Resumoagir

Fundo: Cada vez mais estudos têm relatado o efeito terapêutico de exossomos derivados de células-tronco mesenquimais (MSC) pelos quais proteínas e miRNA são caracterizados. No entanto, os perfis proteômicos e de miRNA de exossomos derivados de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) permanecem obscuros.

O glicosídeo de cistanche também pode aumentar a atividade de SOD nos tecidos do coração e do fígado e reduzir significativamente o conteúdo de lipofuscina e MDA em cada tecido, eliminando efetivamente vários radicais reativos de oxigênio (OH-, H₂O₂, etc.) e protegendo contra danos ao DNA causados por radicais OH. Os glicosídeos feniletanóides cistanche têm uma forte capacidade de eliminação de radicais livres, uma capacidade redutora maior do que a vitamina C, melhoram a atividade de SOD na suspensão de esperma, reduzem o conteúdo de MDA e têm um certo efeito protetor na função da membrana espermática. Os polissacarídeos Cistanche podem aumentar a atividade de SOD e GSH-Px em eritrócitos e tecidos pulmonares de camundongos experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactose, bem como reduzir o conteúdo de MDA e colágeno no pulmão e no plasma e aumentar o conteúdo de elastina, têm um bom efeito de eliminação no DPPH, prolongar o tempo de hipóxia em camundongos senescentes, melhorar a atividade de SOD no soro e retardar a degeneração fisiológica do pulmão em camundongos experimentalmente senescentes Com degeneração morfológica celular, experimentos mostraram que Cistanche tem boa capacidade antioxidante e tem potencial para ser um medicamento para prevenir e tratar doenças de envelhecimento da pele. Ao mesmo tempo, o echinacoside em Cistanche tem uma capacidade significativa de eliminar os radicais livres DPPH e pode eliminar espécies reativas de oxigênio, prevenir a degradação do colágeno induzida por radicais livres e também tem um bom efeito de reparo nos danos causados ​​pelos radicais livres da timina.

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Métodos: Neste estudo, isolamos exossomas de hESCs, hiPSCs e células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano (hUC-MSCs) por meio de ultracentrifugação clássica e um filtro 0.22-μm, seguido de identificação conservadora. A rotulagem de tag de massa em tandem e a quantificação relativa de peptídeos sem marcação definiram juntos sua proteômica. O sequenciamento de alto rendimento foi realizado para determinar os perfis de miRNA. Em seguida, realizamos uma análise bioinformática para identificar os processos biológicos dominantes e as vias moduladas por cargas de exossomos. Finalmente, o western blot e RT-qPCR foram realizados para detectar as cargas reais de proteínas e miRNAs em três tipos de exossomos.

Resultados: Com base em nosso estudo, as cargas de três tipos de exossomos contribuem para processos biológicos sofisticados. Em comparação, os exossomos hESC (hESC-Exos) foram superiores na regulação do desenvolvimento, metabolismo e antienvelhecimento, e os exossomos hiPSC (hiPSC-Exos) tiveram funções biológicas semelhantes aos hESC-Exos, enquanto os exossomos hUC-MSCs (hUC-MSC-Exos) contribuiu mais para a regulação imunológica.

Conclusões: Os dados apresentados em nosso estudo ajudam a definir as paisagens de proteínas e miRNA de três exossomos, prever suas funções biológicas por meio de análise de rede sistemática e abrangente no nível do sistema e revelar suas respectivas aplicações potenciais em diferentes campos para otimizar a seleção de exossomos em pré-clínica e clínica ensaios.

