Imunidade sinérgica e proteção em camundongos por coimunização com vacinas de DNA que codificam a proteína Spike e outras proteínas estruturais do SARS-CoV-2

Abstrato:O surgimento de novas variantes do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS CoV-2) gerou surtos recorrentes de infecção em todo o mundo. Essas variantes altamente mutadas reduzem a eficácia das atuais vacinas contra a doença do coronavírus 2019 (COVID-19), que são projetadas para atingir apenas a proteína spike (S) do vírus original. Exceto pelo S do SARS-CoV-2, o potencial imunoprotetor de outras proteínas estruturais (nucleocapsídeo, N; envelope, E; membrana, M) como antígenos alvo da vacina ainda não está claro e merece investigação. Neste estudo, foram desenvolvidas vacinas sintéticas de DNA que codificam quatro proteínas estruturais do SARS-CoV-2 (pS, pN, pE e pM), e os camundongos foram imunizados com três doses por injeção intramuscular e eletroporação. Notavelmente, a co-imunização com duas vacinas de DNA que expressavam as proteínas S e N induziu anticorpos neutralizantes mais elevados e foi mais eficaz na redução da carga viral do SARS-CoV-2 do que a proteína S sozinha em camundongos. Além disso, a co-imunização de pS com pN ou pE + pM induziu uma maior imunidade celular específica da proteína S após três imunizações e causou alterações histopatológicas mais suaves do que pS sozinho pós-desafio. O papel das proteínas estruturais conservadas do SARS-CoV-2, incluindo as proteínas N/E/M, deve ser investigado mais detalhadamente para suas aplicações no projeto de vacinas, como vacinas de mRNA.

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Palavras-chave: COVID-19; SARS-CoV-2}}; co-imunização; Vacina de ADN; proteína espiga; proteína estrutural

1. Introdução

O coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) é a causa da doença por coronavírus 2019 (COVID-19), que causou milhões de infecções e mortes em todo o mundo e colocou em risco a saúde humana e a economia global . Embora abordagens terapêuticas eficazes ainda não estejam disponíveis, elas avançaram rapidamente, incluindo a aplicação da terapia com células CAR-T e da nanotecnologia [1,2]. A vacinação é uma forma eficaz de controlar a pandemia, e várias vacinas foram aprovadas para uso por vários órgãos reguladores de saúde [3,4]. O genoma do coronavírus codifica quatro proteínas estruturais principais, a saber, as proteínas spike (S), nucleocapsídeo (N), membrana (M) e envelope (E), que são responsáveis ​​pela montagem do vírion e pela supressão da resposta imune do hospedeiro. ]. A proteína S é composta por 1273 resíduos de aminoácidos contendo duas subunidades, a saber, S1 e S2. Ele medeia a entrada viral e é um alvo importante para o desenvolvimento de vacinas contra o coronavírus [6–11]. No entanto, a proteína S do SARS-CoV-2 tem uma alta frequência de mutação. Não é de surpreender que no SARS-CoV-2, um vírus RNA, a mutação seja contínua e inevitável. Houve cinco variantes preocupantes do SARS-CoV-2 (VOC) que surgiram desde setembro de 2020, incluindo B.1.1.7 (Reino Unido, Alfa), B.1.351 (África do Sul, Beta), P.1 (Brasil, Gama), B.1.617.2 (Índia, Delta) e B.1.1.529 (África do Sul, Omicron) (Andreano e Rappuoli, 2021; Gupta, 2021). Todos eles têm várias mutações na proteína spike [12]. Essas variantes ameaçam a eficácia das atuais vacinas contra a COVID-19, que são projetadas para atingir apenas a proteína spike.

