Abstrato

Introdução: O rim é um órgão altamente complexo com múltiplas funções essenciais à saúde. A doença renal ocorre quando os rins estão danificados e não funcionam adequadamente. A análise de célula única é uma técnica poderosa que fornece informações sem precedentes sobre os tipos de células renais normais e anormais e mudará nossa compreensão dos mecanismos das doenças renais comuns.

Resumo: Nossa compreensão da patogênese da doença renal é limitada pela caracterização molecular incompleta dos tipos de células responsáveis ​​pela função renal. A aplicação da tecnologia de célula única na pesquisa renal revelou heterogeneidade celular, perfis de expressão gênica e dinâmica molecular no desenvolvimento e progressão da doença renal. A análise de células únicas de tecidos organoides e aloenxertos renais forneceu novos insights sobre organogênese renal, mecanismos de doenças e resultados terapêuticos. No geral, uma melhor compreensão da heterogeneidade das células renais e da dinâmica molecular da doença renal melhorará a precisão do diagnóstico e ajudará a identificar novas estratégias terapêuticas em nefrologia.

Mensagem principal: Neste artigo de revisão, resumimos a pesquisa recente de célula única sobre doença renal e discutimos o impacto da tecnologia de célula única na pesquisa renal básica e clínica.

Palavras-chave

Tecnologia de célula única; Doença renal; Célula imune; Organoide renal; Aloenxerto;Benefícios Cistanche.

Introdução

Os rins são dois órgãos em forma de feijão responsáveis ​​por filtrar resíduos, excesso de água e outras impurezas no sangue e produzir urina. Os rins também regulam o pH, os níveis de sal e potássio e a pressão sanguínea; controlar a produção de glóbulos vermelhos; e ativar uma forma de vitamina D que ajuda o corpo a absorver o cálcio. até o momento, cerca de 850 milhões de pessoas em todo o mundo sofrem de doença renal, incluindo doença renal crônica (DRC), lesão renal aguda, insuficiência renal e muitas outras condições. A doença renal ocorre quando os rins estão danificados e incapazes de realizar suas funções. Os danos podem ser causados ​​por diabetes, pressão alta e uma variedade de outras condições crônicas (de longo prazo). A doença renal pode levar a outros problemas de saúde, incluindo osteoporose, danos nos nervos, desnutrição e doenças cardíacas. As estratégias atuais de tratamento para pacientes continuam sendo transplantes renais ou diálise, que são caras.

Uma variedade de células no rim, incluindo células epiteliais, tilacoides, endoteliais e neuronais, bem como redes de células imunes, interagem para manter a função renal normal. Uma compreensão mais profunda da heterogeneidade dos rins saudáveis ​​e dos processos subjacentes à doença renal refinará a definição fenotípica molecular e histopatológica do rim e apoiará o desenvolvimento de novas classificações de doenças. A tecnologia de célula única é potencialmente vantajosa na identificação de subtipos celulares, estados e alterações de frequência durante o início e a progressão da doença renal. Nos últimos anos, com o rápido desenvolvimento da tecnologia de sequenciamento de RNA de célula única de alto rendimento (scRNA-seq), um atlas celular abrangente do rim normal foi construído para pesquisa em medicina renal de precisão. O Kidney Precision Medicine Project (KPMP) foi desenvolvido globalmente para obter biópsias renais humanas, criar atlas de tecido renal, definir subpopulações de doenças e, finalmente, identificar células-chave, caminhos e alvos para novas terapias. Com base no conjunto de dados transcricionais de célula única associada ao rim, os pesquisadores também analisaram os perfis de expressão gênica de ACE2, TMPRSS2 e SLC6A19 em subtipos de células renais, o que é crítico para entender a patogênese do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave. vamos nos concentrar em (1) o desenvolvimento e aplicação da tecnologia de célula única, (2) o uso de scRNA-seq para estudar o desenvolvimento e a progressão de doenças renais, (3) o mapeamento molecular de células imunes em doenças renais, ( 4) a aplicação de scRNA-seq em órgãos semelhantes a rins e (5) o uso de scRNA-seq para estudar aloenxertos renais em profundidade (Figura 1).