Palavras-chave: Células-tronco embrionárias humanas, Células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, Células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano, Exossomos, Proteômica, miRNA

Introdução

As vesículas extracelulares (EVs) são minúsculas vesículas ativamente secretadas pelas células, contendo principalmente exossomos, microvesículas (MVs) e corpos apoptóticos [40, 56, 57]. Eles são amplamente distribuídos em vários fluidos corporais, como saliva, leite materno, sangue, líquido cefalorraquidiano, bile e urina [57]. Entre eles, os exossomos têm uma bicamada lipídica com um diâmetro de 40 a 200 nm, uma densidade flutuante de 1,13 a 1,18 g/ml no gradiente de sacarose e uma aparência em forma de xícara sob um microscópio eletrônico [21, 53]. Vários compostos bioativos, incluindo proteínas, ácidos nucléicos e lipídios, conferem a função de comunicação intercelular de exossomos entre as células [16, 17]. A bicamada lipídica é uma barreira delicada que protege o conteúdo dos exossomos da degeneração enzimática dos fluidos corporais [49]. Exossomos estáveis ​​podem mediar processos fisiológicos e patológicos complicados por meio da atividade parácrina, incluindo desenvolvimento de órgãos e reprodução, apresentação de antígenos, comunicação neuronal, resposta imune, regulação do envelhecimento e proliferação celular [57, 62].

A formação e liberação do exossomo é um processo totalmente regulado, e a classificação do conteúdo encapsulado do exossomo ocorre pela mobilização de várias proteínas [22, 47]. Múltiplas proteínas são cruciais para a formação do exossomo, que contém o complexo de classificação endossomal necessário para o transporte (ESCRT), tetraspaninas (CD9, CD63 e CD81), gene ligado à apoptose 2-interacting protein X (Alix) e suscetibilidade tumoral gene 101 (TSG101) [38, 55]. O tráfego intracelular de exossomos é impulsionado pela atividade coletiva de uma série de proteínas, incluindo RAB GTPases de troca molecular e proteínas do citoesqueleto, como actina e tubulina [24]. Posteriormente, a secreção do exossomo é complementada pelo complexo SNARE e pela família sinaptotagmina [22]. A pesquisa determinou que o brotamento e a liberação de exossomos dependem da atividade do cálcio e do recrutamento de ESCRT [15]. Como um mensageiro, a liberação do exossomo está envolvida no crosstalk celular em resposta à fisiologia celular e alterações patológicas, como ativação, mudança de pH, hipóxia, dano por radiação ou estresse celular [61].

Para descobrir os componentes dos exossomos e suas possíveis funções fisiológicas e patológicas, técnicas proteômicas, transcriptômicas e outras são frequentemente usadas para estudar RNAs e proteínas de exossomos de diferentes espécies, tecidos e células [44]. A análise proteômica de exossomos normalmente inclui três etapas: isolamento, purificação e caracterização de exossomos, identificação de componentes de proteínas usando espectrometria de massa e análise de dados brutos [14]. O estado celular afeta significativamente a composição de proteínas e a abundância de exossomos. Atualmente, técnicas proteômicas quantitativas para analisar a caracterização e abundância de proteínas são usadas para elucidar o mecanismo subjacente à produção de exossomos e aprofundar nossa compreensão dos papéis fisiológicos e patológicos dos exossomos nas células [39]. Entre eles, as tecnologias proteômicas quantitativas baseadas em espectrometria de massa são amplamente utilizadas, principalmente incluindo métodos livres de marcação e marcados com isótopos estáveis ​​[13, 42]. miRNAs são pequenas moléculas bioativas que estão intimamente associadas com várias atividades da vida. A técnica de sequenciamento de alto rendimento é caracterizada por alta sensibilidade e precisão e tem ampla aplicação no sequenciamento de miRNA (18-30 nt) [6]. Dado o desenvolvimento da tecnologia atual, não há barreira para dissecar os perfis de proteína e miRNA de exossomos.

