O biomarcador diagnóstico para doenças renais diabéticas: expressão de microRNAs

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PARTE Ⅰ: Perfil de Expressão de MicroRNA na Doença Renal Diabética

HIROKIISHII,SHOHEI KANEKO,KATSUNORI YANAl,AKINORI AOMATSU,KEIJ HIRal, SUSUMU OOKAWARA, & YOSHIYUKI MORISHITA

INTRODUÇÃO

A prevalência da doença renal diabética (DRD) está crescendo rapidamente em todo o mundo e está relacionada a encargos econômicos e sociais substanciais, pois é a principal causa de doença renal terminal e está associada ao desenvolvimento de várias complicações vasculares¹. Para melhorar o prognóstico da DKD(doença renal diabética), seu diagnóstico precoce e agentes de tratamento específicos são necessários. No entanto, ambos não foram estabelecidos.

O diagnóstico definitivo de DKD (doença renal diabética) requer a análise histológica de biópsias renais. No entanto, a biópsia renal é invasiva, é difícil obter amostras diagnósticas e não é apropriada para procedimentos repetidos. Assim, várias moléculas de soro ou urina, como colágeno IV, pró-peptídeo COOH-terminal de colágeno VI e receptor de fator de necrose tumoral 1 de 2, foram avaliadas para uso como marcadores diagnósticos de DKD(doença renal diabética),^2-4 mas nenhum ainda se estabeleceu para uso clínico.^5-7

Sobre o tratamento da DKD(doença renal diabética), vários medicamentos, como bloqueadores do sistema renina-angiotensina, inibidor do cotransportador sódio-glicose 2 e análogos do peptídeo semelhante ao glucagon-1, demonstraram ter efeitos protetores na DKD(doença renal diabética),^8-10 mas nenhum é ideal. Assim, há uma necessidade urgente de identificação de biomarcadores diagnósticos e agentes terapêuticos para DKD(doença renal diabética).

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MicroRNAs(miRNAs) têm atraído atenção como biomarcadores específicos de doenças e alvos terapêuticos para várias doenças, como câncer e várias doenças inflamatórias.^11,12miRNAs(MicroRNAs) são pequenos RNAs não codificantes de aproximadamente 22 nucleotídeos de comprimento que atuam como reguladores pós-transcricionais de genes alvo e suas proteínas derivadas, induzindo a degradação do RNAmiR mensageiro e/ou repressão traducional.^13,14 NAs are thought to be responsible for the regulation of >60 por cento de todos os níveis de expressão de proteínas, desempenhando assim papéis fundamentais e diversos nos processos fisiopatológicos em várias doenças¹⁵.

Estudos anteriores mostraram que vários miRNAs(MicroRNAs)estão envolvidos na patogênese da DKD(doença renal diabética), e consequentemente, podem representar biomarcadores úteis ou alvos terapêuticos para DKD(doença renal diabética).^16.17 No entanto, mais estudos para investigar os papéis reguladores dos miRNAs(MicroRNAs)em DKD(doença renal diabética)são necessários e esses miRNAs(MicroRNAs)podem ser desenvolvidos como biomarcadores diagnósticos e agentes terapêuticos para DKD(doença renal diabética). Portanto, no presente estudo, investigamos miRNAs(MicroRNAs)envolvido em DKD(doença renal diabética)e determinaram seu potencial como biomarcadores específicos ou agentes terapêuticos para DKD(doença renal diabética).

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MATERIAL E MÉTODOS

Modelo animal.Os camundongos foram alojados em uma sala com temperatura e umidade controladas sob condições de microisolador antiviral e livre de anticorpos. Camundongos machos db/db (C57BLKS/J lar - plus Leprdb/ plus Leprdb) e seus camundongos m/m normais da mesma ninhada (C57BLKS/J Iar-m plus /m plus) foram adquiridos do Instituto de Reprodução Animal (Ibaraki, Japão) . Camundongos AKITA machos (camundongos C57BL/6-Ins2Akita/J) e seus irmãos de ninhada normais (C57BL/6J) foram obtidos da Japan SLC, Inc. (Tóquio, Japão).