A proteína N do SARS-CoV-2 se liga ao RNA viral por meio de um domínio de ligação ao RNA de 140-com comprimento de aminoácido em seu núcleo, de maneira semelhante a uma "conta em um fio". É altamente conservado entre os coronavírus, compartilhando uma identidade de sequência de aproximadamente 90% com a do SARS-CoV, e também é a única proteína estrutural dentro do vírion [13]. Além disso, desempenha um papel importante no empacotamento do RNA viral no complexo do capsídeo ribonucleo e é necessário para a replicação do RNA viral, a montagem do vírion e a liberação das células hospedeiras [14]. Com base na alta similaridade de sequência da proteína N nos coronavírus, ela pode ser sugerida como alvo de vacina de proteção cruzada. Descobrimos anteriormente que a co-imunização com duas vacinas de DNA que expressam proteínas E e M fornece proteção parcial contra SARS-CoV-2, e este método deve ser considerado durante o desenvolvimento da vacina [15]. Dependendo do documento panorâmico da OMS, geralmente existem sete estratégias para vacinas candidatas contra SARS-CoV-2, que podem ser divididas em três categorias: primeiro, vacinas baseadas em proteínas, incluindo vacinas contra vírus inativados, vacinas semelhantes a vírus, partículas e vacinas de subunidades proteicas; segundo, vacinas baseadas em genes, incluindo vacinas com vetores de vírus, vacinas de DNA e vacinas de mRNA; terceiro, uma combinação de abordagens baseadas em proteínas e em genes, tais como vacinas de vírus vivos atenuados. As tecnologias de DNA, como novas estratégias de vacinas baseadas em genes, podem comparar rapidamente múltiplas vacinas candidatas e estratégias durante os testes pré-clínicos [16,17]. Teoricamente, quase todas as proteínas virais são potenciais imunógenos e alvos de vacinas. No entanto, até onde sabemos, a imunogenicidade e o potencial protetor das vacinas de DNA sintético na codificação das proteínas S do SARS-CoV-2 e outras proteínas estruturais ainda não foram relatados sistematicamente. Quatro vacinas de DNA que expressam as proteínas SARS-CoV-2 S, N, E e M l foram avaliadas quanto à sua imunogenicidade e eficácia protetora em camundongos para explorar os efeitos imunológicos do S em combinação com outras proteínas estruturais.

2. Materiais e métodos

2.1. Células

Células Huh7.5 e células 293T de rim embrionário humano foram cultivadas a 37 ◦C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2 durante todo o estudo. As células foram cultivadas em meio DMEM (HyClone, Logan, UT, EUA), suplementado com 10% de FBS (GEMINI Co., Xangai, China) e 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, Nova York, NY, EUA). Todas as linhas celulares foram confirmadas como negativas para contaminação por micoplasma.

2.2. Construção de vacinas de DNA que codificam SARS-CoV-2 S/N/E/M

O gene codificador da proteína SARS-CoV-2 S/N, contendo uma sequência Kozak N-terminal (GCCACC) seguida por um códon de iniciação (ATG), foi sintetizado usando um códon otimizado para mamíferos (GenScript Co., Nanjing , China). Foi então clonado no vetor de expressão pcDNA3.1 (+) via digestão EcoRI e XbaI e denominado pS/pN (vacinas de DNA) (Figura 1A). A proteína pE/PM foi construída e identificada conforme descrito anteriormente [15]. As vacinas foram preparadas utilizando kits Maxiprep isentos de endotoxinas (Qiagen, Pequim, China) e as sequências foram confirmadas utilizando sequenciação de ADN Sanger. A expressão da proteína S/N foi confirmada utilizando western blotting e anticorpos anti-S (Sino Biological, Pequim, China)/anti-N diluídos a 1:1000. Esses experimentos foram conduzidos conforme descrito anteriormente [15,18].

Figura 1. Projeto e expressão de construções de vacinas de proteína SARS-CoV{3}} S/N baseadas em DNA recombinante. (A) Diagrama esquemático das vacinas baseadas em DNA recombinante que codificam proteínas de pico (PS), nucleocapsídeo (pN), envelope (pE) e/ou membrana (PM) do SARS-CoV-2. (B) A expressão da proteína alvo em vacinas de DNA foi validada através da análise de western blot de células 293T transfectadas com os plasmídeos pS/pN/pE/pM.

