glutamato em células T humanas normais, células T cancerosas de leucemia e linfoma humano e células T humanas autoimunes. J. Transm. Neural. 2014, 121, 983–1006. [CrossRef] [PubMed]

37. Kang, S.; Kim, HB; Lee, H.; Choi, JY; Ele nós.; Ah, CJ; Kwon, SI; An, CS A superexpressão em Arabidopsis de um receptor de glutamato direcionado à membrana plasmática de rabanete pequeno aumenta o influxo de Ca2 mais mediado por glutamato e retarda a infecção fúngica. Mol. Cells 2006, 21, 418–427.

38. Qi, Z.; Stephens, NR; Spalding, EP Entrada de cálcio mediada por GLR3.3, um receptor de glutamato de Arabidopsis com um perfil agonista amplo. Plant Physiol. 2006, 142, 963–971. [CruzRef]

39. Kadotani, N.; Akagi, A.; Takatsuji, H.; Miwa, T.; Igarashi, D. Aminoácidos proteinogênicos exógenos induzem resistência sistêmica em arroz. BMC Plant Biol. 2016, 16, 60. [CrossRef] [PubMed]

40. Seo, S.; Nakaho, K.; Hong, SW; Takahashi, H.; Shigemori, H.; Mitsuhara, I. L-Histidina induz resistência em plantas ao patógeno bacteriano Gastonia solanacearum parcialmente através da ativação da sinalização de etileno. Fisiol de Células Vegetais. 2016, 57, 1932–1942. [CruzRef]

41. Yang, J.; Sol, C.; Fu, D.; Yu, T. Teste para inibição de L-glutamato de crescimento de Alternaria alternata por indução de resistência em frutos de tomate. Química Alimentar. 2017, 230, 145–153. [CruzRef]

42. Sol, C.; Jin, L.; Cai, Y.; Huang, Y.; Zheng, X.; Yu, T. O tratamento com L-Glutamato aumenta a resistência a doenças do tomate, induzindo a expressão de receptores de glutamato e o acúmulo de aminoácidos. Química Alimentar. 2019, 293, 263–270. [CruzRef]

43. Li, N.; Han, X.; Feng, D.; Yuan, D.; Huang, LJ Sinalização cruzada entre ácido salicílico e etileno/jasmonato na defesa da planta: entendemos o que eles estão sussurrando? Int. J. Mol. ciência 2019, 20, 671. [CrossRef] [PubMed]

44. Agricultor, EE; Gao, YQ; Lenzoni, G.; Wolfender, JL; Wu, Q. Sinais elétricos estimulados por feridas e mecanoestimulados controlam as respostas hormonais. Novo Fitol. 2020, 227, 1037–1050. [CrossRef] [PubMed]

45. Zhang, Y.; Canção, RF; Yuan, HM; Li, TT; Wang, LF; Lu, KK; Guo, JX; Liu, WC Superexpressão do N-terminal de CATALASE2 aumenta a biossíntese do ácido jasmônico da planta e a resistência ao patógeno necrotrófico Botrytis cinerea B05.10. Mol. Plant Pathol. 2021, 22, 1226–1238. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Caarls, L.; Van der Does, D.; Hickman, R.; Jansen, W.; Verk, MC; Proietti, S.; Lourenço, O.; Solano, R.; Pieterse, CM; Van Wees, SC Avaliando o papel dos repressores transcricionais do fator de resposta ao etileno na supressão mediada pelo ácido salicílico de genes responsivos ao ácido jasmônico. Fisiol de Células Vegetais. 2017, 58, 266–278. [CruzRef]

47. Tanaka, K.; Heil, M. Padrões moleculares associados a danos (DAMPs) na imunidade inata da planta: Aplicando o modelo de perigo e as perspectivas evolutivas. Annu. Rev. Phytopathol. 2021, 59, 53–75. [CruzRef]

Shuxian Feng †, Caizhe Pan †, Shutting Ding, Qiaomei Ma, Chaoyi Hu, Ping Wang e Kai Shi *.

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Esses autores contribuíram igualmente para este trabalho.

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