As hESCs e hiPSCs têm alto potencial de diferenciação [36]. No entanto, sua aplicação direta no tratamento é limitada devido ao risco de malignidade e questões éticas [31]. Em contraste, as células-tronco mesenquimais (MSCs) têm uma aplicação mais ampla para intervenção em múltiplas doenças em ambientes clínicos [8]. No entanto, seu uso direto ainda enfrenta várias limitações, incluindo baixa taxa de sobrevivência, rejeição imunológica e questões de segurança [8, 43]. Atualmente, muita atenção tem sido dada aos exossomos por causa de sua biossegurança, estabilidade, não aneuploidia e baixa imunogenicidade [51]. Estudos anteriores documentaram a comparação de componentes de MSCs derivadas de diferentes tecidos e seus exossomos contendo perfis proteômicos e de miRNA [59]. Gong et ai. também descreveu a rede regulatória das vesículas extracelulares (EVs) de hESC em termos do proteoma, mas apenas em vias relacionadas ao envelhecimento sem focar em outras [19]. Questa et al. teceu o atlas proteômico EV de hiPSCs derivados de fibroblastos de prepúcio humano (HFFs) [45]. Embora esses estudos tenham relatado parcialmente os componentes proteicos dos EVs, eles não se concentraram apenas nos exossomos, e sua análise proteômica abrangente não está claramente articulada. Em particular, os perfis de miRNA ainda não foram descritos. Para resolver isso, exossomos isolados de hESCs, hiPSCs e hUC-MSCs foram selecionados no presente estudo para uma investigação mais aprofundada visando seus perfis de proteoma e miRNA para obter novos insights para sua pesquisa e aplicação clínica.

Métodos

Preparação e caracterização de exossomos

hESCs e hiPSCs foram cultivadas em meio ncTarget (cat. no. RP01020; Nuwacell. Ltd, China), enquanto a 3ª geração de hUC-MSCs foi cultivada em meio isento de soro hMSC de missão (cat. no. RP02010; Nuwacell. Ltd, China). Em seguida, 350 mL do sobrenadante de células na fase de crescimento logarítmico (~80% de confluência) foram coletados para purificação de exossomos. Os exossomos foram extraídos por uma série de centrifugações e ultracentrifugações reconhecidas, conforme descrito anteriormente [34, 52]. Resumidamente, os meios condicionados (CM) foram coletados e submetidos a centrifugação gradiente (300×g por 10 min, 2000×g por 15 min, 10, 000×g por 30 min) para separar Detritos celulares. Os exossomos foram peletizados dos sobrenadantes coletados a 100, 000 × g por 70 min usando um rotor Ti45 (Beckman Coulter, EUA). Eles foram então ressuspensos em PBS para a próxima filtração usando um filtro de membrana MF-Millipore™ de 0,22-μm (Sigma, EUA). O filtrado foi submetido a ultracentrifugação a 100.000×g por 70 min. O sedimento de exossoma final foi ressuspenso em PBS para a próxima análise. Um sistema de espalhamento dinâmico de luz (DLS) (Wyatt Technology, EUA) foi usado para medir a concentração e o tamanho dos exossomos isolados.

Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)

A varredura TEM foi realizada para descrever a morfologia dos exossomos isolados, conforme descrito anteriormente. Os exossomos ressuspensos (1 ug em 10 ul de PBS) foram plantados em uma grade de cobre revestida com carbono (200-mesh) e deixados adsorver por 2 min, seguidos de duas lavagens com água bidestilada. Em seguida, as grades foram coradas negativamente com 8 μL de solução de acetato de uranila a 2 por cento por 1 min. Após a secagem natural, as amostras foram examinadas usando um sistema Tecnai Spirit (Thermo Fisher, EUA) a 120 kV.

Dispersão de luz dinâmica

A distribuição de tamanho dos exossomos foi descrita por meio de análise de rastreamento de nanopartículas usando um dispersômetro dinâmico de luz (Wyatt Technology, EUA) de acordo com as instruções do fabricante (271-DPN), conforme relatado anteriormente[23]. Resumidamente, o pellet de exossomo foi ressuspenso em 100 μL de PBS. Dez, 50 μL dos exossomos acima foram adicionados a 1450 μL de PBS e agitados em vórtice por 30 s. Os exossomos (1,5 mL) foram transferidos para uma cubeta descartável para equilíbrio a 25 graus por 30 s. O valor do índice de refração do dispersante foi de 1,37, e tanto a média Z quanto a polidispersão (PDI) determinaram o tamanho das partículas do exossomo. Medições independentes da árvore foram feitas para cada amostra.