2.3. Imunização e Desafio

Camundongos BALB/c fêmeas (Charles River Laboratories, França) com 6 semanas de idade foram alojados no Instituto Nacional de Saúde Ocupacional e Controle de Intoxicações em um ambiente de 21 ◦C e umidade controlada com ciclos de 12 horas de luz/escuridão. Enquanto isso, comida e água foram fornecidas ad libitum, e todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentos Animais do Centro Chinês de Controle e Prevenção de Doenças (China CDC). A pesquisa respeitou as normas éticas pertinentes.

Os camundongos foram divididos aleatoriamente em cinco grupos e imunizados apenas com pS/pN ou co-imunizados com pS + pN ou pS + pE + PM nos dias 0, 21 e 42 via injeção intramuscular mais eletroporação (35 mg/50 mL) (Figura 2) [19,20]. Resumidamente, as vacinas de DNA foram injetadas no músculo tibial anterior (TA) e imediatamente pulsadas com eletricidade usando um eletrodo de matriz de duas agulhas com 5 mm de distância (ECM830; BTX) com agulhas. Os soros dos camundongos foram coletados para análise da resposta imune humoral e os baços dos camundongos foram processados ​​para medir a resposta imune celular (Figura 2).

Figura 2. Esquema da imunização e do desafio SARS-CoV-2. Período de vacinação, desafio e amostragem de sangue/tecido. Camundongos BALB/C foram divididos aleatoriamente em grupos.

Experimentos de desafio SARS-CoV-2 foram conduzidos conforme descrito anteriormente [15,21]. Resumidamente, os camundongos foram anestesiados e depois transduzidos por via intranasal com 2,5 × 108 PFU de Ad5-hACE2 em um volume total de 45 µL. Cinco dias após a transdução, os camundongos foram anestesiados e depois desafiados por via intranasal com 1 × 105 TCID50 de SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC HB-02/2019) em um volume total de 50 µL de solução salina amortecedor. Todo o trabalho com SARS-CoV{20}} vivo em modelos de camundongos foi realizado em laboratórios de Nível de Biossegurança Animal 3 (ABSL-3).

2.4. Ensaio de imunoabsorção enzimática

Os ensaios imunoenzimáticos (ELISA) foram realizados conforme descrito anteriormente [15]. Resumidamente, proteínas S (adquiridas da Sino Biological)/N (um presente de Song) diluídas em tampão carbonato (0,1 M, pH 9,6) foram revestidas em placas EIA/RIA de 96-poços (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) durante a noite a 4 ◦C. As placas foram bloqueadas com 200 µL de soro de cabra a 10% em PBS a 37 ◦C por 2 h, seguido de lavagem cinco vezes com PBST. Em seguida, amostras de soro diluídas em série em soro de cabra a 2% em PBS foram adicionadas e incubadas por 2 horas a 37 ◦C, seguidas de cinco lavagens com PBST. Ab IgG de cabra anti-camundongo conjugado com HRP (1:5000) foi adicionado a 37 ◦C por 1 h. Um total de 100 µL de substrato TMB foi adicionado a cada poço e extinto com 50 µL de H2SO4 2M. A absorvância foi lida a um comprimento de onda de 450 nm utilizando SPECTR Ostar Nano (BIO-GENE, Hong Kong, China).

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2.5. Experimentos de infecção e neutralização por pseudovírus