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Desenvolvimento e aplicação de tecnologia transcriptômica de célula única

Uma única célula é a unidade básica da vida. As técnicas de análise de célula única revolucionaram nossa capacidade de identificar a composição celular, acompanhar a dinâmica molecular e revelar mecanismos patológicos. A análise inicial da expressão gênica global de célula única foi realizada usando técnicas de microarray e qPCR. Tietjen et ai. usaram microarranjos unicelulares para monitorar os perfis de expressão molecular de neurônios individuais e células progenitoras e para definir vias de sinalização em diferentes estágios de desenvolvimento. Além disso, a análise de expressão de célula única identificou vários subtipos de células em desenvolvimento que possuem novos genes pancreáticos, fornecendo novos insights sobre o desenvolvimento pancreático. Esta classe desenvolveu técnicas de qPCR de célula única e as aplicou ao estudo dos principais genes reguladores no desenvolvimento de blastocistos de camundongos e na diferenciação de linhagens hematopoiéticas.

Com o advento das tecnologias de sequenciamento de próxima geração, o scRNA-seq mostrou claras vantagens em distinguir diferentes isoformas, expressão alélica e novos transcritos em células únicas a um custo menor. em 2009, Tang et al. relataram o primeiro sequenciamento completo do transcriptoma de mRNA de célula única, demonstrando a complexidade das variantes transcricionais em oócitos ou oócitos de camundongos únicos. O smart-seq foi 2012 foi desenvolvido para detectar transcrições completas em células únicas e, ao aplicá-lo a células raras, os pesquisadores identificaram biomarcadores candidatos para células tumorais circulantes de melanoma. Um ano depois, foi introduzido o Smart-seq2 com transcrição reversa, cobertura de leitura, viés e precisão aprimoradas. desenvolvimentos recentes no Smart-seq3 melhoraram muito sua sensibilidade na detecção de milhares de transcritos de célula única em resolução alélica e isoforma. Ao contrário dos métodos de amplificação baseados em PCR, o CEL-seq captura transcriptomas de célula única eficientes por amplificação linear múltipla. Um estudo usando CEL-seq para estudar o desenvolvimento embrionário inicial do Cryptobacterium hidradenoma revelou seus resultados reprodutíveis e sensíveis na resolução de célula única. A primeira plataforma automatizada do scRNA-seq é o Fluidigm C1, que usa um sistema microfluídico para capturar células individuais em 96 ou 384 câmaras, seguidas de lise celular, transcrição reversa e amplificação por PCR.

Desde 2015, a pesquisa de célula única entrou totalmente na era de alto rendimento, baixo custo e automação com a disponibilidade contínua de Drop-seq, inDrop, 10× Genomics, Seq-well, Microwell-seq e SPLiTseq. Drop-seq e inDrop separam células individuais em gotículas do tamanho de nanolitros e as misturam com um código de barras exclusivo para rotular cada célula. Por outro lado, Cyto-seq, Seq-well e Microwell-seq permitem o sequenciamento de mRNA de célula única de alto rendimento, capturando uma célula e um cordão de código de barras em um micropoço. Nosso grupo construiu o primeiro atlas de células de camundongos e paisagem de células humanas no nível de célula única usando Microwell-seq. Mais recentemente, métodos mais simples e de maior rendimento são chamados de SPLiT-seq e sci-RNA-seq para scRNA-seq. Esses métodos usam a própria célula ou núcleo como a câmara de reação para células marcadas com código de barras por meio de várias rodadas da divisão do pool. Todas as células são então submetidas a amplificação e sequenciação de cDNA PCR. Cao et al. usou sci-RNA-seq3 para analisar os transcriptomas de aproximadamente 2 milhões de células organogênicas de camundongos e 4 milhões de células fetais humanas, fornecendo uma visão global dos processos de desenvolvimento de mamíferos. Outras tecnologias unicelulares abrangendo análises genômicas, proteômicas e epigenômicas também floresceram; no entanto, eles estão além do escopo deste artigo.