Rotulagem tandem mass tag (TMT) e análise de quantificação relativa de peptídeos sem marcação (LFQ)

Total protein was extracted from exosomes, and the concentration was quantified using the Bradford method.  The samples were separated by 12.5% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).  The protein suspensions were digested with trypsin (cat.   no. 9002-07-7; Sigma, USA) in 40 μL of tetraethylammonium bromide (TEAB) buffer for 12  h at 37  °C and then labeled with TMTsixplex™ isobaric label reagent set (cat. no. 90061; Thermo Fisher, USA). TMT-labeled peptides were fractionated by reversed-phase chromatography using an Agilent 1260 Infinity II HPLC system  (Agilent Technology, USA). LC-MSC/MS analysis was performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. (Hangzhou,  China). Briefly, the analysis was completed using the combination of a Q Exactive Plus mass spectrometer and Easy nLC (Thermo Fisher, USA). Survey scans were acquired at a resolution of 70,000 at m/z 200. MS/MS   spectra were captured by the MASCOT engine using the built-in software Proteome Discoverer 2.4. Label-free relative peptide quantification analysis was also performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. as previously reported  [27]. Briefly, the digested proteins of exosomes were separated by HPLC and detected by mass spectrometry.  Raw files from technical and biological replicates were filtered, de novo sequenced, and assigned with protein ID   using PEAKS 8.0 by searching against the human SwissProt database. Tree-independent exosome samples were subjected to TMT or label-free assay. The final protein profiles of exosomes were determined by overlapping the data of TMT (mascot score>60, abundance>100, e P<0.05) and label-free (at least two tests results>0 e P<0.05).

Differentially expressed proteins (DEPs) were considered valid after the data were normalized by protein loading and differential p-value false discovery rates (FDR) corrected [30]. In particular, the proteins with log2|fold change|>1 (|log2FC|>1), bem como significância estatística (P<0.05), were classified as enriched in exosomes.

análise de perfil de miRNA

O RNA total foi extraído de exossomos isolados usando o kit de isolamento mirVana™ miRNA (cat. no. AM1560; Thermo Fisher, EUA). As amostras de RNA foram submetidas à inspeção de qualidade para o ensaio de microarranjo de miRNA realizado pela LC-Bio Technology Co., Ltd. A análise dos dados brutos foi realizada conforme relatado anteriormente [9]. MiRNAs expressos diferencialmente foram selecionados como candidatos a miRNAs em um valor p<0.05 and |log2FC|>2. Data were omitted if they corresponded to questionable miRNAs, according to previous reports or in-house validated miRNAs [12]. The miRNA target genes were determined by the overlap of prediction of Targetscan and miRanda databases under the restriction of threshold value>90 (Targetscan) e energia livre máxima<−10 (miRanda).

Análise de bioinformática

Os dados brutos foram submetidos a análise usando o pacote de software Maxquant (v1.6.0), e os dados humanos Swiss-Prot_ foram definidos como referência (20.600 proteínas) (Proteome ID: UP000005640) . As proteínas identificadas foram mapeadas para Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) com base na análise KOBAS [60] termos para determinar suas propriedades biológicas e funcionais. O software Cytoscape e o pacote igraph no software R (versão 3.6.1) foram usados ​​para desenhar a rede entrelaçada de proteínas exossomais ou miRNAs entre as vias de sinalização.

Análise estatística

Todos os experimentos foram realizados em triplicata. A repetibilidade quantitativa de proteínas e miRNAs foi elevada via análise de componentes principais (PCA), desvio padrão relativo e coeficiente de correlação de Pearson. Os resultados foram analisados ​​usando um teste t de Student não pareado. Os dados são expressos como o erro padrão médio da média (SEM). Os valores de P foram considerados estatisticamente significativos em *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001.