O ensaio de neutralização de pseudovírus foi realizado conforme descrito anteriormente [21,22]. Um plasmídeo que expressa a proteína S do vírus ancestral foi previamente construído [22]. O gene da proteína spike SARS-CoV-2 variante Omicron (GISAID: EPI_ISL_6590782.2) foi sintetizado (um presente da Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, China) usando um códon otimizado para mamíferos e clonado no vetor pcDNA3.1, conforme descrito anteriormente [22]. Resumidamente, os plasmídeos que expressam um repórter de luciferase e os plasmídeos que expressam a proteína S foram co-transfectados em células HEK 293T utilizando o reagente de transfecção de ADN X-treme GENE HP. A cultura celular foi renovada 6 horas após a transfecção, e o sobrenadante contendo pseudovírus foi colhido após 48 horas e armazenado a -70 ◦C. No ensaio de neutralização de pseudovírus, uma mistura igual de soro-vírus foi então incubada em 37 volumes do sobrenadante contendo pseudovírus e foi então adicionada ao soro diluído. ◦C por 1 hora. O meio de cultura de células Huh7.5 foi então substituído por 100 µL da mistura soro-vírus e incubado a 37 ◦C por 12 horas. Células cultivadas apenas com pseudovírus SARS-CoV-2 foram executadas em paralelo. Os meios foram então substituídos por DMEM (2% FBS) e a incubação foi incubada a 37 ◦C por 48 horas. Em seguida, o sinal da luciferase foi medido utilizando o kit de luciferase Bright-Glo firefly (Promega).

2.6. Ensaio de Neutralização SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC-HB-02/2019) foi usado neste experimento. Resumidamente, os soros foram diluídos duas vezes a partir de uma diluição inicial de 1:10, misturados com um volume igual (10–15 pfu/poço) de SARS-CoV{10}} vivo e incubados por 1 h a 37 ◦C, após o que foram adicionadas às células Vero semeadas. Após incubação a 37 ◦C por 48 horas, foi observado efeito citopático (CPE), e 100 µL do sobrenadante da cultura foram colhidos para extração de ácido nucleico e PCR de transcrição reversa de fluorescência em tempo real (RT-PCR). A dose mediana de neutralização (ND50) foi calculada usando o método Reed-Munch [15].

2.7. Ensaio IFN-ELISpot

Os pools de peptídeos abrangendo toda a proteína S/N/E/M como 15-mers consecutivos sobrepostos por 10 aminoácidos foram sintetizados pela Scilight Biotechnology, LLC. Aproximadamente 2,5 mg de cada peptídeo purificado no conjunto de peptídeos estavam presentes por frasco. O experimento foi conduzido conforme descrito anteriormente [18]. Resumidamente, 96-placas de poços (BD ELISPOT Set, EUA) foram revestidas com Ab de captura anti-IFN e incubadas durante a noite a 4 ◦C. As placas foram bloqueadas com meio de cultura completo após três lavagens. Os esplenócitos foram colhidos após os ratos terem sido eutanasiados nos dias 35 e 120. Suspensões unicelulares frescas de cada grupo foram plaqueadas a 5 x 106 por poço e foram adicionados péptidos. As placas foram então incubadas a 37 ◦C em 5% de CO2 por 22 horas e detectadas usando um leitor de placas ELISpot (Biosys, So. Pasadena, CA, EUA). Uma unidade formadora de manchas (SFU) representa um IFN- secretor de células T.

2.8. Avaliação da proteção em ratos pós-SARS-CoV-2 desafio

Os experimentos foram conduzidos conforme descrito anteriormente [15,21]. Resumidamente, os pulmões foram colhidos após a eutanásia dos ratos. Metade dos tecidos foi utilizada para extração de ácido nucleico, RT-PCR de fluorescência em tempo real e TCID50. A outra metade foi enviada para a Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Agrícola da China para avaliação patológica.

2.9. Análise Estatística

Testes t não pareados, testes ANOVA bidirecionais e teste de comparações múltiplas de Dunnett foram realizados usando GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software LLC). Valores de p < 0.05 foram considerados estatisticamente significativos (* p < 0.05; ** p < 0.01; * ** p < 0,001; **** p < 0,0001).

3. Resultados

3.1. Caracterização de Vacinas de DNA

Os níveis de proteína E e M foram detectados usando western blotting. Medimos a expressão das proteínas S/N/E/M codificadas do SARS-CoV-2 em células T HEK-293transfectadas com plasmídeos pS/pN/pE/pM por meio de análise de western blot, usando anti Anticorpos -S/anti-N e um anticorpo anti-6 x His, nos lisados ​​celulares. As bandas aproximaram-se do peso molecular previsto das proteínas S (140–142 kDa), N (45 kDa), E (10 kDa) e M (22–25 kDa) (Figura 1B).