Ocorrência e Progressão da Doença Renal

O rim pode ser afetado por muitas doenças comuns e graves, incluindo lesão renal aguda, glomerulonefrite, infecções ascendentes (pielonefrite) e câncer. No geral, nossa compreensão da patogênese da doença renal é limitada por uma caracterização molecular incompleta dos tipos de células responsáveis ​​por funções específicas de órgãos. Para preencher essa lacuna de conhecimento, nosso grupo e Park et al. construiu um atlas transcricional do rim de camundongo saudável usando scRNA-seq. Os principais subtipos de células epiteliais da unidade renal incluíam células do pedúnculo, células epiteliais tubulares proximais, anel de Henle, túbulos distais e células do ducto coletor. O estudo identificou um novo tipo de célula migratória para coletar populações de células ductais, confirmando achados anteriores de interconversão entre células intercaladas e células principais em estudos de scRNA-seq. Além disso, Ransick et al. analisaram rins adultos masculinos e femininos e geraram um atlas anatômico de elementos renais de camundongos no nível de célula única. Nosso grupo também realizou análise Microwell-seq de tecido renal humano fetal e adulto. Além de células epiteliais, células endoteliais, células estromais e células imunes dentro do tecido, identificamos tipos de células somáticas do tipo s não descritos anteriormente no rim fetal e um novo tipo de célula migratória no rim adulto. O perfil molecular de célula única do sistema vascular renal revelou perfis de expressão especializados dos néfrons em construção e revelou a patogênese da doença renal. Além disso, todos os tipos de células glomerulares foram identificados a partir de camundongos saudáveis ​​e diferentes modelos de doenças por análise de agrupamento de transcriptoma de célula única, e novos genes relacionados à doença e vias regulatórias foram detectados em modelos de doenças, como a via Hippo ativada em podócitos após nefrotoxicidade imune ferida.

A fibrose renal é uma marca registrada da DRC e afeta mais de 10% da população mundial. Em um modelo de coexistência heterogênea de fibrose renal, Kramann et al. usaram scRNA-seq para confirmar que os monócitos contribuíram com uma pequena proporção de miofibroblastos, mas que a maioria dos miofibroblastos foi derivada de células mesenquimais. Posteriormente, Kuppe et al. [37] analisaram o transcriptoma de aproximadamente 135,000 células de túbulos proximais e não proximais e validaram ainda mais que diferentes isoformas de MSCs são os principais contribuintes para a fibrose renal humana. Além disso, em uma análise comparativa de monócitos renais saudáveis ​​e fibróticos, um gene específico de miofibroblasto, o homólogo nu de queratinócitos 2 (NKD2), foi identificado como um potencial alvo terapêutico para a fibrose renal humana. Com base em 402 biópsias renais, o fibrinogênio urinário foi previsto como um biomarcador não invasivo em pacientes com DRC.

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A nefropatia diabética (ND) é caracterizada por dano simultâneo aos glomérulos e ao interstício tubular. No entanto, relativamente pouco se sabe sobre como o status celular e a frequência mudam com o início da doença e a progressão da expressão gênica. Para elucidar mudanças na expressão gênica de células glomerulares em DN de camundongo, Fu et al. realizou análise scRNA-seq e identificou vários novos marcadores potenciais de células glomerulares, incluindo Magi2, Robo2, Ramp3 e Fabp4. Na nefropatia diabética (DKDs), a regulação das vias angiogênicas e migratórias é alterada nas células endoteliais, enquanto as vias reguladoras de tradução e proteínas estáveis ​​são altamente enriquecidas nas células tilacoides. No geral, as mudanças na dinâmica molecular das células endoteliais e tilacoides ajudarão a identificar importantes fatores fisiopatológicos que contribuem para a progressão da ND. Chung e outros. descreveu o transcriptoma unicelular de glomérulos em um modelo de camundongo de diabetes mellitus. A expressão gênica foi alterada em tilacoides e podócitos de camundongos ob/ob em comparação aos controles. Vias proliferativas foram induzidas em células tilacoides e vias relacionadas à morte celular foram induzidas em podócitos, consistentes com mudanças nas proporções do número de células. A análise abrangente dos conjuntos de dados DKD scRNA-seq publicados identificou 17 genes essenciais, enriquecendo nossa compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes à patogênese dos DKDs. Além disso, o sequenciamento imparcial de RNA de núcleo único (snRNA-seq) de amostras criopreservadas de rim diabético humano rendeu 23.980 transcriptomas de três amostras de controle e três DN iniciais. Os resultados mostraram alterações específicas do tipo celular na expressão gênica sugerindo aumento da secreção de potássio em DN humano. Um estudo anterior comparando scRNA-seq e snRNA-seq em rins de camundongos adultos mostrou que o último tinha uma capacidade de captura mais eficiente. Por exemplo, podócitos glomerulares, células tilacoides e células endoteliais foram capturadas por snRNA-seq em vez de scRNA-seq. A aplicação do snRNA-seq minimiza os pseudo-efeitos da digestão enzimática e pode ser realizada em amostras congeladas, o que deverá levar a uma aplicação mais ampla para acelerar o estudo de mecanismos patológicos em várias doenças renais.