Resultados

Isolamento e identificação de exossomos

A cultura e identificação de três células-tronco pluripotentes humanas foram descritas no Arquivo Adicional 1. Os exossomos foram isolados do meio condicionado de três tipos de células-tronco (Arquivo Adicional 1: Fig. S1) e identificados com base na morfologia, tamanho de partícula, concentração, e marcadores de superfície [19]. TEM revelou que esses exossomos tinham uma morfologia em forma de xícara (Fig. 1A), e DLS revelou que sua distribuição de tamanho estava dentro de 50-200 nm (Fig. 1B). Western blotting indicou que os exossomos isolados carregavam os marcadores positivos CD63, TSG101 e HSP70, mas não o marcador negativo calnexina (Fig. 1C). Cada hESC teve um rendimento de exossomo semelhante ao de hiPSCs, e ambos foram maiores que o de hUC-MSCs (Fig. 1D). Esses resultados indicam que os exossomos representativos foram parados, sem diferenças na forma; no entanto, foram encontradas diferenças entre as concentrações de exossomos isolados dos três tipos de células-tronco.

Bioinformática de proteínas compartilhadas e carregadas no topo

The SDS-PAGE and quantitative analyses revealed that while the protein concentrations of hESC-Exos and hiPSC-Exos were not different, they were both higher than those of hUC-MSC-Exos (Additional file 1: Fig.  S2A and B). The PCA plot indicated that exosomes had good uniformity within each group (Additional file 1:  Fig. S2C). The peptide fragments digested via enzymatic hydrolysis passed the quality inspection (Additional file 1: Fig. S2D–G) and then were subjected to the next bioinformatics analysis. Moreover, the proteins of three exosomes were mainly located in the extracellular region,   followed by the cytoplasm (Additional file 1: Fig. S2H).  To describe the protein profiles of the three types of exosomes, we integrated the TMT (Additional file 2) and label-free data (Additional file 3) under the conditions of mascot score>60 and abundance>100 (TMT assay)   and abundance of at least two repetitions>0 (ensaio sem marcador). Finalmente, 554, 437 e 911 sementes foram selecionadas para analisar os perfis de proteína de hESC-Exos, hiPSC-Exos e hUC-MSC-Exos, respectivamente (arquivo adicional 1: Fig. S3A). Em seguida, esses candidatos foram submetidos a um ensaio de diagrama de Venn para selecionar proteínas compartilhadas (arquivo adicional 1: Fig. S3B). A análise de bioinformática revelou que as 303 proteínas compartilhadas dominaram a regulação nessas vias de sinalização, incluindo regulação do citoesqueleto de actina, adesão focal, PI3K-AKT, metabolismo do carbono, etc. (Arquivo adicional 1: Fig. S3C). A análise GO também indicou que as proteínas compartilhadas foram enriquecidas em exossomo extracelular, membrana, ligação de proteína e região extracelular (arquivo adicional 1: Fig. S3D).

Furthermore, the top-loaded proteins were selected from the candidates with high FDR confidence (TMT   assay) and abundance of each repetition>0 (ensaio sem marcador) (Fig. 2A). Com base nesses resultados, 163, 187 e 451 proteínas foram rastreadas em hESC-Exos, hiPSC-Exos e hUC-MSC-Exos, respectivamente (arquivo adicional 1: Fig. S3E). Em seguida, descrevemos a curva de abundância de expressão dos três tipos de exossomos e identificamos os dez principais símbolos gênicos de proteínas carregadas em exossomos (Fig. 2B). ºAs proteínas altamente carregadas foram submetidas à bioinformática baseada no algoritmo KOBAS. Os proteomas dos três tipos de exossomos estavam todos envolvidos em uma complexa rede reguladora de vias de sinalização, e as 20 principais vias foram então classificadas com base no valor de -log10 (valor P) (Fig. 2C-E). Todos os proteomas foram enriquecidos na interação matriz extracelular (ECM)-receptor e nas vias de sinalização PI3K-AKT. A análise de interação proteína-proteína (PPI) revelou que as proteínas mais carregadas em hESC-Exos e hiPSC-Exos foramenriquecido no ciclo celular e na via metabólica, enquanto as proteínas mais carregadas em hUC-MSC-Exos foram enriquecidas nas vias relacionadas à regulação da imunidade (Fig. 2F-H).