3.2. Produção robusta e sustentada de anti-S e/ou anti-N IgG induzida por pS e/ou pN DNA

Vacinas O soro foi coletado de camundongos BALB/c aos 35, 56, 96 e 120 dias (Figura 2). Os níveis de IgG anti S/anti-N foram detectados usando ELISA. A magnitude da resposta de IgG específica para S ou N induzida por pS ou pN foi aumentada no soro após o primeiro e segundo reforços. Os títulos de IgG anti-S e anti-N foram maiores no grupo pS + pN do que nos outros grupos; no entanto, a diferença não foi estatisticamente significativa (Figura 3A, B). Não foram detectadas respostas robustas de anticorpos específicos da proteína E/M, o que é consistente com os resultados de um estudo anterior (dados não mostrados) [15].

Figura 3. Respostas de células B ao SARS-CoV-2 em camundongos BALB/c. (A) Títulos finais de ligação de IgG sérica para as proteínas SARS-CoV-2 S (A) e N (B). (C) Os títulos de neutralização foram determinados com base em um sistema de vírus pseudotipado SARS-CoV-2. (D) Os títulos de neutralização anti-SARS-CoV-2 foram determinados usando um vírus SARS-CoV-2. (E) Ensaio de neutralização baseado em um sistema de vírus pseudotipado SARS-CoV-2 Omicron. As razões de inibição para os soros dos grupos mock (azul), pS (vermelho), pS + pN (verde), pS + pE + pM (rosa) e pN (laranja) são mostradas. As barras de erro representam o SEM, e os valores de p foram calculados usando uma ANOVA bidirecional e análise post hoc de Sidak, onde * p < 0,05

3.3. Altos níveis de anticorpos neutralizantes induzidos por co-imunização com vacinas pS e pN

Os títulos neutralizantes de amostras de soro diluídas em série foram determinados usando o vírus SARS-CoV-2 pseudotipado. Os níveis mais elevados de anticorpos neutralizantes (nAbs) foram observados no grupo pS + pN, com os títulos médios geométricos recíprocos de EC50 atingindo 2.988 (no dia 35) e 3.578 (no dia 56) (Figura 3C). Resultados semelhantes foram observados usando o ensaio de microneutralização de vírus vivo (MN), em que os níveis de nAbs no grupo pS + pN foram maiores do que aqueles no grupo S nos dias 56 e 96 (p <00,05; Figura 3D). Além disso, os níveis de nAbs no grupo pS + pN no dia 56 (segundo reforço) foram significativamente superiores aos do dia 35 (p <0,05; Figura 3D).

A atividade neutralizante de cada regime de vacina contra a variante SARS-CoV-2 Omicron foi determinada posteriormente usando a plataforma pseudotipada e amostras de soro. O perfil de neutralização contra o vírus Omicron nos dias 35 e 56 foi semelhante ao contra o vírus ancestral (Figura 3E), sugerindo que o tratamento PS + pN tinha potência neutralizante cruzada.

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3.4. Respostas de células T induzidas por vacinação de DNA

Conforme descrito anteriormente, as respostas das células T contra os antígenos SARS-CoV-2 S/N/E/M foram estimadas usando IFN-ELISpot, conforme descrito anteriormente [15]. Como esperado, ambos os regimes PS + pN e pS + pE + pM induziram níveis significativamente mais elevados de células T IFN + específicas para a proteína S no dia 120 do que no dia 35 (p <{18}}. 05; Figura 4A). Além disso, o número de células T IFN + específicas para a proteína N no dia 120 (segundo reforço) foi significativamente maior do que no dia 35 no grupo pS + pN (p <0,05; Figura 4B). Finalmente, o número de células T IFN + específicas para a proteína M no dia 120 (segundo reforço) foi significativamente maior do que no dia 35 em ambos os grupos (p <0,05; Figura 4D).

