O papel central do fator de crescimento transformador (TGF-) no desenvolvimento da fibrose renal
Mar 26, 2022
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PARTE Ⅰ: Papel do Fibroblasto Renal Primário Humano em TGF- 1-Dispositivos que Simulam Fibrose Mediada
Seong-Hye Hwang, Yun-Mi Lee & et al.
1. Introdução
Fibrose renal, a via final comum de inúmeras doenças renais progressivas, é caracterizada por aumento na produção de proteínas da matriz extracelular (MEC), declínio na degradação da matriz, disfunção da interação célula-matriz, transformação de células residentes e infiltração de células inflamatórias.Fator de crescimento transformador -(TGF-) é um peptídeo dimérico multifuncional que regula processos biológicos como proliferação celular, diferenciação e respostas imunológicas [1]. Entre os inúmeros fatores fibrogênicos, o TGF- (Fator de crescimento transformador -) desempenha um papel central e tem um efeito anti-inflamatório. TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)camundongos deficientes morrem de inflamação maciça. Camundongos transgênicos superexpressando TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)estão virtualmente protegidos do desenvolvimento de patologia fibrótica renal, principalmente por meio de sua atividade anti-inflamatória [2]. As propriedades profibróticas e anti-inflamatórias do TGF-(Fator de crescimento transformador -)são facas de dois gumes em relação à aplicação terapêutica do TGF-(Fator de crescimento transformador -)inibição. Esforços notáveis foram feitos para obstruir o TGF-(Fator de crescimento transformador -)ação para impedir a progressãorenalfibrose[3]. Embora muitas abordagens tenham sido utilizadas para combaterrenalfibrose, um modelo experimental para avaliar os medicamentos atualmente disponíveis não é o ideal.
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Em geral, os estudos em animais desempenham um papel fundamental nos testes pré-clínicos na previsão da farmacocinética e da eficácia do medicamento. No entanto, existem várias diferenças entre animais e humanos, o que nos leva a questionar a precisão dos testes de eficácia e segurança de medicamentos baseados em animais 4. Relatórios anteriores dependeram de estudos pré-clínicos em animais durante o desenvolvimento de medicamentos para avaliar a nefrotoxicidade e a segurança dos medicamentos. O funcionamento renal dos animais é mais que o dobro dos rins humanos. Assim, as drogas são metabolizadas mais rapidamente em animais do que em humanos, dificultando a elucidação dos resultados dos testes de toxicidade de drogas usando estudos em animais. Além disso, os resultados de experimentos com animais não podem ser usados para prever respostas a drogas em humanos, pois os animais têm diferentes funções fisiológicas. Baseado em animaisfibrose renalmodelos têm dificuldades em reproduzirfibrose renal; portanto, a pesquisa está em andamento para superar os obstáculos atuais e otimizar as plataformas de descoberta de drogas [5].
A tecnologia Organ-on-a-chip (OoC) surgiu como um novo conceito para resolver esses problemas. Esta plataforma foi projetada considerando as deficiências atuais, e tem se mostrado muito promissora no campo da nefrologia [6]. Além disso, os modelos OoC têm um grande potencial como substitutos para modelos animais experimentais, fornecem uma solução para diferenças entre espécies e podem ajudar a acabar com a crueldade animal e os debates éticos [7]. Existem poucos modelos in vitro que utilizam simultaneamente fibroblastos renais primários com células endoteliais e epiteliais, que são células importantes narimfibrose. O papel de cada célula nafibroseestá sendo estudado separadamente; no entanto, há conhecimento limitado sobre a interação das células.
No presente estudo, desenvolvemosfibrose-dispositivos que mimetizam usando fibroblastos primários humanos. Confirmamos que TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)O tratamento tem vários efeitos sobre ofibrose renalmodelo. Notavelmente, os fibroblastos desempenham um papel fundamental como células efetoras, promovem a formação de um microambiente pró-fibrótico e secretam fatores de crescimento e citocinas. Portanto, com base neste novo método, os fibroblastos podem fornecer um sistema modelo celular ideal para estudar a doença renal. Avaliamos se fibroblastos derivados de doença renal fibrótica afetam a integridade de células cultivadas em três dimensões (3D). Por fim, apresentamos um estudo de prova de princípio que demonstra o potencial dafibrose renal-dispositivos que mimetizam como um modelo para prever a resposta afibrose renal.
