Os efeitos antienvelhecimento de Ludwigia Octovalvis em Drosophila Melanogaster e camundongos SAMP8 Parte 2

Composição química do LOE

Para identificar os mecanismos pelos quais o LOE induz a extensão da vida das moscas, a composição química do LOE foi analisada por GC-MS. Dezessete picos principais foram vistos no cromatograma de íons total (Fig. 4) e foram identificados como os compostos conhecidos listados na Tabela 2.

O glicosídeo de cistanche também pode aumentar a atividade de SOD nos tecidos do coração e do fígado e reduzir significativamente o conteúdo de lipofuscina e MDA em cada tecido, eliminando efetivamente vários radicais reativos de oxigênio (OH-, H₂O₂, etc.) e protegendo contra danos ao DNA causados por radicais OH. Os glicosídeos feniletanóides cistanche têm uma forte capacidade de eliminação de radicais livres, uma capacidade redutora maior do que a vitamina C, melhoram a atividade de SOD na suspensão de esperma, reduzem o conteúdo de MDA e têm um certo efeito protetor na função da membrana espermática. Os polissacarídeos Cistanche podem aumentar a atividade de SOD e GSH-Px em eritrócitos e tecidos pulmonares de camundongos experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactose, bem como reduzir o conteúdo de MDA e colágeno no pulmão e no plasma e aumentar o conteúdo de elastina, têm um bom efeito de eliminação no DPPH, prolongar o tempo de hipóxia em camundongos senescentes, melhorar a atividade de SOD no soro e retardar a degeneração fisiológica do pulmão em camundongos experimentalmente senescentes Com degeneração morfológica celular, experimentos mostraram que Cistanche tem boa capacidade antioxidante e tem potencial para ser um medicamento para prevenir e tratar doenças de envelhecimento da pele. Ao mesmo tempo, o echinacoside em Cistanche tem uma capacidade significativa de eliminar os radicais livres DPPH e pode eliminar espécies reativas de oxigênio, prevenir a degradação do colágeno induzida por radicais livres e também tem um bom efeito de reparo nos danos causados ​​pelos radicais livres da timina.

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LOE atenua o dano oxidativo agudo

Como o estresse oxidativo é a teoria mais popular para explicar como o envelhecimento ocorre no nível molecular, decidimos examinar a atividade de eliminação do radical DPPH do LOE como um indicador crítico de sua capacidade antioxidante. Em nossos ensaios, o LOE apresentou forte atividade de eliminação do radical DPPH (IC50 30,15 ug/ml), entre a atividade do ácido ascórbico (IC50 10,31 ug/ml) e a do resveratrol ( IC50 7.86 ug/ml), que foram usados ​​como controles (Fig. 5a). No entanto, as atividades de eliminação do radical DPPH dos dois compostos mais abundantes identificados no LOE, - sitosterol e esqualeno, foram detectadas apenas em níveis mínimos (Fig. 5a). A capacidade antioxidante do LOE pode ser atribuída à sua composição rica em antioxidantes, uma vez que um alto nível de polifenóis (146,3±3,1 mg de equivalente de ácido gálico por g de peso seco; Tabela 3) estava presente em nossa preparação de LOE, e os flavonoides foram um componente majoritário entre os polifenóis (90,2±2,6 mg de equivalente rutina por g de peso seco).

Portanto, testamos ainda mais as propriedades antioxidantes de LOE expondo 10-fêmeas de moscas CS tratadas com LOE com um dia de idade a paraquat (metil viologen, um produto químico conhecido por gerar espécies reativas de oxigênio). Descobrimos que as moscas que receberam suplementação de LOE em seus alimentos por 10 dias mostraram maior resistência à letalidade induzida por paraquat (Fig. 5b). Esse resultado foi confirmado pela análise dos níveis de dano oxidativo em moscas tratadas com paraquat por 12 horas. Usamos 4-hidroxinonenal (HNE), um aduto proteico gerado a partir de produtos da oxidação lipídica, como um indicador de dano oxidativo. Embora a suplementação de LOE não tenha mostrado efeito no nível basal de HNE em moscas com 10-dia de idade, ela reduziu significativamente o acúmulo de HNE em moscas tratadas com paraquat 20 mM (Fig. 5c).