Figura 4. Respostas de células T às proteínas estruturais individuais do SARS-CoV-2 em camundongos BALB/c. (A) As respostas das células T foram medidas usando IFN-ELISpot em esplenócitos estimulados por 20 h com pools de peptídeos sobrepostos abrangendo o SARS-CoV-2 S, (B) N, (C) E, e (D) proteínas M. As barras representam a média ± DP. As análises estatísticas foram realizadas usando ANOVA de dois fatores e teste post hoc de Sidak, onde * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,01 e **** p < 0,0001.

3.5. Proteção Sinérgica Induzida por Co-Imunização com pS/pN ou pS/pE/pM

Em seguida, avaliamos a eficácia protetora de vacinas de DNA usando camundongos hACE2 imunizados pós-desafio com o vírus ancestral SARS-CoV-2. Após o desafio, os ratos do grupo simulado exibiram perda de peso gradual. Em contraste, os ratos imunizados com pS ou pS+ apresentaram ligeira perda de peso imediatamente após a infecção, seguida de recuperação (Figura 5A). Nenhum vírus vivo foi detectado nos camundongos vacinados com pS, pS + pN ou pS + pE + pM. Além disso, a vacinação pS + pN reduziu significativamente os números de cópias de RNA viral em comparação com aqueles obtidos apenas com a vacinação pS (p=0 0,0228; Figura 5B). Além disso, a histopatologia pulmonar demonstrou que os camundongos dos grupos mock e pN apresentaram manchas focais de inflamação, invaginação pleural, colapso alveolar, altos níveis de infiltração de células inflamatórias e áreas hemorrágicas. Em comparação, os camundongos tratados com pS + pN ou pS + pE + pM exibiram alterações histopatológicas mais leves e pontuações INHAND mais baixas pós-desafio do que o outro grupo (Figura 5C).

Figura 5. Eficácia protetora da imunização após o desafio com vírus vivo SARS-CoV-2. (A) Os ratos foram pesados ​​diariamente (média ± erro padrão da média (SEM), n=4) durante três dias após o desafio. (B) Título infeccioso de SARS-CoV-2 em homogeneizados de pulmão no terceiro dia pós-desafio, conforme determinado por meio do ensaio TCID5{{10}} e do número de cópias de RNA. Diferenças estatisticamente significativas entre os grupos foram determinadas usando uma ANOVA unidirecional seguida pela correção de comparação múltipla de Dunnett (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, e **** p < 0,0001). (C) Análise histopatológica pulmonar utilizando coloração H&E.

4. Discussão

Neste estudo, a co-imunização com duas vacinas de DNA que expressam as proteínas S e N induziu altos níveis de nAbs e foi altamente eficaz na redução da carga viral do SARS-CoV-2 em camundongos. As vacinas de DNA que expressam a proteína S induziram níveis aumentados de imunidade celular específica da proteína S após três imunizações quando os camundongos foram co-imunizados com proteínas N/E e M e aliviaram as alterações histopatológicas pós-desafio. Até onde sabemos, este é o primeiro relatório que revela o aumento sinérgico da imunidade e da proteção em camundongos usando uma vacina de DNA que codifica a proteína S quando são co-imunizados com vacinas de DNA que codificam outras proteínas estruturais do SARS-CoV{{8 }}.