Um transcriptoma celular preciso pode revelar a origem das células tumorais renais e as trajetórias transcricionais que suportam a transformação maligna. jovem e outros definiu os tipos de células renais humanas normais e cancerígenas a partir de um catálogo de 72.501 transcriptomas unicelulares. Ao identificar correlatos celulares normais específicos de células cancerígenas renais (RCCs), um estudo forneceu evidências para a hipótese de que as células tumorais de Wilms são células fetais aberrantes e que os RCCs podem se originar de um subtipo pouco conhecido de células tubulares proximais. Assim, o scRNA-seq fornece uma estratégia experimental escalável para caracterizar células cancerígenas renais humanas com resolução molecular celular quantitativa precisa.

Atlas Molecular de Células Imunes na Doença Renal

As células imunes são um componente fundamental dos tecidos humanos e desempenham um papel importante no metabolismo fisiológico e patológico. De fato, a capacidade do sistema imunológico de reconhecer sinais patogênicos ou perigosos ou células malignas é crucial. A aplicação da tecnologia unicelular ao estudo das células imunes renais tem o potencial de facilitar uma melhor compreensão do papel do sistema imune na patogênese de rins saudáveis ​​e doenças, bem como identificar novas estratégias terapêuticas. Esses esforços estão começando a mapear o complexo cenário imunológico dentro do rim e a revelar a relação entre as células imunes residentes no tecido e seus vizinhos mutuamente ativados.

Em 2018, a aplicação de scRNA-seq em tecido renal de camundongo forneceu um cenário abrangente de células imunes, incluindo macrófagos residentes, neutrófilos, linfócitos B e T e células NK. Um ano depois, foi estabelecido um estudo unicelular sem precedentes da organização espaço-temporal das células imunes renais humanas. Redes de células imunes mielóides e linfóides residentes em tecidos foram identificadas em rins fetais e adultos, e estudos identificaram programas de transcrição adquiridos pós-natal que promovem a defesa contra infecções. Além disso, o cross-talk entre células epiteliais renais maduras e células imunes foi previsto para recrutar macrófagos antibacterianos e neutrófilos para as regiões mais suscetíveis do rim. No geral, o panorama imunológico abrangente do rim contribui para o estudo dos mecanismos patogênicos e a identificação de alvos terapêuticos em doenças renais imunes e infecciosas.

A nefrite lúpica (NL) é uma doença autoimune potencialmente fatal para a qual as terapias atuais são ineficazes e muitas vezes tóxicas. Os processos moleculares e celulares que levam ao dano renal e a heterogeneidade da NL permanecem obscuros. scRNA-seq foi usado por Arazi et al. identificar 21 subpopulações específicas de doenças de células mielóides, T, natural killer e B em pacientes com NL. Da mesma forma, Der et al. aplicou scRNA-seq a tecidos de biópsia de rim e pele de pacientes com NL. Os escores de resposta do interferon tipo I de células epiteliais tubulares foram relatados como maiores em pacientes com NL do que em controles saudáveis. Além disso, as características inflamatórias e fibróticas das células tubulares foram associadas à ineficácia do tratamento. Na DKD, a análise scRNA-seq mostrou um número significativamente maior de células imunes nos glomérulos diabéticos do que nos controles. Esses estudos sugerem que os perfis de expressão gênica de células imunes na urina, pele e rim são altamente correlacionados, sugerindo que as biópsias de pele e urina podem ser uma fonte potencial de marcadores diagnósticos e prognósticos para doença renal.