-Sitosterol é um componente importante no LOE que contribui para a extensão da vida útil

Examinamos ainda os efeitos do -sitosterol e do esqualeno no tempo de vida das moscas. Curiosamente, - o sitosterol induziu a extensão da vida útil em moscas CS fêmeas (Fig. 6a) de maneira dependente da dose. Este efeito pró-longevidade, no entanto, não foi observado em moscas CS fêmeas recebendo as mesmas doses de esqualeno (Fig. 6b).

Foi demonstrado que a via AMPK media a extensão da vida útil por DR em C. elegans (Apfeld et al. 2004; Greer et al. 2007) e em moscas (Stenesen et al. 2013). Nós, portanto, examinamos se LOE e -sitosterol poderiam regular o tempo de vida modulando a via AMPK. Usando células Drosophila S2, descobrimos que LOE e -sitosterol podem aumentar significativamente a fosforilação de AMPK (Fig. 6c). Observações semelhantes foram feitas quando as células foram mantidas em condições DR (0,5 × meio) (Fig. 6c). Se a AMPK teve um papel importante na extensão da vida útil induzida pelo -sitosterol em moscas, a perda de AMPK deveria atenuar o efeito da longevidade pelo -sitosterol. Testamos essa hipótese diminuindo a expressão de AMPK, especificamente nos corpos gordurosos de moscas adultas (Fig. S1). O corpo gorduroso da Drosophila é o equivalente em mosca do fígado e tecido adiposo dos mamíferos e é responsável pelo metabolismo. A superexpressão ou knockdown de AMPK nas células do corpo adiposo foi associada ao aumento ou diminuição da expectativa de vida da mosca, respectivamente (Stenesen et al. 2013). Combinamos um alelo UAS-AMPK.RNAi com um GeneSwitch GAL4 induzível por RU486- para o corpo gordo (S106-GAL4). Moscas adultas portadoras de elementos genéticos apropriados foram randomizadas para alimentos contendo RU486 (o agente ativador para os drivers GeneSwitch-Gal4) e/ou - sitosterol. Descobrimos que a extensão da expectativa de vida induzida por -sitosterol não foi observada quando a expressão de AMPK foi reduzida especificamente no corpo gorduroso de moscas adultas (Fig. 6d). Juntos, esses dados implicam que o sitosterol derivado de LOE pode modular a expectativa de vida, pelo menos em parte, por meio da ativação de AMPK no corpo gorduroso de moscas adultas.

Discussão

As moscas-das-frutas têm uma vida útil relativamente curta, variando de algumas semanas a vários meses, dependendo das condições nutricionais e ambientais. Por exemplo, a ingestão calórica alterada, as condições de acasalamento e a temperatura ambiente podem alterar significativamente o tempo de vida da mosca (Bauer et al. 2004). Em condições bem definidas, fomos capazes de demonstrar que a suplementação alimentar com LOE poderia prolongar a vida útil das moscas sem nenhuma compensação negativa óbvia.