Comparação pareada de proteômica de exossomos

Para avaliar a diferença entre cada dois proteomas de exossomos, construímos um diagrama de Venn para reconhecer os agrupamentos de genes codificadores de proteínas únicos e sobrepostos. Os genes codificadores de proteínas compartilhados foram então submetidos à análise do vulcão e do mapa de calor e ao GSEA, e as proteínas expressas diferencialmente foram filtradas em P<0.05 and  |log2FC|≥1. Comparison of hESC-Exos and hiPSC-Exos  (Additional file 1: Fig. S4A) revealed that their unique clusters were both enriched in ECM-receptor interaction and complement and coagulation cascades (Additional file 1: Fig. S4B and C) while overlapping clusters participated in multiple signaling pathways, including metabolic, cell cycle, and Hippo pathways (Fig. 3A). Significant differentially expressed protein-coding genes are presented in the volcano plot (Fig. 3 B). Heatmap analysis revealed that Cluster 1 proteins related to developmental biology, TGF-β signaling, and pluripotency regulation were enriched in hESC-Exos. Proteins in Cluster 2,   which were mainly enriched in hiPSC-Exos, were related to taurine and hypotaurine metabolism, RNA transport,   thiamine metabolism, and folate biosynthesis (Fig. 3 C).  GSEA further emphasized the more important role of hESC-Exos in developmental biology and cell cycle compared to hiPSC-Exos (Additional file 1: Fig. S5).

A comparação entre hESC-Exos e hUC-MSC- 1: Fig. S4 D) revelou que clusters de genes codificadores de proteínas únicos de hESC-Exos estavam envolvidos principalmente em EGFR, TGF-, ciclo celular, regulação de pluripotência e Wnt sinalização (arquivo adicional 1: Fig. S4E). Em contraste, os clusters exclusivos de hUC-MSC-Exos foram enriquecidos em muitas vias de sinalização relacionadas à imunorregulação, como sistema de complemento, regulação da inflamação e infecção microbiana (arquivo adicional 1: Fig. S4F). Clusters sobrepostos foram altamente enriquecidos na interação ECM-receptor, complemento e cascatas de coagulação e sinalização PI3K-AKT (Fig. 3D). O gráfico do vulcão mostra as diferenças entre hESC-Exos e hUC-MSC-Exos (Fig. 3E). As proteínas suprarreguladas em hUC-MSC-Exos (Cluster 1) estiveram envolvidas principalmente na resposta do complemento, na atividade das células natural killer e na sinalização de Rap1 e PPAR. Em contraste, as proteínas reguladas positivamente por hESC-Exos estiveram envolvidas principalmente na sinalização de PI3K-AKT, MAPK e AMPK (Fig. 3F). GSEA confirmou a maior capacidade reguladora de hiPSC-Exos em pluripotência (arquivo adicional 1: Fig. S6A e D) e de hESC-Exos em imunorregulação, incluindo citotoxicidade mediada por células natural killer (arquivo adicional 1: Fig. S6B e E) e regulamentação do COVID19-SARS-CoV2 (Arquivo adicional 1: Fig. S6C e F).