A isquemia e reperfusão renal foram realizadas conforme descrito anteriormente.¹⁸ Resumidamente, camundongos machos C57BL/6J (Tokyo Laboratory Animals Science, Tóquio, Japão) foram anestesiados com isoflurano e o pedículo renal direito foi identificado, ligado e uma nefrectomia direita realizada. O pedículo renal esquerdo foi então identificado e clampeado com clipe microvascular não traumático por 45 min. As pinças foram removidas após o término do período de isquemia e a reperfusão bem sucedida foi confirmada visualmente. Camundongos sham-operados foram submetidos ao mesmo procedimento cirúrgico, sem pinçamento do pedículo renal. Os animais foram sacrificados 24 h após a reperfusão.

Obstrução ureteral unilateral foi realizada conforme relatado anteriormente.¹⁹Resumidamente, camundongos machos C57BL/6J (Tokyo Laboratory Animals Science) foram anestesiados com isoflurano e, em seguida, o ureter esquerdo foi exposto através de uma incisão abdominal na linha média, completamente ligado com seda 4-0 em dois pontos e seccionado entre eles. O grupo sham-operado não foi submetido à ligadura. Os camundongos foram sacrificados e seus rins esquerdos coletados 7 dias após a cirurgia.

Camundongos acelerados por senescência masculina (SAMP1/YitFcsJ) e camundongos de controle (SAMR/YitFcsJ) foram adquiridos da SLC Japan.²⁰Esses camundongos foram sacrificados com 48 semanas de idade. Camundongos HIGA machos (HIGA/NscSlc) e camundongos BALB/cCrSlc, que foram selecionados como a cepa de controle devido às suas baixas concentrações séricas de IgA, foram obtidos da Japan SLC.

Os rins e o sangue foram coletados, o soro foi obtido e a maioria dos tecidos foi armazenada em grau -80 . Os rins esquerdos foram usados ​​para análise histológica e os rins direitos foram usados ​​para mRNA e miRNA(MicroRNAs)quantificação. Para as análises bioquímicas, os camundongos foram transferidos para gaiolas metabólicas individuais para a coleta de 24-h amostras de urina. As concentrações urinárias de albumina e creatinina foram medidas usando um kit de ensaio de albumina urinária de camundongo LBIS (tipo S) (Fujifilm Wako, Shibayagi, Gunma, Japão) e um kit de creatinina Lab-Assay (Fujifilm Wako, Osaka, Japão), respectivamente.

Pacientes e indivíduos saudáveis.Recrutamos pacientes com doença renal crônica submetidos à biópsia renal na Saitama Jichi Medical University entre maio de 2016 e maio de 2019. Vinte e cinco pacientes foram recrutados para o DKD(doença renal diabética)grupo e foram comparados com pacientes que tinham outras doenças renais que não DKD (n=50 pacientes; nefropatia por IgA 17, nefropatia membranosa 9, síndrome nefrótica de alteração mínima 6, nefrosclerose 4, nefrite intersticial 3,IgG4-associada nefropatia 3, nefrite lúpica 2 e outras doenças renais 6) e foram pareados por suas características basais. Cada caso foi revisado por vários patologistas experientes para garantir que as amostras de biópsia mostrassem alterações patológicas adequadas à categoria da doença e não mostrassem alterações significativas características de outras doenças. DKD(doença renal diabética)foi diagnosticada pelos achados característicos de aumento da matriz mesangial, glomeruloesclerose nodular, espessamento difuso da membrana basal glomerular e hialinose concomitante das arteríolas aferentes e eferentes.²¹ Diabetes mellitus foi diagnosticado usando o critério da American Diabetes Association A TFG foi estimada usando a Dieta na ria renal.²² Método de doenças (MDRD), modificado para os japoneses (ml/min/seguidores: população, eGFR,as;1x creatinina sérica1,73m²）=0,881×186,3×idade-0,2{{9 }}3×(×0,742 para mulheres).^23,24