O desenvolvimento de miméticos de DR tornou-se um campo emergente para a pesquisa antienvelhecimento. 2-A desoxiglicose, um inibidor da glicólise (Lane et al. 1998), e a metformina, que estimula a AMPK (Anisimov et al. 2003), são duas moléculas atualmente sendo exploradas como miméticas de DR. No entanto, a administração a longo prazo de 2- desoxiglicose ou metformina pode produzir efeitos colaterais indesejados, incluindo insuficiência cardíaca e acidose láctica, tornando-os candidatos improváveis ​​para uso como miméticos de DR (Ingram et al. 2004; Sinclair 2005). As moscas que receberam metformina também não mostraram efeito benéfico na extensão da vida útil (Slack et al. 2012). Assim, os polifenóis derivados de plantas, como o resveratrol, podem fornecer uma opção alternativa. Foi demonstrado que o resveratrol prolonga a vida útil de leveduras, vermes e moscas, imitando a DR por meio de uma via{10}}dependente de Sir (Wood et al. 2004). Embora o resveratrol não tenha prolongado a vida útil de camundongos alimentados ad libitum, ele melhorou a saúde e a sobrevivência de camundongos obesos alimentados com uma dieta hipercalórica (Baur et al. 2006; Pearson et al. 2008). Esses resultados sugerem que o resveratrol pode aumentar a resistência ao estresse induzido por alto teor calórico, o que é consistente com os resultados observados em estudos que demonstram que o resveratrol confere proteção celular contra estresses, incluindo danos oxidativos (Araki et al. 2004) e radiação gama (Howitz et al. 2003).

Nossos dados sugerem que o LOE pode atuar em parte como um mimético de DR. Descobrimos que o LOE estendeu significativamente a vida útil das moscas alimentadas com uma dieta de alto teor calórico, mas não mostrou nenhum efeito aditivo sob condições de DR (Fig. 1). O LOE também atenuou o declínio cognitivo relacionado à idade, mantendo-o em um nível semelhante ao observado em moscas em condições de RD. Mostramos que esses efeitos do tipo DR do LOE não foram devidos ao menor consumo de alimentos induzido pelo LOE (Figs. 2 e 3). Nem outras alterações fisiológicas típicas associadas à DR, como redução da fecundidade feminina ou aumento da atividade motora, foram observadas em moscas tratadas com LOE (Fig. 2). Foi demonstrado que a DR aumenta a atividade mitocondrial (Nisoli et al. 2005; Lopez-Lluch et al. 2006), mas retarda ou reduz o estresse oxidativo e os danos em moscas (Zheng et al. 2005), camundongos (Qiu et al. 2010 ), macacos (Zainal et al. 2000) e mulheres (Buchowski et al. 2012). Este efeito observado foi sugerido como um efeito de "mitohormese", uma hipótese de que o aumento da atividade mitocondrial e da produção de ROS pode desencadear um programa de defesa intrínseco, que resulta em melhor resistência ao estresse e possivelmente extensão da vida útil (Schulz et al. 2007). Descobrimos que o LOE tinha forte atividade de eliminação do radical DPPH e reduziu o dano oxidativo induzido pelo paraquat e a letalidade em moscas (Fig. 5), apoiando ainda mais nossa hipótese de que o LOE pode atuar, pelo menos em parte, como um mimético de DR.

Nossas análises químicas confirmaram que o LOE era uma rica fonte de antioxidantes, incluindo compostos polifenólicos, fitoesteróis e esqualeno (Fig. 4 e Tabela 2). Foi relatado que o -sitosterol pode regular positivamente a expressão de proteínas e a atividade antioxidante da superóxido dismutase de manganês por meio da via estrogênio/fosfatidilinositol 3-quinase em macrófagos (Vivancos e Moreno 2005). A suplementação dietética de esqualeno também demonstrou atenuar o dano oxidativo relacionado à idade e manter o status energético das mitocôndrias do fígado em ratos idosos (Buddhan et al. 2007). Embora o -sitosterol e o esqualeno tenham sido os dois compostos mais abundantes identificados no LOE por análises de GC-MS, nenhum deles mostrou atividade óbvia de eliminação do radical DPPH em nosso sistema de ensaio (Fig. 5). É possível que as atividades antioxidantes do LOE possam incluir sequestradores de radicais livres, como compostos polifenólicos, enquanto o sitosterol e o esqualeno possam atuar por outras vias, conforme discutido acima. Outras práticas médicas tradicionais e integrativas, como R. rosea e C. longa, demonstraram prolongar a vida útil das moscas por meio de vias associadas à antioxidação e regulação de genes conhecidos relacionados ao envelhecimento (Lee et al. 2010; Schriner et al. 2013, 2009). No entanto, os extratos de ervas geralmente contêm muitos compostos que requerem análises bioquímicas sistemáticas para identificação. Uma interpretação mecanicista é, portanto, difícil sem a identificação de um composto puro. No presente estudo, identificamos o -sitosterol como um componente importante que contribuiu para a atividade de prolongamento da vida útil do LOE. Nossos dados sugerem que a extensão da expectativa de vida induzida por -sitosterol requer ativação de AMPK no corpo gorduroso de moscas adultas. Isso está amplamente de acordo com relatórios anteriores que demonstram que a AMPK é o principal sensor de nutrientes e medeia a extensão da vida útil por DR em C. elegans (Apfeld et al. 2004; Greer et al. 2007) e moscas (Stenesen et al. 2013).