A comparação hiPSC-Exos e hUC-MSC-Exos (arquivo adicional 1: Fig. S4G) revelou que o conjunto de genes codificadores de proteína hiPSCExos exclusivo foi significativamente associado à junção de extremidade não homóloga, TGF- e metabolismo da vitamina B6 (adicional arquivo 1: Fig. S4H), enquanto o de hUC-MSC-Exos estava envolvido principalmente em vias relacionadas à imunorregulação (Arquivo adicional 1: Fig. S4I). Suas proteínas sobrepostas também participaram da regulação das interações ECM-receptor, complemento e cascatas de coagulação e sinalização PI3K-AKT (Fig. 3G). O gráfico do vulcão apresenta as proteínas expressas diferencialmente (Fig. 3H). As proteínas do cluster 1 no mapa de calor indicaram que hUCMSC-Exos regulava principalmente a resposta imune e a via de sinalização AMPK, enquanto hiPSC-Exos regulava principalmente o ciclo celular e as vias de sinalização de insulina, Hippo e mTOR (Fig. 3 I). GSEA apoiou ainda mais o papel dominante de hiPSC-Exos na regulação dos processos de desenvolvimento (Arquivo adicional 1: Fig. S7A e D) e manutenção da pluripotência (Arquivo adicional 1: Fig. S7B e E), enquanto hUC-MSC-Exos foram principalmente envolvidos no processo de imunorregulação (Arquivo adicional 1: Fig. S7C e F).

Bioinformática de proteomas sobrepostos

Em seguida, investigamos os proteomas compartilhados dos três tipos de exossomos. No total, 309 genes codificadores de proteínas (Fig. 4A) foram submetidos a análises GO e KEGG. Os resultados indicaram que os conjuntos de genes codificadores de proteínas compartilhados entre os três tipos de exossomos estavam envolvidos principalmente em atividades extracelulares e processos biológicos, incluindo processos metabólicos de proteínas celulares, ligação ao receptor de sinalização, ligação ao ATP, ligação ao NAD, cicatrização de feridas e processos metabólicos lipídicos (Fig. 4B). Eles também contribuíram para a construção de redes reguladoras complexas de vias de sinalização, como PI3K-AKT, glicólise/gliconeogênese, Hipo, Oxitocina, HIF-1, ciclo celular e vias AMPK (Fig. 4C). Havia intrincadas relações regulatórias entre essas vias de sinalização proteômica e canônica (Fig. 4D). O gráfico de bolhas evidencia a abundância diferente de cada cluster de proteína na via de sinalização canônica. Considerando que hESC-Exos e hiPSC-Exos podem ter habilidades regulatórias mais fortes do que hUC-MSC-Exos em termos de ciclo celular e vias de sinalização de AMPK, hUC-MSC-Exos pode ter efeitos regulatórios proeminentes nas vias de sinalização de VEGF e NF-κB (Adicional arquivo 1: Fig. S8).

A análise do mapa de calor revelou ainda diferenças na expressão de proteínas compartilhadas (Fig. 4E). No Cluster A, as proteínas envolvidas nas vias de sinalização dos receptores PI3K-AKT, Hippo, VEGF e células B foram enriquecidas em hUC-MSCExos e hESC-Exos. As proteínas do Cluster B participaram principalmente da regulação da sinalização de PPAR, metabolismo do colesterol e produção de IgA e foram depletadas em hESC-Exos. O hUC-MSC-Exos continha principalmente proteínas Cluster C, que regulavam a resposta do complemento, infecção microbiana, sinalização HIF-1, sinalização MAPK, vias metabólicas e a via NF-κB. As proteínas do Cluster d, que foram enriquecidas em hiPSC-Exos, participaram da regulação da sinalização Ras, fosforilação oxidativa e sinalização mTOR. As proteínas do Cluster e eram mais abundantes em hiPSC-Exos e hESC-Exos do que em hUC-MSCExos, e estavam envolvidas em vários processos metabólicos, como ciclo do citrato, ciclo celular, sinalização de insulina, metabolismo de ácidos graxos e sinalização de AMPK . As proteínas do Cluster f participaram da regulação da reabsorção de cálcio, glicólise/gliconeogênese, sinalização adrenérgica e metabolismo do piruvato e foram depletadas em hUC-MSCExos e hiPSC-Exos. As proteínas nos diferentes clusters estão listadas no arquivo adicional 4.