Análise de microarrays.Análise de miRNA(MicroRNAs)expressão foi realizada pela Hokkaido System Science (Hokkaido, Japão). Os detalhes da análise do microarray foram descritos em outro lugar.²⁵Resumidamente, o RNA foi desfosforilado e então ligado a Cy3-pCp usando um miRNA(MicroRNAs)Reagente de rotulagem completo e kit Hyb (Agilent Technologies, CA, EUA) e um miRNA(MicroRNAs)Kit Spike-in (Tecnologias Agilent). O miRNA(MicroRNAs)O reagente de rotulagem completo e o kit Hyb foram usados ​​para hibridizar os cRNAs. Após a hibridização, os microar-rays foram lavados usando um Gene Expression Wash Pack (Agilent Technologies) e digitalizados com um Agilent Microarray Scanner. As intensidades de sinal foram avaliadas com Agilent Feature Extraction ver.12.0.3.1. A análise de expressão de mRNA também foi realizada pela Hokkaido System Science. O RNA foi marcado com Cy3-usando um kit de rotulagem Quick-Amp de baixa entrada, One-Color (Agilent Technologies). As amostras de cRNA marcadas foram hibridizadas com um miRNA de camundongo(MicroRNAs)Microarray 8×60K rel.21.0(Agilent Technologies) a 65 graus por 17h usando um Kit de Hibridização de Expressão Gênica (Agilent Technologies). Após a hibridização, os microarrays foram lavados com componentes do Gene Expression Wash Buffers Pack (Agilent Technologies) e digitalizados com um Agilent Microarray Scanner. As intensidades de sinal foram avaliadas usando o Agilent Feature Extraction ver.12.0.3.1. A normalização foi obtida usando o método de deslocamento do percentil 90, um método comumente usado para microarray, conforme descrito anteriormente.²⁶ The results were analyzed using GeneSpring software v12.1(Agilent Technologies). Statistical analysis was carried out using one-way ANOVA with a post hoc Tukey honestly significant difference test. Fold changes with a cut-off value>4 e um valor P<0.05 were="" considered="" to="" indicate="" statistically="" significant="" differences.="" the="" genespring="" single="" experiment="" analysis="" (sea)bioinformatics="" tool="" was="" used="" for="" computational="" analysis="" to="" identify="" potential="" curated="" canonical="" pathways="" that="" were="" enriched="" in="" the="" transcript="" list="" showing="" a="" significant="" gene="" expression="" difference="" between="" the="" control="" mice,db/db="" mice,db/db="">(MicroRNAs)-181b-5p-mimic-PEI-NPs e camundongos db/db mais controle-miRNA(MicroRNAs)Grupos -PEI-NPs usando o banco de dados WikiPathways Alvo previsto. FmRNAs de miRNAs foram pesquisados ​​usando o software Target Scan.

Tabela I.Lista de miRNAs(MicroRNAs)expresso diferencialmente nos rins de camundongos AKITA por análise de microarray