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2. Resultados
2.1.Identificação de alfa actina do músculo liso (a-SMA) e queratina-8(KRT-8) por TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)em células HK-2
Na fase inicial, examinamos marcadores conhecidos defibrosee o citoesqueleto em culturas bidimensionais (2D). Ensaios de coloração imunofluorescente foram realizados para estimar a expressão -SMA de fibrose e marcador de transição epitelial tubular para mesenquimal (EMT) e níveis de KRT8 como marcador de citoesqueleto. A coloração de imunofluorescência mostrou que a expressão de -SMA era originalmente fraca e os níveis de KRT8 eram altos nas células epiteliais de monocamada HK-2. Não houve alteração significativa na intensidade de fluorescência por TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)(5 ng/mL) ou o tratamento com inibidor específico de células epiteliais HK-2 por 24 h (Figura 1).
Figura 1. A imunofluorescência mostra que a expressão de alfa-SMA e queratina-8(KRT8) foi mantida pelo tratamento de TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)ou o inibidor em células HK-2.(A)A expressão de alfa-SMA e (B)CCK-8 não teve efeito nas células HK-2por TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)(5ng/mL) ou o inibidor. As células foram originalmente plaqueadas a uma densidade de 1 × 10 graus por poço (ac) controle não tratado e （df）estimulado com 5ng/mL TGF- 1(Fator de crescimento transformador -) ou (gi) inibidor de 10 μM (SB431542) por 24 h e fixado com 4 por cento de paraformaldeído. As células foram então coradas com anti- -SMA e anti-citoqueratina-8 por 20 min. A co-coloração com corante Hoechst H33342 para identificar os núcleos celulares foi realizada. Barras de escala em micrografias indicam 200 um.
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2.2. Expressão KRT8 diminuída por TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)em um chip
Em seguida, avaliamos os níveis de expressão de -SMA e KRT8 em HK cultivada em 3D-2 e o comprimento total de GFP-células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) tratadas com TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)e um inibidor específico. Para conseguir isso, primeiro estabelecemos um padrão de chip de tecido compreendendo dois tipos de células, células epiteliais HK-2 e GFP-HUVECs. Após a confirmação da construção, expusemos o chip de tecido com TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)(5 ng/mL) ou um inibidor específico (10 um SB431542) por 24 h.
Conforme mostrado na Figura 2A-C, a expressão de -SMA não foi alterada especificamente por TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)ou o tratamento inibidor específico. No entanto, a expressão de KRT8 foi reduzida no chip co-cultivado do tipo de duas células. Além disso, a adição de um inibidor de TGF-ß1 aumentou a expressão de KRT8.
Examinamos a formação de uma rede semelhante a capilar tubular 3D por TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)tratamento em HUVECs, pois as células endoteliais podem formar espontaneamente uma rede tubular 3D semelhante a um capilar. De acordo com nossas condições culturais, a formação de linhas grossas diminuiu significativamente. No entanto, linhas finas semelhantes a capilares foram aumentadas no TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)GFP-HUVECs tratadas. No caso do TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)tratamento com inibidor no chip cultivado em 3D, o comprimento total das linhas grossas e grossas mostrou uma tendência reversa para TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)tratamento. Um aumento no comprimento da linha grossa foi observado em comparação com o grupo controle não tratado. Um padrão semelhante foi observado no diâmetro da linha grossa em GFP-HUVEC após TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)tratamento e tratamento com inibidor. O diâmetro do GFP-HUVEC foi suprimido pelo TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)tratamento, mas aumentou independentemente da espessura da linha pelo inibidor em comparação com os controles e TGF- 1(Fator de crescimento transformador -). O comprimento total e o diâmetro da linha grossa foram drasticamente aumentados pelo tratamento com inibidor de TGF- 1 em comparação com o controle não tratado e o tratamento com TGF- 1. Notavelmente, os resultados obtidos indicaram um aumento da densidade de pequenos vasos no TGF-(Fator de crescimento transformador -)-tratado em comparação com seus homólogos não tratados. Em contraste, a densidade de vasos espessos no TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)grupo de tratamento foi menor do que no grupo de controle não tratado (Figura 2D, E).