É desejável que as intervenções de longevidade não apenas prolonguem a expectativa de vida, mas também retardem o aparecimento e a morbidade das doenças relacionadas à idade, ou seja, aumentem tanto a expectativa de vida quanto a saúde. Os efeitos precognitivos do LOE que descrevemos em moscas e camundongos SAMP8 também podem ser de grande interesse para o campo do envelhecimento. Foi demonstrado que camundongos SAMP8 exibem déficits relacionados à idade na retenção de memória a partir dos 2 meses de idade, quando testados em tarefas de evitação passiva (Miyamoto et al. 1986). Em um teste de evitação de choque nas patas, os camundongos SAMP8 também mostraram comprometimento significativo na aquisição e retenção de memória de 6 a 9 meses de idade, em comparação com camundongos SAMP8 jovens (Flood e Morley 1993). Usando o reconhecimento de objetos novos e tarefas de labirinto em T elevado, pudemos observar claros déficits relacionados à idade na retenção de memória entre ratos SAMP8 de 3- e 8-meses de idade, embora não houvesse diferenças durante o período de aquisição de a tarefa do labirinto em T elevado (Fig. 3). Essas observações são mais uma evidência de que camundongos SAMP8 exibem um início precoce de déficits cognitivos relacionados à idade e que o comprometimento piora com a idade. No entanto, o tratamento de LOE de longo prazo (mais de 5 meses) em camundongos SAMP8 atenuou o declínio relacionado à idade na retenção de memória sem afetar a atividade física, ingestão de alimentos, consumo de água ou peso corporal (Fig. 3). Não observamos nenhum efeito colateral em camundongos que receberam 5 meses de tratamento com LOE (observações não publicadas). Esses achados estão amplamente de acordo com um relatório recente demonstrando que a administração repetida de L. octovalvis por 28 dias em camundongos (800 mg/kg≈2.400 ug/dia vs. 400 ug/dia usado em nosso estudo) não causou letalidade ou toxicidade toxicológica (Kadum Yakob et al. 2012).

Em resumo, identificamos o LOE como uma nova intervenção antienvelhecimento, capaz de prolongar a vida útil das moscas e atenuar o declínio cognitivo relacionado à idade em moscas e camundongos SAMP8. GC-MS e outras análises bioquímicas sugerem que o LOE pode exercer seus efeitos antienvelhecimento atenuando o dano oxidativo e ativando vias relacionadas à AMPK.

Agradecimentos Gostaríamos de agradecer Chuan-Hao Lai e Hao-Wei Wang (Hsiehyu Biotech Company Ltd.) e Shang-Tse Lee (National Taiwan University) por sua assistência técnica. Gostaríamos de agradecer à Fly Core em Taiwan pelos estoques de moscas e reagentes. Pei-Yu Wang é parcialmente apoiado pelo National Science Council (NSC 98-2320-B-004-003-MY2 e NSC 100- 2311-B-002-017-MY3), Taiwan.

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