Estudos recentes demonstraram o papel das células imunes em modelos de doença renal com resolução unicelular. Modelos de obstrução ureteral unilateral são amplamente utilizados para fibrose intersticial renal, onde macrófagos e células inflamatórias infiltram o interstício renal, levando a alterações marcantes na hemodinâmica e metabolismo renal. scRNA-seq tem sido usado em modelos reversíveis de obstrução ureteral unilateral para dissecar a paisagem de células mielóides durante a progressão e regressão da fibrose. Conway et ai. revelou heterogeneidade nas células mieloides, com mudanças dinâmicas nas proporções relativas das subpopulações, os monócitos são recrutados no início da lesão, os macrófagos Ccr2 mais se acumulam no final da lesão e um novo grupo de macrófagos Mmp12 mais desempenha um papel no processo de reparo. Na doença renal e no transplante, a lesão de isquemia-reperfusão (IRI) está associada à inflamação e ao recrutamento de leucócitos. modelos experimentais de IRI foram usados ​​para avaliar o papel funcional de 2 grupos de células linfóides inatas no rim, e os dados sugerem que essas células têm funções redundantes na lesão renal. Ao aplicar scRNA-seq a um modelo IRI de transplante renal, Kremann et al. descobriram que a infiltração subsequente de CXCR5 mais leucócitos resultou em níveis sistêmicos elevados de CXCL13. knRNA-seq também foi aplicado a um modelo de camundongo IRI por Kirita et al. caracterizar respostas celulares detalhadas após a lesão e identificar um estado celular pró-inflamatório e pró-fibrótico distinto do túbulo proximal. O ácido úrico, o produto final da oxidação do metabolismo das purinas, está intimamente associado à inflamação renal em vários modelos de doenças. Por exemplo, NLRP3 (NOD-, LRR- e domínio estrutural contendo pirina 3) detecta sinais de excesso de ácido úrico e vesículas inflamatórias são ativadas na nefropatia hiperuricêmica. No entanto, os mecanismos imunológicos específicos subjacentes à lesão renal induzida por hiperuricemia não são conhecidos. Espera-se que a construção de uma paisagem corporal inflamatória no nível de célula única em um modelo de lesão renal induzida por hiperuricemia seja realizada em um futuro próximo.

A infiltração imune existe dentro dos tumores renais e é influenciada pelo microambiente tumoral. Um estudo anterior mostrou que as populações de macrófagos infiltrantes tumorais expressam o fator de crescimento endotelial vascular A e estão envolvidas na complexa via de sinalização do VEGF no tecido RCC. O presente estudo demonstra que o scRNA-seq pode abordar a tumorigênese e identificar mecanismos fisiopatológicos putativos e redes de sinalização celular que podem servir como alvos para terapia medicamentosa. No geral, o estudo destaca os avanços no scRNAseq que fornecem informações sobre o sistema imunológico e as redes celulares que operam em rins saudáveis ​​e doentes.

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Aplicação de scRNA-seq a organoides renais

Além do estudo de tecidos renais doentes, os organoides renais tornaram-se uma ferramenta fundamental para o estudo da organogênese e dos mecanismos da doença e têm o potencial de acelerar o desenvolvimento de terapias como fonte de tecidos alternativos. Paralelamente, os avanços no scRNA-seq levaram a análises mais detalhadas de várias subpopulações celulares e alterações na expressão gênica em órgãos semelhantes a rins.

No geral, uma melhor compreensão do desenvolvimento embrionário renal no nível de célula única é necessária para orientar a maturação dos órgãos semelhantes aos rins. Estudos de transcriptômica de célula única do rim fetal humano identificaram 22 tipos de células e genes marcadores correspondentes.

A comparação de diferentes estágios de desenvolvimento mostra a continuidade da dinâmica molecular das células do pé. Outra análise de célula única foi realizada em rins fetais humanos e órgãos semelhantes a rins derivados de células-tronco embrionárias. A análise comparativa das trajetórias de desenvolvimento de uma única célula no rim revelou perfis de expressão gênica semelhantes in vivo e in vitro, exceto para podócitos em estágio avançado, sugerindo um processo de maturação incompleto de órgãos semelhantes a podócitos. Experimentos de transplante sugerem ainda que o tilacóide e o lúmen vascular podem ser otimizados usando modelos organoides. Um estudo recente usando células mesenquimais renais posteriores e células semelhantes a brotos ureterais para gerar organoides renais mostrou que o scRNA-seq melhorou a maturação do túbulo proximal e reduziu as populações de células fora do alvo. A análise scRNA-seq de organoides renais derivados de células-tronco pluripotentes humanas (PSC) foi realizada por Subramanian et al. e Wu et ai. Em comparação com conjuntos de dados de células únicas de rins fetais e adultos humanos, os diferentes órgãos semelhantes a rins mostraram tipos de células amplamente reprodutíveis, mas com diferentes proporções de células devido à presença de células fora do alvo. Além disso, a análise da rede de fatores de transcrição revelou vias de diferenciação de organoides renais, destacando o poder da tecnologia de célula única na caracterização e orientação da diferenciação de organoides.