Transcrição reversa quantitativa em tempo real-PCR.Os detalhes dos ensaios quantitativos de transcrição reversa-PCR (qRT-PCR) em tempo real para medir mRNA e miRNA(MicroRNAs)expressão nos rins de camundongos foi descrita anteriormente.²⁷Para medir miRNA(MicroRNAs)expressão, amostras de rim foram homogeneizadas usando um homogeneizador de vidro e um triturador de coluna de filtro (coluna trituradora QIA; Qiagen, Hilden, Alemanha), então o RNA foi extraído usando um mini kit miRNeasy (Qiagen). Um micrograma de cada amostra de RNA foi transcrita reversa em cDNA usando o sistema miRScript PCR (Qiagen). O qRT-PCR foi então realizado usando um kit miScript SYBR Green PCR e primers específicos para miRNA-20a-5p, miRNA-34a-5p,miRNA{{6} }b-5p,miRNA-129-1-3p, miRNA-129b-5p,miRNA-142a-3p,miRNA{{13} }a-5p, miRNA-181b-5p, miRNA-223-3p,miRNA-146a-5p, rmiRNA{{20} }p,miRNA-652-3p,miRNA-342-3p,rmiRNA-6401,e miRNA-6980-5p(miScript Primer Assays; Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de expressão foram normalizados para U6-snuRNA e foram calculados como diferenças de dobra (2-△ACT) dos níveis de expressão de controle normal. Os níveis de expressão de U6 não foram estatisticamente diferentes entre todos os grupos deste estudo.

Para medir o miRNA(MicroRNAs)níveis em soro humano e de camundongo, o RNA foi preparado a partir de amostras de 300 μL de soro usando uma coluna NucleoSpin miRNA Plasma (Macherey-Nagel, Duren, Alemanha) e um kit miRNeasy Serum/Plasma (Qiagen). Em seguida, o RNA isolado foi transcrito reverso usando um kit miScript I RT (Qiagen).qRT-PCR foi realizado usando um kit miScript SYBR Green PCR (Qiagen).Primers para miRNA-20a-5p ,miRNA-34a-5p,miRNA-125b-5p,miRNA-129-1-3p,

miRNA(MicroRNAs)-142a-3p,miRNA-1129b-5p,miRNA-142a-5p,miRNA-146a{{ 7}}p,miRNA-181b-5p,miRNA-455-5p,miRNA-342-3p,n miRNA-223-3p, miRNA-652-3 p,miRNA-6401 e miRNA-6980-5p foram adquiridos da Qiagen. Os níveis de cada miRNA foram normalizados aos de miRNA-16 como controle endógeno. Os níveis de expressão sérica de miRNA-16a-5p não foram estatisticamente diferentes entre todos os grupos deste estudo.

Para medir a expressão de mRNA, amostras de rim foram homogeneizadas usando um homogeneizador de vidro e um triturador de coluna de filtro (coluna trituradora QIA; Qiagen). O RNA foi isolado usando um kit RNeasy Total RNA Isolation (Qiagen) e 1ug de cada amostra de RNA foi transcrita reversa usando o sistema de síntese SuperscriptII First Strand (Life Technologies, MA, EUA). qRT-PCR foi realizado usando SYBR GreenER qPCR SuperMix (Life Technologies). Primers para Cadeia Alfa 1 de colágeno Tipo I de camundongo, Cadeia Alfa 1 de colágeno Tipo IV foram adquirido da Takara Bio (Shiga, Japão). A expressão de cada mRNA alvo foi normalizada para a de beta-actina como o gene de referência.

Figura 1.Mapa de calor dos miRNAs expressos diferencialmente(MicroRNAs)nos rins de camundongos AKITA. O mapa de calor mostra o agrupamento hierárquico e as variações sistêmicas na expressão de miRNAs(MicroRNAs)em rins de camundongos de cada grupo (n=4 por grupo). Os miRNAs mostrados em vermelho demonstraram alta expressão e aqueles mostrados em verde demonstraram expressão relativamente baixa. (A versão colorida da figura está disponível online.)

Preparação do miRNA(MicroRNAs)-181b-5p imitação.miRNA(MicroRNAs)-181b-5pe RNA pequeno codificado (miRNA de controle) foram sintetizados pela Ajinomoto Bio-Pharma Services (Osaka, Japão). A sequência do miRNA-181b{{5} }p mimetizador foi 5'-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG-GUU-3' e o do miRNA de controle(MicroRNAs)era 5'-GGUUCGUACGUACUCUGUCA-3'.