Figura 2. Expressão KRT8 em HK-2 e comprimento total e diâmetro das HUVECs.(A) A imunofluorescência mostra que a expressão de -SMA foi mantida e a expressão de KRT8 foi drasticamente diminuída pelo tratamento de TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)em Hong Kong-2. As células foram plaqueadas e estimuladas com 5ng/mL de TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)ou inibidor de 10 μm （SB 431542） por 24 h e fixado com paraformaldeído a 4 por cento. As células foram coradas com anti- -SMA e anti-citoqueratina-8 por 20 min. A co-coloração com corante Hoechst H33342 para identificar os núcleos celulares foi realizada. A expressão de -SMA(ac) não teve alteração, mas KRT8(df) em células HK-2 e GFP em HUVEC (gi) expressão foram significativamente alteradas por TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)(5 ng/mL) e o inibidor (B, C). No comprimento total das HUVECs, o vaso fino foi aumentado, mas o vaso espesso foi diminuído por TGF- 1(Fator de crescimento transformador -). O diâmetro foi aumentado tanto nos vasos finos quanto nos espessos. Esses resultados foram revertidos pelo inibidor SB431542 (D, E). As barras de escala nas micrografias indicam 100 μm.*p<><><0.001 versus="" the="" control=""><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" statistical="" significance="" of="" the="" length="" compared="" to="" the="" non-treated="" cells="" is="" represented="" in="" the="" graph.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
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2.3. TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)Afeta três tipos de células do chip com uma estrutura de vários compartimentos
Para estudar o TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)respostas do chip 3D proposto, realizamos imunocoloração em cada compartimento separadamente (Figura 3). Fibroblastos renais humanos primários foram utilizados nesta análise. As amostras foram analisadas usando FACS e confirmadas como positivas para o anticorpo marcador de fibroblastos. Após a incubação dos três tipos de células com TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)por 24 h, foi realizada imunocoloração para avaliar a expressão de -SMA e KRT8. A expressão de a-SMA foi regulada positivamente pelo tratamento com TGF-1, e resultados opostos foram observados com TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)tratamento com inibidor. Por outro lado, a expressão de KRT8 foi regulada negativamente por TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)e mostrou uma resposta oposta ao TGF-(Fator de crescimento transformador -)inibidor (Figura 4A-C).
Figura 3. Imagem de amostra com demonstração esquemática do dispositivo da fabricação e cronograma experimental.(A) As duas imagens superiores mostram o layout. A imagem à esquerda mostra uma foto geral de cima para baixo do dispositivo. As imagens inferiores mostram a seção transversal. Vista esquemática detalhando as dimensões das guias de líquidos. (B) Esta figura descreve os cronogramas experimentais parafibrose-dispositivos de imitação. O processo de carregamento de quatro etapas para cada poço. Localização de cada área de modelagem de hidrogel, bem como a colocação do meio em seção transversal isométrica e de cima para baixo. (1) Um total de 1,5 uL de hidrogel 1 é guiado espontaneamente para o canal central. (2)O canal central é preenchido com 5uL de hidrogel. (3) Um total de 10 uL de hidrogel 3 são padronizados no fundo do reservatório. （4）Um total de 200μL de mídia é dispensado. Barra de escala vermelha=9 mm.
Conforme representado na Figura 4D-G, o comprimento da linha fina semelhante a capilar foi significativamente aumentado por TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)tratamento nas GFP-HUVECs. No entanto, a espessura da linha grossa foi diminuída no TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)HUVECs tratadas. O diâmetro foi reduzido em média para os vasos finos e grossos nas HUVECs. No caso do TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)tratamento com inibidor no chip cultivado em 3D, o comprimento total das linhas grossas e grossas mostrou uma tendência oposta ao tratamento com TGF- 1. Além disso, o comprimento da linha grossa foi aumentado em comparação com o grupo controle não tratado.