Em conclusão, órgãos semelhantes a rins humanos são um recurso útil para modelos de doenças de mineração, mecanismos reguladores potenciais, triagem de drogas de alto rendimento e, finalmente, terapias regenerativas. Esses estudos destacam o uso potencial de scRNA-seq em sistemas de modelo renal para elucidar processos fisiológicos e patológicos in vivo e fornecer orientação para pesquisas futuras no diagnóstico e tratamento de doenças renais.

Informações sobre aloenxertos renais por scRNA-seq

O transplante renal alogênico é um dos tratamentos clínicos mais eficazes para a doença renal terminal. A tecnologia de célula única oferece a oportunidade de caracterizar com exatidão e precisão os tipos e status das células renais usando espécimes de biópsia humana após o transplante alogênico. O primeiro relatório publicado de espécimes de biópsia de transplante renal analisou 8.746 transcriptomas unicelulares e definiu respostas inflamatórias distintas. Os monócitos formaram o grupo CD16 plus não clássico e o grupo clássico CD16-; as células endoteliais apresentaram um estado de repouso e 2 estados de rejeição mediada por anticorpos. Esses achados contribuem para nosso melhor entendimento da rejeição imunológica no transplante renal. Em um estudo comparativo de monócitos renais de fontes receptoras e doadoras, os espécimes de biópsia renal mostraram expressão de gene transcricional significativamente diferente. Macrófagos ativados por inflamação e células T expressas citotoxicamente foram observados nos receptores. Da mesma forma, Liu et al. analisaram células de rejeição de transplante renal crônico e combinaram rins adultos saudáveis ​​no nível de célula única. A análise de agrupamento não supervisionada revelou que o aumento do número de células imunes e miofibroblastos no grupo de rejeição crônica do transplante renal pode contribuir para a rejeição renal e fibrose. Notavelmente, um estudo recente descreveu o primeiro atlas de célula única da urina de adultos e identificou SOX9 mais populações de células-tronco/progenitoras renais na urina. As células progenitoras proliferaram e se diferenciaram com sucesso in vivo, adquirindo algumas das propriedades das células tubulares e fornecendo um recurso potencialmente útil para uma futura terapia de transplante renal. No geral, a tecnologia scRNA-seq fornece informações novas e perspicazes sobre a rejeição do transplante renal humano, melhorando a precisão do diagnóstico e acelerando a adoção da interpretação da biópsia molecular.

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Conclusão

Na última década, o scRNA-seq tornou-se uma ferramenta indispensável para a análise da expressão gênica diferencial em todo o transcriptoma para estudar a biologia fisiológica e identificar anormalidades regulatórias moleculares na doença. Em contraste com os fenótipos discretos tradicionais, a caracterização molecular no nível de célula única pode fornecer um padrão sistemático para a caracterização dos fenótipos da doença renal. A aplicação da tecnologia de célula única em tecido renal saudável ou amostras clínicas de biópsia renal fornece um atlas molecular abrangente do rim e amplia nossa compreensão da nefrologia. O Renal Single Cell Atlas será parte integrante do trabalho internacional do Human Cell Atlas, que visa produzir um mapa de referência abrangente e sistemático do corpo humano. Em estudos futuros, espera-se que as análises de transcriptoma espacial e ultra-alto rendimento de célula única expandam nossa compreensão do rim. A integração de dados multi-omics irá melhorar ainda mais o diagnóstico personalizado e o tratamento de doenças renais.

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Mengmeng Jiang^a,b; Haide Chen^{b, c}; Guoji Guo^{a, b, c, d, e}

a: Laboratório Liangzhu, Centro Médico da Universidade de Zhejiang, Hangzhou, China;

b: Centro de Células Tronco e Medicina Regenerativa, Escola de Medicina da Universidade de Zhejiang, Hangzhou, China;

c: Laboratório Provincial de Zhejiang para Engenharia de Tecidos e Medicina Regenerativa, Dr. Li Dak Sum e Yip Yio Chin, Centro de Células-Tronco e Medicina Regenerativa, Hangzhou, China;

d: Centro de Transplante de Medula Óssea, Primeiro Hospital Afiliado, Escola de Medicina da Universidade de Zhejiang, Hangzhou, China;

e: Instituto de Hematologia, Universidade de Zhejiang, Hangzhou, China