Entrega de miRNA(MicroRNAs)-181b-5p-PEI-NPs para os rins.Para investigar os efeitos do miRNA(MicroRNAs)-181b-5p mimic treatment, NPs lineares baseados em PEI (in vivo jet PEI; Polyplus-transfection,llkirch-graffenstaden, França) foram usados, conforme descrito anteriormente.²⁷Resumidamente, miRNA(MicroRNAs)-PEI-NPs （miRNA∶ 50ug, razão de nitrogênio （N） no polímero para fosfato (P) nos ácidos nucleicos =6) foram dissolvidos em 200μL de solução de glicose a 5 por cento e injetados em camundongos db/db via uma veia da cauda, ​​de acordo com o protocolo do fabricante. Os seguintes grupos serviram como controles: (1) irmãos de ninhada normais (m/m), (2) camundongos db/db não tratados e (3) camundongos db/db injetados com miRNA de controle(MicroRNAs)-PEI-NPs usando o mesmo protocolo. Para avaliar o potencial terapêutico do miRNA-181b-5p para DKD(doença renal diabética), injetamos miRNA-181b-5p-PEI-NPs ou control-miRNA-PEI-NPs em 10-camundongos db/db semanalmente por 10 semanas.

Figura 2.Mapa de calor dos miRNAs expressos diferencialmente(MicroRNAs)nos rins de camundongos db/db. O mapa de calor mostra o agrupamento hierárquico e as variações sistêmicas na expressão de miRNAs nos rins de cada grupo (n=4 por grupo). Vermelho, expressão mais alta; azul, expressão mais baixa. (A versão colorida da figura está disponível online.)

Histologia,Fluorescência, e euimuno-histoquímica.Após a dissecção dos rins, uma parte representativa de cada rim foi imediatamente fixada em paraformaldeído a 4% tamponado com PBS e embebido em parafina. Seções（5 μm） foram usadas para imunocoloração e coloração com ácido periódico de Schiff (PAS). A expansão mesangial foi avaliada em cortes corados por PAS calculando o índice mesangial (M) de acordo com o protocolo Animal Model of Diabetic Com-plications (AMDCC): área (número de pixels) de coloração PAS/área total (número de pixels) de os glomérulos. O MI foi calculado para pelo menos 20 glomérulos por grupo (3-4 glomérulos por camundongo e seis camundongos de fita dupla e por grupo).Oligonucleotídeos marcados com Cy3-(Cy3-miRNA(MicroRNAs);Takara Bio) foram usados ​​para avaliar a distribuição renal de miRNA injetado por via intravenosa(MicroRNAs)-PEI-NPs, conforme descrito anteriormente.²⁷Brifly,Cy3-miRNA(MicroRNAs)foi complexado com PEI-NPs e injetado intravenosamente em camundongos db/db, então os rins foram removidos 1 h depois. As seções (5-μm de espessura) foram incubadas por 2 h em temperatura ambiente com lectina de Lotus tetragonolobus marcada com fluoresceína (Vector Laboratories, CA, EUA) e DAPI foi usado como contracoloração. O nível de fluorescência foi então avaliado por microscopia de fluorescência (BZ-X710;Keyence, Osaka, Japão) e software BZ-X_Analyzer (Keyence). Para o estudo imunoquímico, mAbs de camundongo contra colágeno I(NB{{ 10}}, Novus Biologicals, CO, EUA) e IV(NB120-6586, Novus Biologicals), e anticorpo secundário policlonal de cabra contra HRP de camundongo e coelho(PI-1000, Vector Laboratories) foram usados . As amostras de tecido foram incorporadas em Tissue-Tek OCT Compound (Sakura Finetek Japan, Tokyo, Japan) e congeladas em nitrogênio líquido. Seções de criostato (5- μm de espessura) foram montadas em lâminas de vidro revestidas com silano (Matsunami Glass Ind, Osaka, Japão).