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Epítopos de células B imunodominantes em regiões de antígeno N foram observados em vários estudos. As vacinas baseadas em N geralmente não podem induzir nAbs, provavelmente porque a proteína N não é exibida na superfície viral. Notavelmente, a co-imunização com as proteínas S e N induziu níveis mais elevados de nAbs contra o vírus ancestral e Omicron SARS-CoV-2 do que os outros grupos. O aumento das respostas de nAb está associado a uma melhor eliminação viral e eficácia protetora. Nossos resultados demonstraram que o tratamento pS + pN foi mais eficaz do que o tratamento pS sozinho na redução da carga viral do SARS-CoV-2 pós-desafio. Um estudo anterior relatou que hamsters imunizados com uma vacina que co-expressa as proteínas M e N foram protegidos contra grave perda de peso e patologia pulmonar e tiveram títulos virais significativamente reduzidos na orofaringe e nos pulmões após desafio com SARS-CoV-2, o que é consistente com nossos resultados [23]. Infelizmente, a redução nos títulos virais não pode ser atribuída especificamente à proteína M ou N, e os níveis de nAb não foram avaliados neste estudo. Um estudo de vacina de mRNA SARS-CoV-2 relatou que a coimunização S + N induziu uma resposta aumentada de células T CD8+ específicas de S e atividade de anticorpos neutralizantes, proporcionando melhor proteção nos pulmões contra o Delta variante em comparação com S sozinho, o que é consistente com os resultados deste estudo [24]. Outro estudo relatou que a proteína N do coronavírus da gastroenterite transmissível promoveu a síntese de anticorpos neutralizantes quando células TGEV-IMMUNE suínas foram estimuladas com uma combinação de proteínas S e N in vitro, e esse efeito pode ser explicado pela resposta dos linfócitos T auxiliares ao a proteína N [25].

Epítopos de células T CD{0}}/CD8+ imunodominantes em regiões de antígeno N foram identificados anteriormente. Vários estudos relataram que vacinas baseadas na proteína SARS-CoV-2 N induzem efetivamente respostas imunes celulares. O grupo S + N apresentou níveis aumentados de imunidade celular específica da proteína S após três imunizações. Um estudo de vacina de mRNA SARS-CoV-2 relatou que S + N combinatório induziu uma resposta aumentada de células T CD8+ específicas de S em comparação com S sozinho, o que é consistente com nossos resultados [24]. Outro estudo relatou que as respostas das células T aos antígenos S e N após a vacinação primária com antígeno duplo hAd5 S + N isoladamente foram equivalentes àquelas de pacientes previamente infectados por SARS-CoV-2- e modelos de predição in silico de células T a ligação do epítopo HLA sugeriu que as respostas das células T à vacina hAd5 S + N manterão a sua eficácia contra a variante B.1.351. Além disso, o plasma de pacientes previamente infectados-2-com SARS-CoV mostrou uma maior afinidade de ligação às células que expressam a construção de antígeno duplo S-Fusion + N-ETSD do que ao hAd5 S-Fusion sozinho, sugerindo ainda que a imunogenicidade do A vacina de antígeno duplo S + N é melhor do que a vacina de antígeno único S [26].

O vírus vivo não foi detectado nos pulmões e a perda de peso pós-desafio foi mitigada nos grupos pS, pS + pN e pS + pE + pM, enquanto o tratamento com pN não reduziu efetivamente o título do vírus. Estas descobertas enfatizam a indispensabilidade e eficácia da proteína S como alvo da vacina. Notavelmente, a co-imunização com pS e pN teve melhores efeitos do que pS ou pN na depuração viral. O grupo pS + pE + pM indicou menos alterações histopatológicas nos pulmões, o que é consistente com os resultados do nosso estudo anterior [15]. O grupo S + N apresentou baixas cópias de RNA viral no pulmão, perda de peso reduzida e um tempo de recuperação rápido após o desafio de SARS-CoV-2 em comparação com o grupo imunizado apenas com S/N, o que foi consistente com o resultados deste estudo. No entanto, nenhum dos grupos detectou os títulos de anticorpos neutralizantes, o que pode ser explicado por diferenças na variedade da vacina e nos animais experimentais [26]. Um estudo de vacina de vetor de adenovírus SARS-CoV-2 relatou que a vacina S só forneceu proteção cerebral aguda quando co-imunizada com uma vacina N [27]. Outro estudo desenvolveu vacinas Tri: ChAd, Bi: ChAd e Mono: ChAd expressando as proteínas S1/N/RdRp, N/RdRp e S1, respectivamente, e as testou em um modelo animal B.1.351. Patologia macroscópica extensa foi observada nos pulmões Mono: ChAdlungs, enquanto os pulmões Bi: ChAd e Tri: ChAd pareciam quase livres desta patologia [28].