perfis de miRNA dos três tipos de exossomos

Para investigar os perfis de miRNA dos três tipos de exossomos, o RNA total foi isolado dos exossomos para acoplar as extremidades 5' e 3' para posterior transcrição inversa. O cDNA obtido foi utilizado para construção de biblioteca e testes gerais. O número de integridade do RNA (RIN) foi de 2,7, 2,6 e 2,6 em hESC-Exos, hiPSC-Exos e hUC-MSC-Exos, respectivamente (arquivo adicional 1: Fig. S9A). A determinação da concentração de RNA revelou que hESC-Exos dominou a carga de RNA, seguida por hiPSC-Exos e hUC-MSCExos (arquivo adicional 1: Fig. S9B). O coeficiente de correlação de Pearson (Arquivo adicional 1: Fig. S9C) e PCA (Arquivo adicional 1: Fig. S9D) foram usados ​​para avaliar quantitativamente a repetibilidade dos miRNAs. Heatmaps foram usados ​​para representar os miRNAs expressos diferencialmente nos três tipos de exossomos (arquivo adicional 1: Fig. S9E) e o número de miRNAs expressos diferencialmente em P<0.05 or 0.01,   was evaluated between each two exosome types (Additional file 1: Fig. S9F). Based on the sequencing results, the top 20 miRNAs in each of the three exosome types were identified (Fig. 5 A–C). In hESC-Exos, has-miR-302 dominated the read counts and comprised has-miR-302b-3p,   has-miR-302a-5p, and has-miR-302d-3p (Fig.  5A). The three miRNAs with the highest read counts were has-miR- 372-3p, has-miR-371a, and has-miR-302a in hiPSC-Exos and has-miR-21-5p (Fig.  5B), has-miR-146a-5p, and hasmiR-320a-3p in hUC-MSC-Exos (Fig. 5C).

Para investigar os miRNAs envolvidos em processos biológicos, os principais miRNAs foram filtrados em P<0.05 and read count>1000 para mais previsão do gene alvo. Os genes enriquecidos foram então submetidos a análises GO e KEGG. Os resultados indicaram que os miRNAs hESC-Exos afetaram significativamente os seguintes processos: Rap1, PI3K-AKT, cálcio, Hippo, cAMP, ErbB, Foxo, ciclo celular, via de sinalização AMPK, etc. (análise KEGG) (Fig. 5D) e o ciclo celular, desenvolvimento de múltiplos organismos, transdução de sinal intracelular, diferenciação celular, envelhecimento, sinalização Wnt e metabolismo de ácidos graxos. (processo biológico) (Fig. 5G). O enriquecimento do gene alvo dos miRNAs hiPSC-Exos indicou que os seguintes processos foram significativamente regulados: PI3K-AKT, Rap1, Ras, cálcio, hipopótamo, cAMP e via de sinalização cGMP-PKG, etc. (análise KEGG) e o ciclo celular, desenvolvimento de múltiplos organismos, fosforilação, diferenciação celular, migração celular e resposta à hipóxia. (processo biológico) (Fig. 5H). Na rede reguladora dos miRNAs hUC-MSC-Exos, os processos biológicos mais plausíveis foram: Rap1, Ras, PI3K-AKT, cálcio, cAMP, Hippo, o ciclo celular, JAK-STAT e via de sinalização HIF-1 . (análise de KEGG) (Fig. 5F) e fosforilação, transdução de sinal intracelular, ligação de ATP, divisão celular, metabolismo lipídico, coestimulação de células T, cicatrização de feridas, ligação de NF-κB e resposta inflamatória. (processo biológico) (Fig. 5 I). A rede dos cinco principais miRNAs e suas vias regulatórias também foi descrita (arquivo adicional 1: Fig. S10).

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