Hibridação in situ.ISH para miRNA(MicroRNAs)-125b-5p e miRNA-181b-5p foi realizado usando sondas de detecção miRCURY LNA marcadas com dupla digoxigenina (Qiagen). Uma sonda embaralhada serviu como controle negativo e U6 serviu como controle positivo. O procedimento foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante.²⁸Brevemente, seções de rim de camundongo embebidas em parafina (5-μm）foram desparafinizadas, lavadas em PBS e tratadas com proteinase K por 10 min a 37 graus C. As lâminas foram então incubadas com uma sonda marcada com LNA-digoxigenina (40 nM) em câmara úmida durante a noite a 60 graus. Após a lavagem, as seções foram incubadas durante a noite com anticorpo antidigoxigenina conjugado com fosfatase alcalina a 4 graus. Em seguida, as lâminas foram reveladas usando cloreto de nitroazul tetrazólio/5-brom{{9 }}cloro{10}}'-indolifosfatase ptoluidina solução (Life Tech-nologies) durante a noite no escuro à temperatura ambiente.As fotomicrografias foram então obtidas sob um microscópio de luz (BZ-X710; Keyence).

Tabela II.Lista de miRNAs(MicroRNAs)expresso diferencialmente nos rins de camundongos db/db por análise de microarray

Aprovação do estudo.O estudo foi conduzido de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque e foi aprovado pelo Comitê de Ética da Jichi Medical University (número de aprovação 17-023, 11 de outubro de 2017). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes. Os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Jichi Medical University e foram realizados de acordo com as diretrizes de Uso e Cuidados de Animais Experimentais do Guia para Animais de Laboratório da Jichi Medical University.

Estatisticas.Os dados foram analisados ​​usando o software JMP (versão 13.0.0; SAS Institute Inc, Cary, NC, EUA). Os resultados são expressos como médias ± DPs. As médias foram comparadas por meio de análise de variância unidirecional e, caso houvesse diferenças estatisticamente significativas, o teste de Tukey foi realizado post hoc para comparar as médias de dois grupos diferentes. Para as variáveis ​​categóricas, as diferenças foram analisadas pelo teste do qui-quadrado. A regressão logística foi realizada e as AUCs foram calculadas.P<0.05 was="" considered="" to="" represent="" statistical="">

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Abreviaturas:IMC= índice de massa corporal; DAPI=4,6-diamidino-2-fenilindol; FITC= isotiocianato de fluoresceína; DKD=doença renal diabética; eGFR= taxa de filtração glomerular estimada; lipoproteína de alta densidade HDL; HIGA= imunoglobulina A alta; IRI= lesão de isquemia-reperfusão;LDL= lipoproteína de baixa densidade; ns= não significativo; PEI-NPs= nanopartículas de polietilenoimina;RNU6=U6 Small Nuclear 1; SAMP=mouse acelerado por senescência; controle SAMR=para o camundongo acelerado por senescência; UACR= relação albumina-creatinina na urina; UUO=obstrução ureteral unilateral

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Nota: A erva medicinal tradicional chinesa cistanche (também conhecida como "erva dragão" e "ginseng do deserto"), cresce apenas nos desertos áridos e quentes. Como uma das nove ervas imortais, Cistanche (cistanche tubulosa/cistanche deserticola/desertliving cistanche/cistanche salsa) contém ingredientes ricos e eficazes, como echinacoside, acteoside, glicosídeos feniletanóides totais, flavonóides, polissacarídeos, etc. erva nutritiva e material alimentar para a imunidade das pessoas, órgãos internos e células cerebrais e neurônios, etc. Os estudos farmacológicos modernos confirmaram os seguintes efeitos do cistanche (benefícios do cistanche): melhorar a imunidade; melhorar a função sexual e a função renal; anti-fadiga; anti-envelhecimento; melhorar a memória; doença anti-Parkinson; doença anti-Alzheimer; antioxidante; facilidade-constipação; anti-inflamatório; promover o crescimento ósseo, clareamento da pele; proteger o fígado; etc.

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