Figura 4. Alteração de HK-2 cultivada em 3D e HUVECs com fibroblastos renais primários.As células totais foram plaqueadas a uma densidade de 5×10 graus por chip 3D e estimuladas com 5 ng/mL de TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)ou inibidor de 10 μm （SB 431542） por 24 h e fixado com paraformaldeído a 4 por cento. (A) As células no chip 3D foram coradas com anti-o-SMA e anti-citoqueratina-8. A expressão de -SMA (ac) foi aumentada e a expressão de KRT8(df) foi diminuída por TGF- 1(5 ng/mL) significativamente. O comprimento total das HUVECs; vasos finos foram dramaticamente aumentados e vasos espessos foram diminuídos por TGF-ß1(Fator de crescimento transformador -)(D, E). O diâmetro foi diminuído para vasos finos e grossos (F, G). Esses resultados foram revertidos pelo inibidor SB431542. Barras de escala em micrografias indicam 100 μm.*p<><0.01,and **=""><0.001 versus="" the="" control=""><><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
2.4.TGF-81 Modula o Mediador Inflamatório e Fatores de Crescimento
Em seguida, investigamos as citocinas inflamatórias e fatores de crescimento no sobrenadante; IL-1 , FGF-2, TGF- 2(Fator de crescimento transformador -), e TGF- 3(Fator de crescimento transformador -)a secreção de proteína foi dramaticamente maior nos chips cultivados em 3D do que nos fibroblastos 2D bem cultivados, embora tivessem a mesma contagem total de células. No entanto, TGF- 1(Fator de crescimento transformador -) os níveis foram semelhantes, pois os modelos cultivados em 2D ou 3D foram tratados com concentrações semelhantes de TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)(Figura 5A-E). Particularmente, a liberação de FGF-2 de fibroblastos renais primários humanos foi de 20,9 ± 0,4 pg/dia/5 × 10 graus de células da cultura monocamada 2D e 3094,8 ± 0,2 pg/dia/5 × células de 10 graus, incluindo as HUVECs e HK-2 do chip cultivado em 3D no controle não tratado. A secreção de FGF-2 por TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)estimulação foi de 31.0±0,2pg/dia/5×10 células de grau para a cultura 2D e 3683,9±0,8 pg/dia/5×10 graus de células para a cultura 3D -chip cultivado. Esse aumento na produção de proteína FGF-2 na cultura de monocamada 2D foi acompanhado por um aumento no modelo de chip cultivado em 3D por TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)tratamento (Figura 5B).
Figura 5. Comparação de modelos cultivados em 2D e 3D como plataformas que mimetizam fibrose renal.As células foram plaqueadas a uma densidade de 5×10 graus por poço 2D ou chip 3D e estimuladas com TGF de 5 ng/mL- 1(Fator de crescimento transformador -)ou inibidor de 10 µm (SB 431542) durante 24 h. Fibroblastos renais humanos primários foram usados no modelo cultivado em 2D e no modelo cultivado em 3D. Os fibroblastos foram utilizados em uma densidade de 8×10* cultivados com HUVECs e HK-2. A razão primária de fibroblastos renais humanos para HUVEC, ou razão F:H, foi de 1:5 para avaliarfibroseAs células .HK-2 foram usadas em uma densidade de 2×104. A detecção de (A)IL-1 ,(B)fator de crescimento de fibroblastos básico (FGF-2) e (CE)TGF-beta 1, 2 e 3 no sobrenadante foi realizada por análise multiplex de citocinas e imunoensaio multiplex bead. Cada barra representa a média± SE.*p<0.05,***><0.001 versus=""><0.01,##><0.001 versus="">(Fator de crescimento transformador -).
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Além disso, estimamos a expressão de mRNA de citocinas pró-inflamatórias como IL-1 , IL-6, IL-8 e TNF- . Os resultados foram significativamente regulados negativamente pelo TGF humano recombinante- 1(Fator de crescimento transformador -)tratamento no chip cultivado em 3D como propriedade anti-inflamatória do TGF-(Fator de crescimento transformador -). Descobrimos que a expressão de mRNA foi regulada positivamente pelo TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)inibidor (SB431542). Além disso, a expressão mediada por inibidor de IL-6, IL-8 e TNF- foi especificamente regulada negativamente em comparação com o controle não tratado (Figura 6A-D). O nível de mRNA de VEGF, um fator fibrótico, foi significativamente aumentado por TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)tratamento. O nível de mRNA de VEGF foi diminuído pelo inibidor de TGF- 1 (Figura 6E), enquanto a expressão de mRNA de IL-10 com efeito antifibrótico foi diminuída em condições fibróticas induzidas por TGF- 1 . Em contraste, a expressão de I-10mRNA foi aumentada pelo tratamento com inibidor de TGF- 1(Figura 6F).
Figura 6. PCR em tempo real mostra a expressão geral de mRNA do chip 3D.As células foram plaqueadas a uma densidade de 5×10 graus por chip 3D e estimuladas com 5ng/mL TGF- 1(Fator de crescimento transformador -)ou 10 um inibidor (SB431542) por 24h. RNA total extraído do chip cultivado em 3D. A expressão de mRNA de (A)IL-1 ,(B)TNF- ,(C)IL-6 e (D)IL-8 representa o efeito anti-inflamatório do TGF{ {10}}(Fator de crescimento transformador -)tratamento. A expressão de (E)VEGF como fator angiogênico foi aumentada. A expressão de (F)IL-10 como fator antifibrótico foi significativamente diminuída por TGF- 1.*p<><><0.001 versus=""><><><0.001 versus="">(Fator de crescimento transformador -).