Além disso, os animais não vacinados apresentaram cargas virais pulmonares elevadas, enquanto o tratamento com Tri: ChAd reduziu significativamente as cargas virais em 3,5 logs. Em comparação, ambas as vacinas Bi:ChAd e Mono:ChAd reduziram apenas moderadamente a carga viral. Estes resultados sugerem que o efeito protetor da vacina de antígeno duplo S/N contra variantes pode ser melhor do que o da vacina de antígeno único S, o que é consistente com nossos resultados [28]. Alguns estudos relataram que camundongos imunizados com proteína N desenvolvem inflamação pulmonar grave após infecção por SARS-CoV [29–31]. Estudos anteriores também relataram que a imunização com uma vacina de vetor de adenovírus que expressa a proteína N do vírus da hepatite de camundongo protege os camundongos contra infecção letal, o que demonstra que a proteína N poderia gerar um efeito protetor [32]. Além disso, o grupo imunizado com a vacina CRT/N DNA teve um título viral significativamente reduzido após o desafio, com um vírus vaccinia expressando a proteína SARS-CoV N [33].

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Um estudo sobre a proteína S demonstrou que a vacina combinada de DNA/proteína induziu melhor imunidade humoral e celular do que a vacina de DNA/proteína sozinha [8]. As vacinas direcionadas apenas à proteína S demonstraram eficácia reduzida na proteção contra COVID leve a moderada-19 causada por variantes emergentes. Os papéis das proteínas estruturais conservadas do SARS-CoV-2, incluindo as proteínas N/E/M, são dignos de atenção no projeto e nas aplicações de vacinas, uma vez que as respostas das células T induzidas pela vacina contra epítopos conservados geralmente não são afetadas por mutações . Um estudo relatou que pacientes recuperados de SARS (n=23) ainda possuíam células T de memória de longa duração reativas à proteína N do SARS-CoV 17 anos após o surto de 2003, que apresentava reatividade cruzada robusta ao SARS CoV{ {15}} Proteína N, validando ainda mais o uso da proteína N como alvo de vacina de proteção cruzada [34]. Este estudo demonstrou que a coimunização pS/pN foi associada a respostas mais altas de nAb, melhor eliminação viral e respostas imunológicas celulares melhoradas e pode fornecer melhor proteção após o desafio SARS-CoV-2 em comparação com pS sozinho. Além disso, foi demonstrado que variantes do SARS-CoV-2 infectam muitas espécies animais, e a transmissão de humano para animal foi observada em alguns animais selvagens e animais de estimação [7]. Portanto, a vacina veterinária contra SARS-CoV-2 precisa de mais atenção. Além disso, a nanotecnologia pode ser uma ferramenta poderosa na otimização de vacinas e merece mais atenção [2].

Este estudo tem várias limitações. Primeiro, observamos apenas a estratégia de vacina de DNA em camundongos BALB/c, e estudos futuros deverão avaliar os efeitos imunogênicos desses regimes vacinais em outros modelos animais. Em segundo lugar, são necessárias pesquisas adicionais para compreender completamente os mecanismos moleculares subjacentes às respostas aumentadas das células T CD8 específicas para nAb e S induzidas pela co-imunização usando as proteínas S e N e para aproveitar esse conhecimento para otimizar a COVID-19 projeto de vacina. Finalmente, a função dos anticorpos específicos da proteína N merece um estudo mais aprofundado.

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Concluindo, este estudo avaliou o potencial imunoprotetor da coimunização com as proteínas S, N, E e M do SARS-CoV-2. Várias vacinas que visam apenas a proteína S têm um efeito protector reduzido sobre as estirpes variantes emergentes. Nossos resultados estabelecerão as bases para o desenvolvimento de uma vacina contra COVID{5}} de reação cruzada para controlar variantes atuais e emergentes do SARS-CoV-2 e prevenir possíveis pandemias de coronavírus.

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